李書藝，吳 茜，隋 勇，孫智達(dá)*

1武漢輕工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，武漢 430023;2華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院 環(huán)境食品學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430070

荔枝(Litchi chinensis Sonn.)，為無患子科常綠喬木，也是我國南方重要的水果農(nóng)作物。研究表明，除了味美可口的果肉，荔枝的花、果皮和果核均具有抗氧化活性［1-3］;特別是荔枝果皮，其色澤鮮艷，占果實(shí)鮮重15%，產(chǎn)量頗為豐富。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)［4，5］，荔枝果皮經(jīng)過醇提、濃縮、AB-8 大孔樹脂富集和乙酸乙酯萃取后可得到純度較高的原花青素低聚 體 (Litchi pericarp oligomeric procyanidins，LPOPC)。LPOPC 中同時(shí)含有A-和B-型原花青素，延伸單元和末端單元為表兒茶素，通過4→8，2→O→7 或4→6，4→8 連接而成，以A-型原花青素低聚體為主［2］。然而，當(dāng)利用上述純化方法結(jié)合Toyopearl 柱層析分級制備典型的A-型原花青素二聚體{表兒茶素-(4β→8，2β→O→7)-表兒茶素}和三聚體{表兒茶素-(4β→8，2β→O→7)-表兒茶素-(4β→8)-表兒茶素}時(shí)，周期較長，費(fèi)時(shí)費(fèi)力。且提取物中含有的少量B-型原花青素與同等聚合度的A-型原花青素相比，僅單元連接鍵之間少了一個(gè)C-O-C鍵，分子量差距為2，難以通過凝膠色譜分離。為此，本文將對原有的純化方法進(jìn)行優(yōu)化改進(jìn):用C18硅膠柱材料替代原來的AB-8 大孔樹脂純化，甲醇洗脫取代乙醇洗脫分離，其他步驟仍保持不變。這樣，既可使A-和B-型原花青素達(dá)到完全分離的目的，又可快速制備純度更高、聚合度更低的A-型原花青素低聚體。在此基礎(chǔ)上，通過等輻射分析法(即Isobologram 法)評價(jià)了所得A-型原花青素二聚體和三聚體的協(xié)同抗氧化能力，對探究原花青素的結(jié)構(gòu)與抗氧化活性之間的構(gòu)效關(guān)系具有特殊意義。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

荔枝品種為妃子笑(Litchi chinensis Sonn.cv.Feizixiao)，2012年6 月采自廣州。選取色澤鮮艷，果形勻稱，未受機(jī)械損傷的果實(shí)，取其皮于-20℃下保存。

1.2 主要試劑與儀器

試劑:(-)-表兒茶素、(+)-兒茶素、DPPH(美國Sigma 公司);福林酚試劑(美國Sigma 公司分裝);甲醇，乙腈(色譜純，美國Fisher 公司);High Techsil-C18 硅膠填料(蘇州匯通色譜分離純化有限公司分裝);Toyopearl HW-40s 凝膠填料(日本Tosoh 公司);其他化學(xué)試劑(分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。儀器:UV-2100 型紫外可見分光光度計(jì)(上海尤尼柯儀器有限公司);LC-MSn1100 series 液質(zhì)聯(lián)用儀(美國Agilent 公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 荔枝果皮原花青素粗提物的制備

稱取100±0.5 g 粉碎后的荔枝果皮，在70%的乙醇溶液中(料液比1∶15，W/V)50 ℃水浴避光浸提90 min。提取結(jié)束后抽濾除去殼渣，濾液于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀內(nèi)40 ℃減壓回收乙醇，殘留的水溶液為荔枝果皮原花青素的粗提物。

1.3.2 荔枝果皮原花青素的純化

將上述粗提液100 mL 用滴管緩慢加入C18 硅膠層析柱(3 ×2.5 cm，5 μm)中，給予泵壓力，控制洗脫液流速約50 mL/min。待吸附完全后，采用5倍柱體積的蒸餾水和等體積的90%甲醇分步洗脫處理，前者以去可溶性糖和其它小分子化合物，后者通過下接錐形瓶予以收集。然后，40 ℃減壓旋蒸除去收集液中的甲醇，余下水溶液用3 倍體積乙酸乙酯萃取。再合并有機(jī)相，旋蒸除去有機(jī)溶劑，殘留液復(fù)溶于蒸餾水后冷凍干燥即為優(yōu)化制備的荔枝果皮原花青素低聚體(以下簡稱LPOPC)。

1.3.3 LPOPC 總酚含量的測定

1.3.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

采用Folin-Ciocalteu 法測定上述LPOPC 中的總酚含量［6］。以沒食子酸溶液為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線:分別取濃度為0、0.05、0.1、0.125、0.25、0.5 mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)溶液0.1 mL 加至6 mL 蒸餾水中，混合后加入1 mL 福林酚試劑，均勻混合30 s 后靜置8 min，然后加入1.5 mL 20%碳酸鈉溶液，定容至10 mL。室溫下避光放置2 h 后，765 nm 下比色。以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為Y=0.0013X +0.0189，R2=0.9909。

1.3.3.2 樣品測定

配制0.3 mg/mL 樣品溶液，按標(biāo)曲制作步驟進(jìn)行操作，根據(jù)標(biāo)曲回歸方程計(jì)算出樣品中的總酚含量(mg/g)，平行操作三次，取平均值。

1.3.4 LPOPC 的低聚體組成成分分析

取一定量凍干樣品溶于甲醇配成0.5 mg/mL溶液，經(jīng)0.22 μm 濾膜過濾后進(jìn)行組分分析。使用Agilent 1100 Series LC/MSD Trap 液質(zhì)聯(lián)用儀，配有二元梯度泵，二極管陣列(DAD)檢測器，柱溫箱和自動進(jìn)樣器。

色譜條件:色譜柱為VP-ODS C18柱(150 mm ×4.6 mm，5 μm);柱溫28 ℃;流動相:A 為0.4%的醋酸水溶液，B 為乙腈;洗脫梯度:0～40 min，5%～35% B;40～45 min，35%～50% B;45～50 min，50%～80% B;50～55 min，80%～5% B，然后柱平衡10 min;流速1 mL/min;檢測波長280 nm;進(jìn)樣量20 μL。

質(zhì)譜條件:離子源，電噴霧(ESI);壓力，30 psi;干燥氣，N2;載氣溫度，325 ℃;載氣流速，12 mL/min;監(jiān)測模式，MRM，負(fù)離子模式;離子掃描范圍，100～1200 m/z;關(guān)注分子量，500 m/z;同步進(jìn)行二級破碎。

1.3.5 LPOPC 平均聚合度的計(jì)算

根據(jù)LPOPC 中主要低聚體的聚合度和其相對含量，可推算出LPOPC 的近似平均聚合度，公式如下:

式中:ACatechin為兒茶素的百分含量(%);AEpicatechin為表兒茶素的百分含量(%);A2為原花青素二聚體的百分含量(%);A3為原花青素三聚體的百分含量(%);A4為原花青素四聚體的百分含量(%)。

1.3.6 A-型原花青素二聚體和三聚體的制備

采用Toyopearl HW-40s 凝膠柱(200 mm ×16 mm，30 μm，適用分子量范圍100～1000)，對C18 純化工藝所得的LPOPC 進(jìn)行了分級。將100 mg LPOPC 溶于3 mL 甲醇中，上樣前先經(jīng)0.22 μm 微孔濾膜過濾。洗脫液為甲醇，流速為0.8 mL/min，上樣后每6 min 收集一管。洗脫液經(jīng)紫外檢測儀280 nm 處比色后將吸光度值記錄在對應(yīng)的儀器上。合并相同出峰位置的試管，減壓除去甲醇，冷凍干燥，得到不同聚合度的黃烷醇組分［7］。對各組分進(jìn)行質(zhì)譜解析確定其種類后(方法同1.3.4)，可通過歸一化法計(jì)算目標(biāo)化合物的純度。

1.3.7 Isobologram 法分析A-型原花青素二聚體、三聚體的相互作用

1.3.7.1 二聚體、三聚體清除DPPH 自由基的能力

DPPH·是一種穩(wěn)定的大分子自由基，在乙醇中呈紫色。當(dāng)抗氧化劑與DPPH·反應(yīng)時(shí)，紫色逐漸消失，通過測定吸光值可計(jì)算清除率。清除率反映了抗氧化劑對DPPH·的清除能力，通常表示為半數(shù)抑制率濃度IC50，即清除率為50%時(shí)抗氧化劑的濃度。IC50值越小，提取物清除自由基的能力越強(qiáng)［8］。

準(zhǔn)確配制1 mg/mL 上述A-型原花青素二聚體和三聚體水溶液，將母液分別稀釋10 倍和100 倍得到100 μg/mL 和10 μg/mL 樣品溶液。再取不同體積樣液定容至2 mL，加入DPPH 乙醇溶液后，混勻，在室溫下避光反應(yīng)30 min，于515 nm 處比色?？瞻捉M以等體積無水乙醇代替DPPH·，對照組以等體積蒸餾水代替樣品，平行測定3 次，計(jì)算公式如下:

式中:A0為對照組吸光值;Ai為樣品組吸光值;Aj為空白組吸光值。

1.3.7.2 二聚體、三聚體復(fù)配物清除DPPH 自由基的能力

選擇3 組濃度，即將A-型原花青素二聚體和三聚體的濃度比固定為1∶4、1∶1.5、1∶0.5，且每組確定固定比例濃度設(shè)計(jì)使各自計(jì)算出的清除率在10%～100%范圍內(nèi)均勻分布?；衔锇垂潭ū壤旌虾?，以1.3.7.1 的方法測定復(fù)合抗氧化劑對DPPH·的清除作用，計(jì)算復(fù)配組的IC50值。

1.3.7.3 構(gòu)建二聚體、三聚體復(fù)配后的Isobologram分析圖

等輻射分析法(Isobologram)常用于研究藥物相互作用，選取兩種能產(chǎn)生類似效應(yīng)的藥物，用等輻射圖分析之間的相互作用［9］。將DPPH·清除實(shí)驗(yàn)中得到的二聚體IC50值和95%可信限標(biāo)繪在橫軸上，三聚體的IC50值和95%可信限標(biāo)繪在縱軸上，連接橫縱軸兩IC50值構(gòu)成相加線，連接兩可信限構(gòu)成相加線95%可信限。如果復(fù)配組的效應(yīng)點(diǎn)落在相加線上或可信限內(nèi)，則表示兩種抗氧化劑的相互作用為相加，如果落在相加線及可信限下方則表示相互作用為協(xié)同作用，如果落在相加線及可信限上方則表示相互作用為拮抗作用［10］。

2 結(jié)果與討論

2.1 荔枝果皮原花青素低聚體LPOPC 的組成分析

Folin-Ciocalteu 法測定的結(jié)果顯示，C18 硅膠替代AB-8 大孔樹脂純化荔枝果皮原花青素提取物后，所制得的LPOPC 中總酚含量顯著提升，達(dá)到940±123 mg/g［4］。表明此法確實(shí)可以達(dá)到優(yōu)化提取的效果，故通過HPLC 和LC-MS 聯(lián)合對LPOPC 的組成成分進(jìn)行了進(jìn)一步的驗(yàn)證和分析。

圖1 為LPOPC 在波長280 nm 處的液相色譜圖，從圖中不難看出，提取物主要由12 個(gè)不同極性的組分構(gòu)成。表1 中羅列了幾種A-和B-型原花青素低聚體的典型結(jié)構(gòu)碎片信息，可作為對LPOPC 中各組分結(jié)構(gòu)解析的依據(jù)。如表1 所示，(+)-兒茶素和(-)-表兒茶素的分子離子［M-H］-為289 m/z，結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間信息，分別對應(yīng)為圖1 中的峰1、峰2。B-型原花青素二聚體，分子離子［M-H］-為577 m/z，對應(yīng)二級碎片451、425、407 和289 m/z，通過雜環(huán)裂解脫去間苯三酚(heterocyclic ring fission，HRF)、逆狄爾斯-阿德耳(retro-Diels-Alder，RDA)或同時(shí)脫水、醌甲基裂解(quinone methide，QM)類黃酮連接鍵等反應(yīng)產(chǎn)生［11］，故可同時(shí)存在多種同分異構(gòu)體。而A-型原花青素二聚體與B-型原花青素二聚體相比，因連接單元之間增加了一個(gè)C-O-C 醚鍵，分子量少2，故［M-H］-為575 m/z［12］;相應(yīng)的，當(dāng)發(fā)生以上相同的裂解反應(yīng)時(shí)，分別產(chǎn)生質(zhì)荷比449、423、289 和285 m/z 的二級碎片［13，14］。A-和B-型三聚體的碎片斷裂方式同二聚體類似，不同的是A-型原花青素三聚體的裂解通常發(fā)生在沒有C-O-C 酯鍵連接的兩個(gè)單元之間，m/z 711 和693 為其RDA碎片，m/z 573 和289 為QM 裂解產(chǎn)生?；谝陨辖Y(jié)構(gòu)特征，結(jié)合LC-MS 分析的結(jié)果可知，LPOPC 的每個(gè)組分中同時(shí)包含了一種或多種黃烷醇化合物(表2)。其中，共鑒定出9 種A-型二聚體、4 種A-型三聚體和2 種B-型二聚體(表2)。

以色譜圖中該組分的峰面積表示其所占的比例，以對應(yīng)質(zhì)譜圖中各物質(zhì)的相對豐度表示該物質(zhì)在該組分中的相對含量，可以對LPOPC 中各黃烷醇類物質(zhì)的種類和分布進(jìn)行初步表征(表2)。經(jīng)過比對和計(jì)算發(fā)現(xiàn)，C18 硅膠制備的LPOPC 中黃烷醇類物質(zhì)的含量高達(dá)93.12%，其中A-型原花青素約占41.98%，而B-型僅占2.31%，主要由A-型二聚體、三聚體和B-型二聚體組成。(-)-表兒茶素、A-型二聚體和三聚體的相對含量分別為44.86%、36.02%和9.86%。與AB-8 純化法相比較，前者純化產(chǎn)物中(-)-表兒茶素含量遠(yuǎn)高于后者，提取物中B-型原花青素的含量顯著降低。這是因?yàn)镃18 柱材料為疏水性最強(qiáng)的硅膠基體吸附劑，對非極性的化合物具有極好的強(qiáng)保留效果［15］。A-型原花青素相對于B-型而言極性更弱，與C18 表面會結(jié)合得更為緊密，故洗脫時(shí)較晚被分離。加上實(shí)驗(yàn)操作中吸附洗脫的過程應(yīng)用的是反相色譜分離的原理，只要控制好實(shí)驗(yàn)條件，就可以達(dá)到除去B-型，富集A-型原花青素的目的。同時(shí)，根據(jù)公式(1)，可計(jì)算得到LPOPC 中原花青素的近似平均聚合度僅為1.62。由此證明，使用C18 純化工藝雖然增加了實(shí)驗(yàn)操作的價(jià)格成本，但在科學(xué)研究中，可以用來快速地制備聚合度更低、組分更簡單的A-型原花青素低聚體，同時(shí)也可近乎完全地避免B-型化合物對分級制備帶來的不利影響。

圖1 荔枝果皮原花青素低聚體LPOPC 的RP-HPLC 圖Fig.1 RP-HPLC chromatogram of litchi pericarp oligomeric procyanidins (LPOPC)

表1 A-和B-型原花青素低聚體的典型結(jié)構(gòu)碎片Table 1 Typical structure fragments of A-and B-type procyanidin oligomers

表2 LPOPC 的組成成分分析(LC-MS 法)Table 2 Composition of LPOPC by LC-MS analysis

注:“Cat”為(+)-兒茶素，“Epi”為(-)-表兒茶素，“A-2”、“A-3”和“B-2”分別表示A-型原花青素二聚體、三聚體和B-型原花青素二聚體。Note:“Cat”and“Epi”were the abbreviations of (+)-catechin and (-)-epicatechin;“A-2”，”A-3”and“B-2”represented A-type procyanidin dimer，A-type procyanidin trimer and B-type procyanidin dimer，respectively.

2.2 荔枝果皮中A-型原花青素二聚體和三聚體的制備

利用C18 純化的LPOPC 制備A-型原花青素二聚體和三聚體。經(jīng)過凝膠色譜分級后，LPOPC 混合物被分成了7 個(gè)組分，如圖2 所示。樣品收集從出峰處開始，合并后進(jìn)行HPLC 和LC-MS 分析。通過與原樣的比對，確定后出峰的5 個(gè)組分，即圖中標(biāo)注的F3～F7 為LPOPC 中的主要黃烷醇類物質(zhì)。經(jīng)質(zhì)譜鑒定和色譜歸一化分析(色譜圖均未顯示):F3 為(-)-表兒茶素，純度90%;F4 為(+)-兒茶素，純度92%;F6 為原花青素A2，表兒茶素-(4β→8，2β→O→7)-表兒茶素，純度93%;F7 為原花青素A-型三聚體，表兒茶素-(4β→8，2β→O→7)-表兒茶素-(4β→8)-表兒茶素，純度85%。F5 為一種未知的A-型原花青素二聚體，純度82%。由于在本實(shí)驗(yàn)條件下無法得到足夠量高純度的該化合物，故沒有對它們進(jìn)行進(jìn)一步的結(jié)構(gòu)鑒定。多次重復(fù)上樣和富集后，回收有機(jī)溶劑甲醇，可得到足量的上述已知結(jié)構(gòu)的A-型原花青素二聚體和三聚體化合物，以進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)和分析。

圖2 LPOPC 經(jīng)Toyopearl HW-40 s 的分級洗脫圖譜Fig.2 Elution profile of LPOPC applied to Toyopearl HW-40 s column

2.3 A-型原花青素二聚體和三聚體的抗氧化相互作用

根據(jù)公式(2)可計(jì)算A-型原花青素二聚體和三聚體對DPPH 自由基的清除率。數(shù)據(jù)顯示，以上二者均具有較強(qiáng)的DPPH·清除能力，且在一定范圍內(nèi)，隨著濃度的增加，清除率逐漸上升，最大時(shí)分別達(dá)到87.7%和86.7%，半數(shù)抑制率濃度IC50值依次為9.34 和12.04 μg/mL。以A-型二聚體和三聚體清除自由基的IC50值為依據(jù)，將兩者按幾組固定比例混合進(jìn)行復(fù)配實(shí)驗(yàn)，包括兩種抗氧化劑效強(qiáng)含量相當(dāng)及兩種抗氧化劑分別占主導(dǎo)地位的情況，即選擇3 組固定濃度比，分別使其抗氧化效應(yīng)能力表現(xiàn)為1∶3、1∶1、3∶1，以確定新的量效曲線和IC50值，從而進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。由于二聚體和三聚體的IC50比值為1∶1.4，因此近似選定二聚體和三聚體的復(fù)配濃度比為1∶4、1∶1.5 和1∶0.5。再將三種固定濃度比例各設(shè)計(jì)6 組濃度梯度，分別測定不同比例的復(fù)配物對DPPH·的清除率，計(jì)算相應(yīng)的IC50值，結(jié)果如表3 所示。

在表3 中，每組濃度梯度的復(fù)配物對DPPH·的清除率均勻地分布在10%～100%以內(nèi)。二聚體和三聚體以1∶4、1∶1.5 和1∶0.5 復(fù)配后的IC50，mix值分別為10.15、11.01 和10.19 μg/mL，數(shù)據(jù)結(jié)果符合分析要求，故可利用Isobologram 分析法確定二者之間的相互作用類型。根據(jù)1.3.7.3 中描述的方法構(gòu)建Isobologram 分析圖(圖3)，橫縱坐標(biāo)分別表示三聚體和三聚體的反應(yīng)濃度。當(dāng)二聚體與三聚體的濃度比為1∶4 時(shí)，IC50，A-2值為2.03 μg/mL，IC50，A-3為8.12 μg/mL;濃度比為1∶1.5 時(shí)，IC50，A-2值為4.36 μg/mL，IC50，A-3為6.65 μg/mL;濃度比為1∶0.5 時(shí)，IC50，A-2值為6.55 μg/mL，IC50，A-3為3.34 μg/mL(表3)。不難看出，三個(gè)效應(yīng)點(diǎn)均落在相加線和95%可信限下方，表明A-型原花青素二聚體和三聚體復(fù)配后具有顯著的協(xié)同抗氧化作用。

研究A-型原花青素二聚體和三聚體的協(xié)同抗氧化作用，一方面可以證明抗氧化活性與酚類化合物的羥基數(shù)目之間的關(guān)系:即羥基數(shù)量越多，抗氧化能力越強(qiáng);另一方面，可以協(xié)助我們了解荔枝果皮A-型原花青素混合物是如何發(fā)揮抗氧化作用的。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，三聚體的抗氧化活性雖僅略高于二聚體，但二聚體和三聚體之間卻存在著顯著的協(xié)同抗氧化關(guān)系，提示LPOPC 的高活性極有可能來源于不同聚合度原花青素的相互作用［16，17］。同時(shí)，我們還可能利用這種協(xié)同效應(yīng)重組得到一種抗氧化活性遠(yuǎn)高于原提取物的復(fù)配物。在此，Isobologram 分析法為新型復(fù)合抗氧化劑的開發(fā)提供了重要參考依據(jù)［18］。

表3 A-型原花青素二聚體和三聚體復(fù)配后清除DPPH·的能力Table 3 DPPH radical scavenging activities of A-type procyanidin dimer and trimer mixture

圖3 二聚體和三聚體復(fù)配的Isobologram 分析圖Fig.3 Isobologram analysis graph of interaction with procyanidin dimer and trimer

3 結(jié)論

本文在傳統(tǒng)AB-8 分離純化荔枝原花青素的基礎(chǔ)上，通過C18 硅膠柱層析優(yōu)化制備了聚合度更低、A-型原花青素純度更高的荔枝果皮原花青素低聚體(LPOPC)。組分分析結(jié)果顯示，C18 硅膠制備的LPOPC 中總酚含量達(dá)到940±123 mg/g，且B-型原花青素近乎完全地被分離。其中，(-)-表兒茶素、A-型原花青素二聚體和三聚體為提取物中最主要的單體和低聚體，相對含量分別為44.86%、36.02%和9.86%;提取物平均聚合度為1.62。因此，可高效利用C18 制備的LPOPC 通過凝膠色譜分級獲得已知結(jié)構(gòu)的A-型原花青素二聚體和三聚體?？寡趸u價(jià)結(jié)果顯示，A-型原花青素二聚體和三聚體均具有較強(qiáng)的自由基清除能力;等輻射分析法證明兩者之間呈現(xiàn)一定的協(xié)同抗氧化效應(yīng)，為新型復(fù)合抗氧化劑的開發(fā)提供了新的研究思路。

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