劉 航

遼寧工業(yè)大學(xué)化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，錦州 121001

干旱是嚴(yán)重的自然災(zāi)害，是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的一個全球性問題也是制約我國農(nóng)產(chǎn)品提高產(chǎn)量的一個重要因素之一。持續(xù)的干旱脅迫會引發(fā)植物一系列生化和生理響應(yīng)，包括植株生長抑制、細(xì)胞氧化損傷及光合抑制，最終導(dǎo)致小麥生長發(fā)育受到影響［1-4］。葉綠素是高等植物光合作用主要組成成分，葉綠素合成受阻會嚴(yán)重影響植物生長發(fā)育。某種程度上來說，葉綠素含量的改變反映了植物的健康程度［5］。干旱脅迫會誘導(dǎo)植物脯氨酸積累。脯氨酸作為滲透脅迫保護(hù)劑參與植物抗旱，且緩解滲透脅迫對植物造成的損傷［6］。脅迫條件下，超氧化物歧化酶SOD 和過氧化物酶POD 可直接與活性氧ROS 反應(yīng)。細(xì)胞膜對各種逆境脅迫非常敏感，通常伴隨著MDA 含量的增加，這是一種細(xì)胞膜氧化損傷的典型特征。因此，MDA 含量可以作為干旱脅迫損傷的一個重要指標(biāo)［7］。隨著干旱脅迫相關(guān)基因的發(fā)現(xiàn)，越來越多的研究將目光集中在ABA 信號通路中。眾所周知，ABA 依賴性信號通路參與干旱脅迫響應(yīng)［8］。缺水條件下，一些由ABA 介導(dǎo)的脅迫響應(yīng)基因被誘導(dǎo)，例如如編碼滲透保護(hù)蛋白的基因、蛋白激酶等［9，10］。

褐藻膠寡糖(Alginate oligosaccharides，AOS)來源于降解的褐藻膠多糖，由β-D-甘露糖醛酸(ManA)和α-L-古洛糖醛酸(GulA)或二者雜合片段構(gòu)成。褐藻膠寡糖AOS 具有多種植物活性［11］。據(jù)報道，AOS 可以促進(jìn)植物根系生長［12-14］，提高植物產(chǎn)量［15］，緩解如高鹽、重金屬等非生物脅迫對植物造成的損傷［16，17］，但AOS 對植物抗旱能力影響的研究鮮有報道。

本文考察了褐藻膠寡糖AOS 對小麥生物量、次級代謝產(chǎn)物以及抗氧化酶活性的影響，且研究AOS對ABA 依賴性信號通路中抗旱相關(guān)基因，如LEA1、SnRK2 和NCED 表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 小麥植株培養(yǎng)

選用干旱敏感型小麥Xinong979 為供試材料。用75%乙醇浸種10 min 消毒后，再用去離子水浸種8 h。晝/夜循環(huán)12 h/12 h，25 ℃/20 ℃，相對濕度65%，光照強(qiáng)度為800 μmol/(m2·s)。選取生長狀態(tài)比較一致的1 周齡小麥，用聚乙二醇-6000(PEG-6000)模擬滲透，使PEG 終濃度達(dá)到20%。在各組處理24 h 后進(jìn)行取樣以及生理生化指標(biāo)的檢測。

1.2 試劑處理

設(shè)置4 個處理組:空白對照Control(葉面噴施去離子水)，脅迫處理組PEG(PEG-6000 灌根+葉面噴施去離子水)，寡糖處理組AOS(葉面噴施1，000 mg/L 褐藻膠寡糖溶液)，寡糖+脅迫處理組AOS+P(PEG-6000 灌根+葉面噴施1，000 mg/L 褐藻膠寡糖溶液)。

1.3 相對水含量

新鮮小麥苗稱取鮮重(FW)后，將葉片浸入到去離子水中飽和2 h，以獲得飽和重量(SW)，然后將這些葉片放入烘箱75oC 干燥24 h，以獲得干重(DW)。相對水含量(RWC(%))按照以下公式計算:

1.4 葉綠素含量

稱取新鮮的小麥葉片1 g，用10 mL 95%乙醇勻漿。勻漿后的上清液在665(A665)和649(A649)nm下分別檢測吸光值。葉綠素含量可以按照以下公式進(jìn)行計算:

1.5 脯氨酸含量

脯氨酸含量檢測按照Bates［18］方法。

1.6 MDA 含量

MDA 含量檢測按照Gao［19］方法。稱取新鮮的小麥葉片1 g，在100 mg/L 三氯乙酸中勻漿，離心后的上清液加入2 mL 硫代巴比妥酸(TBA)，沸水浴15 min 冷卻后冰浴。上清液在分別在532 nm、600 nm 和450 nm 波長下測定吸光值。

1.7 抗氧化酶活性

超氧化物歧化酶SOD 活力按照Giannopolitis［20］的方法。SOD 活性單位以抑制NBT 光化還原的50%為一個酶活性單位表示，單位U/mg FW。

過氧化物酶POD 活性按照Zhang 和Kirham［21］的方法。POD 活性單位以每g 植物鮮重每分鐘內(nèi)A470變化0.01 為一個酶活力單位，單位U/(g FW·min)。

1.8 RT-PCR 抗旱相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平檢測

小麥總RNA 提取、cDNA 合成以及RT-PCR 分別按照RNAiso Plus extraction solution 試劑盒(寶生物，大連)、Takara RNA PCR Kit (AMV)Ver.3.0 試劑盒(寶生物，大連)和2 ×Taq PCR MasterMix 試劑盒(博邁德，北京)提供的方法進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)所用引物在表1 中。

1.9 褐藻膠寡糖制備與檢測

褐藻膠寡糖為實(shí)驗(yàn)室自制。褐藻膠(購自青島明月海藻有限公司)利用商品化褐藻膠裂解酶(購自上海Nagase 貿(mào)易有限公司)在45 ℃下降解10 h，利用80%乙醇進(jìn)行沉淀，除去大分子未降解的多糖以及雜質(zhì)，離心15 min 后得到的上清液凍干，制得寡糖。樣本進(jìn)行HPLC 檢測，產(chǎn)物的聚合度為2～6，主要為2 糖和3 糖。

2 結(jié)果與討論

2.1 褐藻膠寡糖對小麥生長發(fā)育的影響

由圖1 實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，24 h 后與空白對照組相比，PEG 處理的小麥葉片出現(xiàn)萎蔫、生長受到嚴(yán)重抑制。與PEG 組相比，施加了1，000 mg/L 的褐藻膠寡糖的小麥苗長、根長以及鮮重分別增加了17.9%、26.2%和43.1%(圖2 A～C)，相對水含量RWC(%)則增加了32.7%(圖2 D)。

圖1 褐藻膠寡糖對小麥生長狀態(tài)的影響Fig.1 Effects of AOS on phenotypes of wheat

圖2 褐藻膠寡糖對小麥生長指標(biāo)的影響Fig.2 Effects of AOS on growth parameters of wheat

圖3 褐藻膠寡糖對小麥葉綠素含量的影響Fig.3 Effects of AOS on chlorophyll content of wheat leaves

各組處理24 h 后，褐藻膠寡糖AOS 組中小麥葉片中葉綠素含量比其他處理組顯著增高(P＞0.05)(圖3)，而PEG 處理組小麥葉綠素含量明顯下降;PEG 處理下外源施加1，000 mg/L 褐藻膠寡糖的小麥葉綠素含量是僅用PEG 處理的2 倍。這些現(xiàn)象表明，小麥在正常或干旱脅迫條件下，外源施加褐藻膠寡糖對小麥葉綠素合成具有促進(jìn)作用。植物生長是由碳固定引起的，這反映在葉綠素含量的增加上。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果中可以發(fā)現(xiàn)，褐藻膠寡糖能夠使干旱下生長受到抑制的小麥恢復(fù)生長。這可能是由于褐藻膠寡糖通過增加葉綠素含量來緩解植物光合抑制。

圖4 褐藻膠寡糖對脯氨酸和MDA 含量以及抗氧化酶活力的影響Fig.4 Effects of AOS on proline and MDA contents and antioxidase activities of wheat leaves

2.2 褐藻膠寡糖對MDA 和脯氨酸含量以及抗氧化酶活力的影響

為了抵御外界非生物脅迫，許多植物通過合成和積累脯氨酸來調(diào)節(jié)滲透壓。在某種程度上，脯氨酸含量的高低可以作為評價植物抗逆能力的指標(biāo)之一［22］。與空白對照組相比，24 h 后PEG 處理組和褐藻膠寡糖處理組小麥中脯氨酸含量分別增加了36.3%和41.2%。干旱狀態(tài)下，外源施加寡糖的小麥處理組其脯氨酸含量增加了53%(圖4 A)。結(jié)果表明，干旱條件下褐藻膠寡糖能夠通過增加脯氨酸積累，增加小麥葉肉細(xì)胞中的滲透調(diào)節(jié)能力，提高小麥抗旱性。

MDA 含量增加是細(xì)胞膜損傷的典型特征，因此MDA 含量多少能夠反映出細(xì)胞膜氧化損傷的程度。PEG 處理組MDA 含量顯著增加(P＜0.05)，與之相比施加了1，000 mg/L 褐藻膠寡糖的處理組MDA 含量降低37.9%(圖4 B)。結(jié)果表明，干旱條件下施加褐藻膠寡糖可以緩解小麥細(xì)胞膜損傷，降低脂質(zhì)過氧化物產(chǎn)生。

水分缺失和滲透脅迫會造成植物細(xì)胞氧化脅迫。植物細(xì)胞進(jìn)化出一種防御機(jī)制來抵御活性氧對其造成的損傷。其中一個重要的機(jī)制就是抗氧化酶系統(tǒng)，包括SOD 和POD［23］。與空白對照組相比，24 h 后PEG 處理的小麥葉片中超氧化物歧化酶SOD的活性增加了7%，施加寡糖后的小麥中超氧化物歧化酶活性也升高(圖4 C)。過氧化物酶POD 的活性也呈現(xiàn)同樣的趨勢(圖4 D)。說明褐藻膠寡糖可以作為外源激發(fā)子，激活抗氧化酶活性。干旱條件下，外源施加褐藻膠寡糖，小麥中超氧化物歧化酶SOD 和過氧化物酶POD 活性分別提高了4% 和13.2%。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，褐藻膠寡糖能夠降低脂質(zhì)過氧化物丙二醛(MDA)的含量，并且可以通過提高抗氧化酶(SOD 和POD)活性緩解葉片細(xì)胞氧化損傷。

2.3 褐藻膠寡糖對抗旱相關(guān)基因表達(dá)的影響

圖5 褐藻膠寡糖對LEA1 轉(zhuǎn)錄水平的影響Fig.5 Expression patterns and relative expression level of LEA1

LEA 蛋白對胚乳發(fā)育和植物生長器官的滲透脅迫有保護(hù)的作用［24］。圖5 顯示，在非干旱脅迫下，LEA 蛋白基因在植物營養(yǎng)器官中低表達(dá)，干旱和AOS 處理均能夠誘導(dǎo)該基因。PEG 處理24 h 后小麥植株嚴(yán)重脫水，為了保護(hù)植物生長器官，其自身必須大量誘導(dǎo)LEA1 表達(dá)，因此出現(xiàn)強(qiáng)烈誘導(dǎo)現(xiàn)象。褐藻膠寡糖誘導(dǎo)小麥LEA1 基因結(jié)果表明:寡糖激發(fā)了LEA1 的轉(zhuǎn)錄，葉片中LEA1 在3 h 就能被褐藻膠寡糖誘導(dǎo)，且為較緩和，24 h 達(dá)到峰值，之后下降。AOS+P 處理組中，在處理的早期小麥LEA1 就被誘導(dǎo)，隨著時間的推移，植株適應(yīng)了這種外源激發(fā)作用，因此該處理組中LEA1 的誘導(dǎo)表現(xiàn)不是那么強(qiáng)烈。

圖6 褐藻膠寡糖對SnRK2 轉(zhuǎn)錄水平的影響Fig.6 Expression patterns and relative expression level of SnRK2

SnRK2 編碼蛋白激酶，調(diào)控干旱響應(yīng)基因(轉(zhuǎn)錄因子TFs)，TFs 與下游抗旱相關(guān)的基因啟動子中順式作用元件結(jié)合，啟動基因表達(dá)。從圖6 中可知，除了空白對照組，所有的處理組中SnRK2 的表達(dá)都是先升后降的趨勢。PEG 處理組小麥中SnRK2 基因12 h 時達(dá)到最大。褐藻膠寡糖可以在早期快速誘導(dǎo)SnRK2:在葉片中該基因3 h 開始上調(diào)。在植物脅迫信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑間存在聯(lián)系和交叉作用。SnRK2 編碼的蛋白激酶參與了逆境脅迫下的很多信號通路:例如，ABA-依賴性信號通路、ABA-非依賴型信號通路以及水楊酸信號通路等，可以說SnRK2 蛋白激酶是信號通路中眾多樞紐之一［25］。當(dāng)激發(fā)子AOS 和PEG 同時作用時，很有可能是幾條通路同時響應(yīng)，對于SnRK2 需求必然要比單獨(dú)使用PEG 和AOS 處理要大，因此在實(shí)驗(yàn)結(jié)果中可以發(fā)現(xiàn)，PEG和AOS 同時誘導(dǎo)該基因具有疊加效果，可使SnRK2轉(zhuǎn)錄水平比單獨(dú)用PEG 或AOS 處理提高2 倍左右。以上結(jié)果表明，褐藻膠寡糖不僅能在早期快速調(diào)控功能基因(LEA1)而且能夠刺激調(diào)控基因(SnRK2)表達(dá)，增強(qiáng)小麥抗旱能力。

圖7 褐藻膠寡糖對NCED 轉(zhuǎn)錄水平的影響Fig.7 Expression patterns and relative expression level of NCED

9-順式環(huán)氧類胡蘿卜素雙加氧酶(9-cis-epoxy carotenoid dioxygenase，NCED)催化的氧化裂解反應(yīng)是ABA 生物合成途徑中的關(guān)鍵步驟。NCED 基因參與了麥類作物的非生物脅迫應(yīng)答反應(yīng)，并調(diào)控內(nèi)源ABA 的合成。由圖7 可知，干旱和AOS 均可誘導(dǎo)NCED 基因，用于合成脫落酸。干旱條件下使用褐藻膠寡糖，葉片中該基因表達(dá)出現(xiàn)“波動”，3 h 時表達(dá)出現(xiàn)一個小高峰，而后下降，72 h 時又出現(xiàn)一個更高的表達(dá)，出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因可能是因?yàn)橐婚_始外界環(huán)境對植物造成刺激，為了應(yīng)對這種急劇的變化，植物對刺激迅速作出反應(yīng)，基因表達(dá)量驟然升高;當(dāng)植物逐步適應(yīng)該變化后，表達(dá)又下降;到了干旱脅迫后期，植株受到的損傷更加嚴(yán)重，為了抵抗外界環(huán)境對其造成的侵害，使脅迫響應(yīng)基因的表達(dá)又達(dá)到一個更高的水平。

3 結(jié)論

研究結(jié)果表明，褐藻膠寡糖AOS 能夠提高小麥生物量、促進(jìn)植物葉綠素合成?？烧T導(dǎo)小麥脅迫保護(hù)劑-脯氨酸積累，產(chǎn)生抗逆酶類，清除由于滲透脅迫產(chǎn)生的氧自由基，保護(hù)葉綠素和細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，減少胞內(nèi)物質(zhì)滲漏，降低丙二醛MDA 含量，穩(wěn)定細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境。此外，褐藻膠寡糖可以快速有效上調(diào)ABA依賴性信號通路中的蛋白激酶編碼基因SnRK2、晚期豐度蛋白編碼基因LEA1 和ABA 從頭合成酶基因NCED 的表達(dá)，表明AOS 可能參與了ABA 依賴性信號通路來緩解干旱對小麥的脅迫作用，增強(qiáng)小麥抗旱能力。

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