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        Ⅱ型肺泡細胞Tfpi-1基因敲除對脂多糖誘導小鼠急性肺損傷的影響

        2015-01-08 13:51:12王葆青楠王慧君
        復旦學報(醫(yī)學版) 2015年6期
        關(guān)鍵詞:肺泡基因型小鼠

        吳 勰 王葆青 張 進 姜 楠王慧君 馬 端,△

        (1復旦大學基礎(chǔ)醫(yī)學院代謝與分子醫(yī)學教育部重點實驗室 上海 200032,2復旦大學附屬中山醫(yī)院呼吸科 上海 200032,3復旦大學附屬兒科醫(yī)院兒童發(fā)育與疾病轉(zhuǎn)化醫(yī)學研究中心 上海 201102)

        簡訊

        Ⅱ型肺泡細胞Tfpi-1基因敲除對脂多糖誘導小鼠急性肺損傷的影響

        吳 勰1王葆青2張 進1姜 楠1王慧君3馬 端1,3△

        (1復旦大學基礎(chǔ)醫(yī)學院代謝與分子醫(yī)學教育部重點實驗室 上海 200032,2復旦大學附屬中山醫(yī)院呼吸科 上海 200032,3復旦大學附屬兒科醫(yī)院兒童發(fā)育與疾病轉(zhuǎn)化醫(yī)學研究中心 上海 201102)

        目的 觀察Ⅱ型肺泡細胞組織因子途徑抑制物1(tissue factor pathway inhibitor 1,TFPI-1)基因敲除對細菌脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)誘導的小鼠急性肺損傷(acute lung injury,ALI)的影響。方法將Tfpi-1flox/flox轉(zhuǎn)基因小鼠和表面活性蛋白A(surfactant-associated protein A,Spa)-環(huán)化重組酶(cyclization recombination enzyme,Cre)轉(zhuǎn)基因小鼠交配,獲得Tfpi-1flox/flox:Spa-Cre基因型小鼠(C57BL/6J),使用免疫組化和熒光定量PCR檢測不同基因型小鼠肺組織中TFPI-1的表達差異。LPS誘導ALI 24 h后運用體積描記法和有創(chuàng)呼吸功能檢測法檢測小鼠的呼吸功能;通過肺泡灌洗,計數(shù)肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)中白細胞的數(shù)目;BCA法測定BALF中總蛋白水平;ELISA測定BALF中纖溶酶原激活物抑制因子1 (plasminogen activator inhibitor 1,PAI-1)的濃度,HE染色觀察肺損傷的程度;計算肺濕/干重比(wet/dry weight ratio,W/D)。結(jié)果未干預情況下,Tfpi-1flox/flox:Spa-Cre基因型小鼠相對于野生型小鼠肺部結(jié)構(gòu)和呼吸功能無明顯變化。LPS誘導后,Tfpi-1flox/flox:Spa-Cre基因型小鼠相對于野生型小鼠肺損傷分數(shù)、BALF中白細胞總數(shù)、W/D和BALF中PAI-1濃度顯著升高,潮氣量(tidal volume,TV)、每分通氣量(minute ventilation,MV)、吸氣時間(inspiratory time,Ti)、肺動態(tài)順應(yīng)性(dynamic lung compliance,C)有降低趨勢,而呼氣時間(expiratory time,Te)、氣道阻力(airway resistance,R)有升高趨勢。結(jié)論Ⅱ型肺泡細胞條件性敲除Tfpi-1基因促進了LPS誘導的小鼠ALI,影響了小鼠的呼吸功能。

        基因敲除; 脂多糖; 急性肺損傷; 峰值呼氣流速; 組織因子途徑抑制物; Ⅱ型肺泡細胞;小鼠

        【Abstraet】 Objcetivc To investigate the effect of conditional knockout of tissue factor pathway inhibitor 1(TFPI-1)gene in typeⅡpneumocytes on lipopolysaccharide(LPS)-induced acute lung injury(ALI)in mice. Mcthods Tfpi-1flox/floxtransgenic mice and surfatcant-associated protein A(Spa)-cyclization recombination enzyme(Cre)transgenic mice were inbreeded to produce Tfpi-1flox/flox:Spa-Cre mice.The expression of Tfpi-1 from the lung of mice was detected by immunohistochemistry and realtime PCR method.LPS was used to induce ALI.At 24 hours after LPS exposure,respiratory function was measured by plethysmography and invasive respiratory function test.Then the mice were euthanized to obtain bronchoalveolar lavage fluid(BALF),and the number of leukocyte were counted.The levels of protein concentration in BALF were measured by BCA methods,and the concentration of plasminogen activator inhibitor-1(PAI-1)was measured by ELISA.Lung injury was observed by HE staining,and wet/dry weight ratio(W/D)were measured. Rcsults Solo Tfpi-1 knockout in typeⅡpneumocytes did not affect the lung structure and respiratory function in Tfpi-1flox/flox:Spa-Cre mice compared with wild-type mice.After induced by LPS,lung injury score,total number of leukocytes,W/D and the concentration of PAI-1 in BALF were significantly elevated.The respiratory function such as tidal volume(TV),minute ventilation(MV),inspiratory time(Ti),and dynamic lung compliance(C)were slightly decreased in Tfpi-1flox/flox:Spa-Cre mice,while expiratory time(Te)and airway resistance(R)were slightly increased compared with wild-type mice. Conelusions Conditional Tfpi-1 knockout in typeⅡpneumocytes promotes the progress of ALI induced by LPS and affects the respiratory function in mice.

        【Kcy words】 gene knockout; lipopolysaccharide; acute lung injury; peak expiratory flow;tissue factor pathway inhibitor; typeⅡpneumocytes; mouse

        急性肺損傷(acute lung injury,ALI)是由嚴重感染、創(chuàng)傷、休克、中毒、吸入有害氣體、急性胰腺炎、病理產(chǎn)科等導致的急性、進行性呼吸衰竭,以肺毛細血管通透性增強、透明膜的形成、肺不張、進行性的呼吸窘迫為主要特征。該過程中肺泡內(nèi)外源性凝血途徑被激活,伴隨著抗凝物質(zhì)減少和纖溶抑制,造成肺泡內(nèi)凝血-抗凝-纖溶異常,使肺泡內(nèi)處于一種高凝狀態(tài)[1]。組織因子途徑抑制物1(tissue factor pathway inhibitor 1,TFPI-1)是一種主要由血管內(nèi)皮分泌的內(nèi)源性組織因子(tissue factor,TF)抑制物,是人體內(nèi)最主要的生理性抗凝物質(zhì)。有文獻報導通過TF啟動的外源性凝血途徑主要由TF與TFPI-1之間的平衡來調(diào)節(jié)[2]。肺組織的血管內(nèi)皮細胞、肺泡細胞和巨噬細胞都能表達TFPI-1[3],不同來源的TFPI-1在ALI中的作用尚不清楚。由于肺內(nèi)多種細胞可表達TFPI-1,單獨Ⅱ型上皮細胞敲除限于表達量以及其他細胞代償?shù)那闆r不一定能引起顯著的變化。本研究首次通過在小鼠Ⅱ型肺泡細胞中條件性敲除Tfpi-1基因并建立小鼠ALI模型,來評價Ⅱ型肺泡細胞缺失Tfpi-1基因后,小鼠ALI時肺組織結(jié)構(gòu)和功能的變化,以評價Tfpi-1基因?qū)LI的影響。

        材料和方法

        實驗動物Ⅱ型肺泡細胞特異表達Cre的雜合子小鼠(Spa-Cre)由北京軍事醫(yī)學科學院楊曉教授惠贈。該小鼠和指示小鼠(ROSA26轉(zhuǎn)基因小鼠)交配,LacZ染色顯示Spa-Cre:ROS A26雙轉(zhuǎn)基因小鼠的Ⅱ型肺泡細胞具有較強β-半乳糖苷酶活性而呈藍染,說明表達Cre的Ⅱ型肺泡細胞具有組織特異性[4]。Tfpi-1flox/flox轉(zhuǎn)基因小鼠由本課題組和上海南方模式動物中心共同制作:通過同源重組的方法在Tfpi-1基因的第3內(nèi)含子中插入1段序列,該序列含有1個基因失活(gene inactivation,GI)元件,其兩端標記有Loxp序列,其余部分包含neo篩選基因序列。通過構(gòu)建Tfpi-1干細胞打靶載體、電轉(zhuǎn)SCR012小鼠胚胎干細胞、正負藥物篩選、PCR鑒定和測序鑒定,篩選出兩側(cè)臂均為陽性的胚胎干細胞克隆。通過對陽性胚胎干細胞克隆進行囊胚顯微注射、胚胎移植等得到Tfpi-1flox/flox轉(zhuǎn)基因小鼠。將Tfpi-1flox/flox小鼠和Spa-Cre轉(zhuǎn)基因小鼠雜交后,獲得Tfpi-1flox/flox:Spa-Cre基因型小鼠(C57BL/6J),Cre倒轉(zhuǎn)GI元件,倒轉(zhuǎn)后的GI元件通過使Tfpi-1基因轉(zhuǎn)錄終止和在轉(zhuǎn)錄后水平破壞基因的正常剪接這兩種方式來實現(xiàn)基因的敲除。Cre在Spa啟動子的作用下,在Ⅱ型肺泡細胞中特異表達,從而達到條件性敲除Tfpi-1的目的。

        動物分組將18只KO小鼠(C57BL/6J;雌性15只,雄性3只)分為敲除對照組(9只雌性)和敲除LPS組(6只雌性,3只雄性),將18只同窩Tfpi-1flox/+或Tfpi-1flox/flox基因型小鼠(C57BL/6J;雌性15只,雄性3只)分為野生型對照組(9只雌性)和野生型LPS組(6只雌性,3只雄性)。小鼠體質(zhì)量18 ~22 g(清潔級),飼養(yǎng)于復旦大學基礎(chǔ)醫(yī)學院生物化學與分子生物學系動物房,標準飼料喂養(yǎng),自由進食和飲水,普通光照。先檢測對照組小鼠呼吸功能,之后取3只小鼠進行肺組織TFPI-1表達分析,另取3只小鼠進行肺組織TFPI-1熒光定量PCR檢測,其余進行肺組織病理學檢查,LPS組小鼠氣管滴注LPS(5 mg/kg)制備ALI模型[5]。雌性小鼠于模型制備完成24 h后進行呼吸功能檢測,取其中3只雌性小鼠進行肺組織病理學檢查,另外3只雌性小鼠進行肺組織肺泡灌洗,其余3只雄性小鼠進行肺組織濕/干重比(wet/dry weight ratio,W/D)測定。動物實驗的過程符合復旦大學《實驗動物管理條例》的要求。

        主要試劑鼠尾基因組抽提試劑盒購自美國Axygen公司,PCRMix購自上海萊楓生物科技有限公司,TFPI-1抗體購自美國Santa Cruz公司,即用型SABC-POD兔(IgG)試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司,DAB顯色試劑盒和Trizol試劑購自美國Invitrogen公司,焦碳酸二乙酯(Diethypyrocarbonate,DEPC)購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司,實時定量PCR試劑盒購自日本Takara公司,PCR引物由上海博尚生物技術(shù)有限公司和上海桑尼生物科技有限公司合成,紅細胞裂解液購自美國Sigama公司,BCA蛋白定量試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所,小鼠PAI-1 ELISA試劑盒購自武漢伊萊瑞特生物科技有限公司,異丙醇、氯仿、無水乙醇購自上海國藥集團。常用化學試劑水合氯醛、戊巴比妥鈉、NaCl、KCl、Na2HPO4、KH2PO4等均為進口分裝或國產(chǎn)分析純。

        基因型鑒定剪小鼠尾,按照Axygen組織基因組DNA提取試劑盒說明操作,提取小鼠基因組DNA。利用特定序列引物,采用PCR方法對小鼠基因型進行鑒定,基因型為Tfpi-1+/+小鼠(野生型)可見600 bp條帶,Tfpi-1flox/flox小鼠可見500 bp條帶,雜合子基因型為Tfpi-1flox/+則可見500和 600 bp條帶。表達Cre的小鼠PCR產(chǎn)物電泳可見724 bp條帶,不表達Cre的小鼠無此條帶。

        rcal-timc PCR檢測將肺組織放入預冷的勻漿器中,用trizol試劑提取總RNA,逆轉(zhuǎn)錄后進行熒光定量PCR反應(yīng)。TFPI-1引物序列:上游,5'-TCTGTTGCTTAGCCTTGTTCCCGA-3';下游,5'-TGCTTTGCATGGACCATCATCTGC-3';GAPDH引物序列:上游,5'-TGTCGTGGAGTCTACTGGTGTCTT-3',下游,5'-TTCTCGTGGTTCACACCCATCACA-3'。real-time PCR檢測以GAPDH為內(nèi)參,RQ值的計算采用2-ΔΔCT的方法。

        TFPI-1免疫組織化學TFPI-1單克隆抗體以1∶50稀釋,肺組織石蠟切片,采用抗生物素蛋白-生物素-過氧化物酶(ABC)法檢測肺組織TFPI-1表達水平。

        呼吸功能檢測參照文獻[6],采用Buxco無創(chuàng)肺功能儀(美國Buxco公司)檢測小鼠的呼吸功能,包括潮氣量(tidal volume,TV)、每分通氣量(minute ventilation,MV)、呼氣時間(expiratory time,Te)、吸氣時間(inspiratory time,Ti)、PIF和PEF。之后以1.5 g/kg烏拉坦腹腔注射麻醉小鼠,頸部正中縱向切口3 cm,分離氣管和食道。在近喉部將氣管作橫向切口,插入連接有三通開關(guān)的2.5 mm氣管導管,用于測定TV和流率(V),TV和V用Kent呼吸流量測定儀(美國Kent Scientific Corporation公司)測定。胸內(nèi)壓(intrapleural pressure,IPP)用食道內(nèi)壓代替,將食道作橫向切口,插入頭端有4個側(cè)孔的注水導管,后聯(lián)PT14MX型壓力換能器(上海嘉龍教學儀器廠),經(jīng)SMUP-B型生物信號處理系統(tǒng)(復旦大學基礎(chǔ)醫(yī)學院生理與病理生理學系)處理后,TV和V經(jīng)A/D轉(zhuǎn)換,進入PC計算機,由呼吸檢測系統(tǒng)PRC1.00軟件(上海嘉龍教學儀器廠)自動記錄TV、V和IPP曲線,并自動計算肺動態(tài)順應(yīng)性(dynamic lung compliance,C)和氣道阻力(airway resistance,R)。

        肺組織形態(tài)學檢查對各組小鼠肺組織做常規(guī)石蠟切片、HE染色,采用Takao法進行病理學評分。將各個評分進行匯總,總分即代表肺損傷的程度[7]。

        小鼠W/D測定游離小鼠肺組織后,肺組織稱濕重(W)后置于60℃溫箱,72 h后(至恒重)再稱干重(D),計算濕/干重比(W/D),可反映肺水腫程度。

        BALF內(nèi)白細胞總數(shù)計數(shù),總蛋白濃度定量以及PAI-1濃度檢測對小鼠進行肺泡灌洗,吸取20μL BALF在細胞計數(shù)板上計數(shù)白細胞總數(shù)(若BALF中有較多紅細胞,先用紅細胞裂解液處理,以除去紅細胞),剩余樣本按照說明書用BCA法進行總蛋白定量以及PAI-1濃度檢測。

        統(tǒng)計學處理Graphpad 5.0軟件對所有數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計處理,計量資料數(shù)據(jù)以±s表示,差異顯著性采用雙側(cè)t檢驗,P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

        結(jié) 果

        Ⅱ型肺泡細胞Tfpi-1敲除小鼠的構(gòu)建、表型觀察及基因型鑒定通過表型觀察,Ⅱ型肺泡細胞中敲除Tfpi-1基因的小鼠與同窩對照組相比,在存活、發(fā)育及可育性方面的差異均無統(tǒng)計學意義(圖1)。

        免疫組化及熒光定量PCR檢測免疫組化結(jié)果顯示TFPI-1在小鼠肺組織內(nèi)表達豐富,包括Ⅱ型肺泡細胞和Ⅰ型肺泡細胞,相較于 WT組小鼠,KO組小鼠肺組織中TFPI-1表達陽性的Ⅱ型肺泡細胞數(shù)量顯著減少(圖2)。

        圖1 組織特異性的打靶和基因型鑒定Fig 1 Tissuc spceifie gcnc targcting and gcnotyping

        圖2 TFPI-1在KO小鼠和WT小鼠肺組織中的表達情況Fig 2 Thc cxprcssion of TFPI-1 in thc lung of KO miec and WT miec

        小鼠呼吸功能檢測LPS未干預時,WT組和KO組小鼠呼吸功能的差異無統(tǒng)計學意義。LPS氣管灌注24 h后,兩組小鼠呼吸功能之間的差異仍然無統(tǒng)計學意義,但KO小鼠相對于WT小鼠,TV、MV、C有降低趨勢,而Te、R有升高趨勢(圖3)。

        小鼠肺組織結(jié)構(gòu)檢查,肺損傷指標以及肺泡內(nèi)凝血纖溶指標檢測LPS未干預時,各組小鼠在肺部結(jié)構(gòu)上未見明顯差異;LPS干預后,兩組小鼠肺泡腔內(nèi)可見紅細胞和白細胞浸潤,巨噬細胞增多,肺泡隔明顯增厚,血管充血,間質(zhì)水腫,整個肺組織出現(xiàn)炎性反應(yīng)并伴有透明膜形成,而KO組小鼠相較于WT組小鼠,這種變化更加明顯(圖4)。

        圖3 小鼠呼吸功能檢測Fig 3 Thc tcst of rcspiratory funetion in miec

        圖4 ALI狀態(tài)下KO小鼠的肺泡腔內(nèi)白細胞浸潤(主要為中性粒細胞)更為明顯Fig 4 In thc statc of ALI,KO miec has morc lcukoeytc infiltration(mainly ncutrophils)in alvcolar spaec

        討 論

        Huang等[8]曾經(jīng)制備了TFPI-1結(jié)構(gòu)域1基因敲除小鼠,但純合小鼠因卵黃囊出血、腦出血和胎盤發(fā)育異常而導致胚胎致死,因此無法將其用于肺發(fā)育和肺損傷的評價?;谶@種現(xiàn)狀,我們和上海南方模式動物中心合作,成功制備了Tfpi-1flox/flox小鼠,再與Spa-Cre小鼠雜交獲得了Ⅱ型肺泡細胞條件敲除Tfpi-1基因的小鼠。免疫組化和熒光定量PCR檢測發(fā)現(xiàn),在蛋白水平和RNA水平,KO組小鼠相較于WT組,TFPI-1均有明顯下降,因此具備了評價TFPI-1在肺發(fā)育和肺損傷中是否發(fā)揮作用的基礎(chǔ)。

        TF是外源性凝血途徑的啟動因子。ALI發(fā)生時,肺泡細胞、間質(zhì)細胞和血管內(nèi)皮細胞受損,一方面血液循環(huán)中的血細胞和凝血因子滲透到肺泡中,另一方面釋放大量TF,導致在肺泡中發(fā)生凝血反應(yīng),最終可形成透明膜,引起急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrom,ARDS)[9-10]。Bastarache等[11]發(fā)現(xiàn),ALI和ARDS患者肺水腫液中TFPI-1水平顯著高于血漿。本課題組之前的研究也發(fā)現(xiàn),肺組織中TF在LPS處理6 h后開始上升,在12 h時達到高峰;TFPI-1則在LPS處理后呈下降趨勢,在10 h時達到最低值,24 h后仍未回到正常水平[12]。Agrawal等[13]發(fā)現(xiàn),TFPI-1可通過抑制TF活性、降低炎性因子釋放,從而減輕內(nèi)毒素引起的肺損傷。并且有研究發(fā)現(xiàn)體外培養(yǎng)的人肺泡上皮來源的A549細胞和原代分離的人Ⅱ型肺泡細胞在炎性因子的刺激下能釋放TFPI-1[9-11],提示肺泡細胞在維持肺泡內(nèi)TF-TFPI-1平衡以及ALI時肺泡內(nèi)凝血和纖溶狀態(tài)的平衡中發(fā)揮了重要的調(diào)節(jié)作用。

        有關(guān)呼吸功能的研究結(jié)果顯示,LPS誘導小鼠ALI前后Tv和Mv明顯下降,提示ALI時肺順應(yīng)性降低,部分肺泡閉塞以及肺水腫導致肺通氣功能下降。在生理狀態(tài)下,KO組小鼠和WT組小鼠的肺功能差異無統(tǒng)計學意義。建立ALI模型后,兩種小鼠的呼吸功能差異雖然無統(tǒng)計學意義,但KO組小鼠TV、MV和C有明顯的下降趨勢,R有明顯的上升趨勢。

        生理情況下Ⅱ型肺泡細胞缺乏TFPI-1時,小鼠肺部的結(jié)構(gòu)與功能未見變化。在LPS誘導建立的ALI模型中,Ⅱ型肺泡細胞缺乏TFPI-1的小鼠肺泡腔內(nèi)中性粒細胞浸潤明顯增多,血管充血更加嚴重,肺泡間隔明顯增厚,肺損傷分數(shù)、W/D以及BALF中的總白細胞計數(shù)顯著升高,透明膜形成顯著增多,提示在ALI的過程中Ⅱ型肺泡細胞分泌的TFPI-1能夠發(fā)揮比較顯著的抗凝和抗炎作用,從而有助于減輕肺損傷。同時,我們關(guān)注了肺泡內(nèi)PAI-1的變化,發(fā)現(xiàn)KO組小鼠相對于WT組小鼠,肺泡內(nèi)的PAI-1水平顯著下降,提示KO組小鼠的肺組織內(nèi)纖溶活性代償性的上升,以維持肺泡內(nèi)凝血與纖溶的平衡。

        總之,本研究的結(jié)果初步顯示,在急性肺部炎癥時,Ⅱ型肺泡細胞產(chǎn)生的TFPI-1可以通過改變肺泡內(nèi)TF-TFPI-1平衡,影響肺泡內(nèi)的炎癥和凝血平衡,進而促進炎癥的發(fā)生和發(fā)展,同時影響小鼠的呼吸功能。目前有關(guān)TFPI-1在細胞膜上的受體尚不明確,TFPI-1作為一種抗凝分子,可通過與FXa/ TF/FVIIa結(jié)合形成一種四元復合物,抑制血栓的形成,而其中的TF是一種跨膜分子,在此過程中可通過PAR對ERK通路產(chǎn)生抑制作用,但是否有抑制P38途徑的作用目前還存在爭議[14];另有報道TFPI-1可以與SDC4相互結(jié)合向細胞內(nèi)傳遞信號[15-16],對于TFPI-1減少加重肺部炎癥的機制尚有待于進一步的研究。

        致謝王際平和溫丹萍在小鼠繁殖、基因型鑒定技術(shù)以及文獻分享上給予了指導和幫助;肖家軍、許飛、刁磊和徐君在免疫組化實驗上給予了幫助;房波在real-time PCR實驗上給予了幫助;張志剛老師在小鼠肺部病理檢查上給予了指導與幫助;王琴、宋元林老師和高磊老師在小鼠ALI模型建立以及肺損傷指標檢測技術(shù)上給予了指導和幫助;上海市針灸筋絡(luò)研究所的王宇老師和馬子風在小鼠呼吸功能檢測上給予了幫助。

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        Effcet of eonditional knoekout of Tfpi-1 gcnc in typcⅡpncumoeytcs on lipopolysaeeharidcs-induecd aeutc lung injury in miec

        WU Xie1,WANG Bao-qing2,ZHANG Jin1,JIANG Nan1,WANG Hui-jun3,MA Duan1,3△
        (1Key Laboratory of Metabolism and Molecular Medicine,Ministry of Education,School of Basic Medical Sciences,F(xiàn)udan University,Shanghai 200032,China;2Department of Respiration,Zhongshan Hospital,F(xiàn)udan University,
        Shanghai 200032,China;3Research Center for Children Development and Translational Medicine,
        Children's Hospital,F(xiàn)udan University,Shanghai 201102,China)

        E-mail:duanma@fudan.edu.cn

        R 34;R 563

        A

        10.3969/j.issn.1672-8467.2015.06.001

        2015-06-25;編輯:段佳)

        國家自然科學基金(81070104)△

        *This work was supportcd by thc National Natural Seicnec Foundation of China(81070104).

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