陳曉暢，宋學(xué)太，王師哲，胡建宏，楊公社，龐衛(wèi)軍

（西北農(nóng)林科技大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，陜西 楊凌712100）

關(guān)中黑豬顧名思義，因其產(chǎn)地在陜西省關(guān)中平原而得名，是我國(guó)早期培育成功的肉脂兼用型優(yōu)良品種之一，主要分布在陜西關(guān)中平原的咸陽(yáng)、興平、周至、武功、楊凌等地區(qū)。目前，由于市場(chǎng)變化，在其育種上沒(méi)有采用更好的方法，致使關(guān)中黑豬原來(lái)的優(yōu)良性狀在不斷退化，因而對(duì)關(guān)中黑豬精液的常溫保存的研究就很有意義。

目前，由于豬精液的冷凍保存技術(shù)仍然不夠完善，存在生產(chǎn)難度大，活率低，受胎率低及產(chǎn)仔少等諸多問(wèn)題。因此，豬的精液保存普遍應(yīng)用的方法仍然是常溫保存。然而，我國(guó)大多數(shù)豬場(chǎng)采用的稀釋液均是自配稀釋液，在常溫條件下保存的有效時(shí)間一般僅為2～3d，且在保存48h后其活力就會(huì)明顯下降，嚴(yán)重地影響了豬的受精率和受胎率。因此，本試驗(yàn)旨在通過(guò)不同添加物質(zhì)、不同溫度、不同抗生素之間的對(duì)比試驗(yàn)，篩選出保存效果好的稀釋液配方，從而延長(zhǎng)精子存活時(shí)間，提高精子的存活率和受精率，為今后的關(guān)中黑豬的育種工作提供第一手?jǐn)?shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 精液來(lái)源

試驗(yàn)精液來(lái)源于西北農(nóng)林科技大學(xué)家畜生態(tài)養(yǎng)殖場(chǎng)健康成年的關(guān)中黑豬種公豬。精液采集方法為手握法采精，精液采集后靜置并收集中段濃縮部分，采用4層醫(yī)用紗布進(jìn)行過(guò)濾，并保存于保溫杯中。30min內(nèi)帶回實(shí)驗(yàn)室，立即在37 ℃條件下在顯微鏡下進(jìn)行觀測(cè)精子活力、密度。選擇色澤和氣味正常，且精子活力在0.7以上，密度在2×108～4×108個(gè)／mL的精液進(jìn)行試驗(yàn)研究。

1.2 主要儀器和設(shè)備

溫度計(jì)、顯微鏡、血細(xì)胞計(jì)數(shù)板、冰箱、容量瓶、燒杯、載玻片、蓋玻片、試管、稱(chēng)量紙、藥勺、毛巾恒溫水浴鍋、計(jì)數(shù)器、移液槍、電子天平、37 ℃恒溫板、pH 試紙、鑷子、青霉素小瓶、滴管、注射器（1 mL、2 mL、5mL、10mL）、玻璃棒等。

1.3 精液常溫保存稀釋液配方選擇

根據(jù)已有文獻(xiàn)報(bào)道，本試驗(yàn)設(shè)計(jì)了如下5種稀釋液配方，見(jiàn)表1。

表1 稀釋劑配方的比較 g／L

1.4 精液常溫保存溫度的選擇

根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，選取表1中保存效果最佳的稀釋液配方，分4組不同的溫度對(duì)關(guān)中黑豬精液常溫保存效果進(jìn)行對(duì)比，其溫度分別為10 ℃、15 ℃、20℃、25 ℃。精液與稀釋液按1：1比例稀釋?zhuān)股卦谙♂屒疤砑印?/p>

1.5 精液常溫保存抗生素的選擇

根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，選取表1中保存效果最佳的稀釋液配方，在同溫同稀釋比例的條件下，分別選用青霉素、慶大霉素、青霉素＋慶大霉素三種抗生素進(jìn)行關(guān)中黑豬精液保存效果對(duì)比，并設(shè)置不添加抗生素的一組作為對(duì)照。

1.6 稀釋液的配制及精液的稀釋保存

按配方準(zhǔn)確稱(chēng)量藥品，按不同組別將不同種類(lèi)及濃度的藥物加入到基礎(chǔ)配方液中，用玻璃棒混勻使之充分溶解，抽濾，并在37℃水浴箱中預(yù)熱，將稀釋液按不同組別分裝在小瓶中。根據(jù)原精密度按0.3～0.5億個(gè)／mL的標(biāo)準(zhǔn)確定其稀釋倍數(shù)，將豬精液沿壁倒入小瓶中，輕輕搖勻，密封后將小瓶室溫放置2h后放入17 ℃恒溫保存箱中保存，每隔12h輕輕搖動(dòng)精液1次。每隔12h檢測(cè)精子各項(xiàng)指標(biāo)，直至精子活力低于0.50。

1.7 稀釋液及評(píng)定指標(biāo)

1.7.1 鮮精精液品質(zhì)評(píng)定指標(biāo) 顏色、氣味、活率、密度、畸形率。

1.7.2 精子活力的檢測(cè) 在37 ℃加熱的載物臺(tái)上，分別從5個(gè)錐形瓶中用移液槍取30μL，滴在潔凈的載玻片上，蓋上蓋玻片，其間充滿精液，不存留氣泡。置于顯微鏡下，放大400倍檢查。注意顯微鏡的載物臺(tái)須放平，并在暗視野中觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 關(guān)中黑豬新鮮精液品質(zhì)測(cè)定

關(guān)中黑豬精液品質(zhì)基本穩(wěn)定，品質(zhì)符合要求。采精量平均為250mL，顏色為乳白色，pH7.3，密度2.36億個(gè)／mL，活力0.85，畸形率為16%，質(zhì)膜完整性為79%。

2.2 不同稀釋液對(duì)關(guān)中黑豬精子活力的影響

通過(guò)5種稀釋液的稀釋?zhuān)扛?2h檢測(cè)一次活力，不同稀釋液作用下精子活力隨時(shí)間變化明顯，有效天數(shù)為精子活力在0.5以上的天數(shù)，不同稀釋劑對(duì)精子活力影響見(jiàn)表2。

表2 不同稀釋液對(duì)精子活力的影響

由表2可知，在5種稀釋液中，有效保存效果最好的是Ⅲ，有效保存時(shí)間為5.0d，明顯好于Ⅰ（P＜0.05），而Ⅰ的保存效果好于其余三種（P＜0.05）。Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ三種稀釋液有效保存時(shí)間2.0～2.5d，保存效果相似（P＞0.05）。當(dāng)選擇短期保存精液時(shí)（2.0d內(nèi)），Ⅰ、Ⅲ兩種稀釋劑的保存效果近似（P＞0.05），Ⅲ略好。如果稍長(zhǎng)時(shí)間保存則可選擇Ⅲ號(hào)稀釋劑（P＜0.05）。

2.3 不同溫度對(duì)關(guān)中黑豬精子活力的影響

不同溫度對(duì)關(guān)中黑豬精子活力的影響見(jiàn)表3。

表3 同種稀釋液在不同溫度下的精子活力

由表3可知，關(guān)中黑豬的精液在Ⅲ號(hào)稀釋液按1∶1比例稀釋保存時(shí)，15 ℃、20 ℃溫度條件下的精子活力略好于在10 ℃、25 ℃溫度條件下的保存結(jié)果（P＞0.05）。在15℃、20℃溫度條件下的精子活力無(wú)明顯差別（P＞0.05），總體上看15 ℃條件下的精子活力略高。因此，關(guān)中黑豬精液常溫保存最佳溫度為15 ℃～20 ℃（P＞0.05）。

2.4 不同抗生素對(duì)關(guān)中黑豬精子活力的影響

不同抗生素對(duì)關(guān)中黑豬精子活力的影響見(jiàn)表4。

表4 不同抗生素對(duì)精子活力的影響

由表4可知，在稀釋液中加入青霉素、慶大霉素及青霉素＋慶大霉素的混合液對(duì)關(guān)中黑豬精液常溫保存效果并無(wú)明顯差異（P＞0.05）。但在稀釋液中不添加抗生素，1.5d后精子活力會(huì)急劇下降到0.5（P＜0.05）。

3 討論

豬精液常溫保存技術(shù)是豬人工受精技術(shù)中常用的方法，而稀釋液是影響豬精液常溫保存效果的關(guān)鍵因素。稀釋液的主要作用一方面用于擴(kuò)大精液體積以滿足生產(chǎn)需求，另一方面保護(hù)精子的功能特征，維持精子的受精能力。稀釋液中所含的各種成分對(duì)精子的保護(hù)作用也各不相同。本研究發(fā)現(xiàn)，在選用的5種稀釋液中，對(duì)關(guān)中黑豬精子保存效果Ⅲ號(hào)稀釋液最好，可保存5d，精子活力0.5以上。因此，Ⅲ號(hào)稀釋液配方中葡萄糖、檸檬酸鈉、EDTA、碳酸氫鈉、檸檬酸和Tris配比較合理。

在影響精子存活的外界環(huán)境因素中，保存溫度至關(guān)重要。早期對(duì)于精液常溫保存的適宜溫度的研究中發(fā)現(xiàn)，低溫可以抑制精子的活性，從而達(dá)到延長(zhǎng)保存時(shí)間的目的。而大量的研究表明，低溫會(huì)導(dǎo)致精子細(xì)胞失活。最近研究表明，在15 ℃～20 ℃條件下，對(duì)于豬精液的保存效果最好，其中普遍認(rèn)可的是17℃室溫條件是精液常溫保存最好的溫度。在這一溫度區(qū)間內(nèi)，精子活動(dòng)受到抑制，而又不會(huì)影響其活性，關(guān)中黑豬常溫保存的最佳溫度為15℃～20℃。

抗生素的添加是豬精液常溫保存過(guò)程中的重點(diǎn)，抗生素的作用是抑制稀釋液中細(xì)菌的滋生，為精子細(xì)胞提供健康環(huán)境。本試驗(yàn)的結(jié)果表明，青霉素、慶大霉素和青霉素＋慶大霉素的混合劑組間的效果差異不顯著?？股匮芯楷F(xiàn)在所面臨的問(wèn)題是，由于抗生素的濫用，使得細(xì)菌對(duì)于常規(guī)抗生素有了明顯的抗性，使得抗生素的作用受損。在以后的研究中，應(yīng)針對(duì)于豬精液常溫保存的過(guò)程中稀釋液中滋生細(xì)菌的種類(lèi)，探索出有針對(duì)性的抗生素來(lái)解決這一問(wèn)題。

4 結(jié)論

關(guān)中黑豬精液常溫保存效果最佳的是Ⅲ號(hào)，常溫保存的最佳溫度為15 ℃～20 ℃。

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