唐昭娜 ，張翠英，胡平雄 ，易秋分 ，楊江麗，董 輝

(1.天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457；2.天津國(guó)際生物醫(yī)藥聯(lián)合研究院，天津 300457)

丙氨酸脫氫酶(alanine dehydrogenase，Ald)是一種NAD+依賴性的氨基酸脫氫酶[1]，琥珀酸、蘋(píng)果酸和丙酮酸等均可誘導(dǎo)其產(chǎn)生[2-3].丙氨酸脫氫酶可以調(diào)節(jié)酮酸和氨基酸的穩(wěn)態(tài)平衡，它可逆地催化丙氨酸生成丙酮酸和氨，同時(shí)NAD+被還原成為NADH.反應(yīng)產(chǎn)物丙酮酸在食品工業(yè)、制藥工業(yè)、農(nóng)用化學(xué)品、生化研究和減肥保健品等多個(gè)方面被廣泛的應(yīng)用[4].

丙氨酸脫氫酶在細(xì)菌、藻類和植物中分布較為廣泛，影響著微生物的碳氮代謝[5-9].動(dòng)物體內(nèi)的丙氨酸脫氫酶影響著機(jī)體的氨基酸代謝和糖代謝，能為機(jī)體提供能量[10].1990 年，丙氨酸脫氫酶的編碼基因被克隆成功[11]，來(lái)源于席藻(Phormidium lapideum)中丙氨酸脫氫酶的三維空間結(jié)構(gòu)在1998 年首次被解析出來(lái)[9]，其后多種不同來(lái)源的丙氨酸脫氫酶三維空間結(jié)構(gòu)也相繼被解析.

目前，尚無(wú)關(guān)于假堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌(Bacillus pseudofirmus)丙氨酸脫氫酶(NCBI 參考序列號(hào)：WP_012,959,278.1)表達(dá)純化及結(jié)晶的研究報(bào)道.本實(shí)驗(yàn)對(duì)來(lái)源于假堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌的丙氨酸脫氫酶進(jìn)行原核表達(dá)純化及結(jié)晶，并通過(guò)X 射線衍射對(duì)其晶體數(shù)據(jù)進(jìn)行收集和處理，為蛋白空間結(jié)構(gòu)的解析提供有力的理論依據(jù)，可為其催化機(jī)制的研究和相關(guān)藥物的研發(fā)奠定基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 目的基因、表達(dá)載體及菌株

含有丙氨酸脫氫酶(Ald)基因的質(zhì)粒和實(shí)驗(yàn)用到的表達(dá)載體pET-22b(+)由本實(shí)驗(yàn)室保存.感受態(tài)細(xì)胞E.coli DH5α 和BL21(DE3)購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司.

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

本實(shí)驗(yàn)用到的引物由上海生工生物工程有限公司合成；Pfu DNA 聚合酶、dNTP(10,mmol/L)、限制性核酸內(nèi)切酶(NdeⅠ和XhoⅠ)、T4,DNA 連接酶，F(xiàn)ermentas 公司；瓊脂糖凝膠DNA 回收試劑盒、質(zhì)粒DNA 小量提取試劑盒，Bioflux 公司；氨芐青霉素(Amp+)、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)、丙烯酰胺、十二烷基硫酸鈉(SDS)、過(guò)硫酸銨(APS)、四甲基乙二胺(TEMED)、咪唑、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、氯化鈉(NaCl)等，上海生工生物工程有限公司；Ni-NTA sephrose、Resource Q 離子交換柱、Superdex 75凝膠過(guò)濾層析柱，GE Healthcare 公司；結(jié)晶試劑盒Index、PEG/Ion screen、PEG/Ion 2,screen、Crystal Screen 和Crystal Screen 2，Hampton Research 公司；乙二醇、聚乙二醇(PEG 3350)、甲酸鈉等，Sigma 公司；甘油等其他常用試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建

利用引物設(shè)計(jì)軟件Primer Premier 5.0，按照引物設(shè)計(jì)原則設(shè)計(jì)引物.本實(shí)驗(yàn)選定的酶切位點(diǎn)分別為NdeⅠ與 XhoⅠ，設(shè)計(jì)出的引物如下：上游：5′-CCCATATG ATGTTAATTGGTGTACC-3′，其中劃線部分為NdeⅠ酶切位點(diǎn)；下游：5′-CCTCGAGTCATG ACTGAAGTGTTT-3′，其中劃線部分為XhoⅠ酶切位點(diǎn).

以含有目的基因(1,125,bp)的質(zhì)粒為模板經(jīng)PCR后，用限制性核酸內(nèi)切酶NdeⅠ和XhoⅠ對(duì)目的基因和pET-22b(+)進(jìn)行雙酶切，產(chǎn)生相同的黏性末端，構(gòu)建重組質(zhì)粒.利用限制性內(nèi)切酶酶切法和DNA 測(cè)序法對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行鑒定.

1.2.2 丙氨酸脫氫酶(Ald)的表達(dá)

將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到E.coli BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞內(nèi).挑取長(zhǎng)出的單克隆菌落接種于 5,mL 含100,μg/mL 氨芐青霉素的LB 液體培養(yǎng)基內(nèi)，37,℃、220,r/min 振蕩培養(yǎng)過(guò)夜.次日，將上述培養(yǎng)液接種于800,mL 含100,μg/mL 氨芐青霉素的LB 液體培養(yǎng)基內(nèi)，37,℃、220,r/min 振蕩培養(yǎng)至600,nm 處吸光度在0.6 左右.將搖床溫度降至16,℃，向菌液內(nèi)加入0.25,mmol/L IPTG，誘導(dǎo)培養(yǎng)16～20,h.將菌液以5,500,r/min 離心 20,min，棄上清液.用緩沖液(50,mmol/L Tris-HCl(pH 7.2)，200,mmol/L NaCl 溶液，5%,甘油)對(duì)菌體進(jìn)行重懸并收集.

1.2.3 丙氨酸脫氫酶(Ald)的純化

收集的菌體利用低溫高壓破碎，12,000,r/min 離心40,min，收集上清液.將上清液加到已用懸菌緩沖液平衡過(guò)的鎳離子親和層析柱(NI-NTA sephrose)上.懸菌緩沖液和洗脫緩沖液(50,mmol/L Tris-HCl(pH 7.2)，200,mmol/L NaCl 溶液，5%,甘油，1,mol/L 咪唑)按比例混合，使緩沖液中咪唑濃度分別為20、50、100、200,mmol/L，利用梯度洗脫對(duì)蛋白進(jìn)行初步純化.洗脫的目的蛋白利用Resource Q 離子交換柱和Superdex 75 凝膠過(guò)濾層析柱進(jìn)行進(jìn)一步的純化.

1.2.4 Ald 蛋白結(jié)晶條件的初篩及結(jié)晶條件的優(yōu)化

對(duì)獲得的Ald 蛋白進(jìn)行結(jié)晶條件的篩選.將蛋白稀釋成5,mg/mL 和10,mg/mL 兩種質(zhì)量濃度溶液，用Index、PEG/Ion screen、PEG/Ion 2,screen、Crystal Screen 和Crystal Screen 2 等試劑盒以坐滴氣相擴(kuò)散法在16,℃條件下初步篩選蛋白的結(jié)晶條件.通過(guò)改變結(jié)晶初篩條件中溫度、緩沖液pH、鹽的濃度、沉淀劑的種類和濃度以及蛋白濃度來(lái)確定蛋白結(jié)晶的最優(yōu)條件[12].

2 結(jié)果與分析

2.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定

利用質(zhì)粒提取試劑盒提取重組質(zhì)粒，使用限制性核酸內(nèi)切酶NdeⅠ和XhoⅠ對(duì)其進(jìn)行雙酶切鑒定，鑒定結(jié)果如圖1 所示.圖中出現(xiàn)的兩片段大小約為1,100,bp 和 5,500,bp，初步證實(shí)該質(zhì)粒為重組質(zhì)粒.測(cè)序的結(jié)果也表明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功.

2.2 Ald蛋白的表達(dá)與純化

菌液經(jīng)高壓低溫破碎后離心，上清液中的蛋白結(jié)合到鎳離子親和層析介質(zhì)上，用含不同咪唑濃度的緩沖液進(jìn)行洗脫.洗脫過(guò)程取樣，進(jìn)行12%,SDS-PAGE分析，結(jié)果如圖2 所示.最終得出雜蛋白和目的蛋白洗脫緩沖液中咪唑濃度分別為 20,mmol/L 和200,mmol/L.

圖1 重組質(zhì)粒的雙酶切Fig.1 Enzyme digestion analysis of recombined plasmid

圖2 Ald鎳離子親和層析的SDS-PAGE分析Fig.2 SDS-PAGE analysis of Ald after Ni-NTA affinity chromatography

經(jīng)鎳離子親和層析洗脫下來(lái)的目的蛋白，利用Resource Q 離子交換柱和Superdex 75 凝膠過(guò)濾層析柱進(jìn)行進(jìn)一步純化，最終得到的Ald 蛋白進(jìn)行12%,SDS-PAGE 分析，如圖3 所示，結(jié)果顯示得到了純度較高的蛋白，可進(jìn)行蛋白晶體篩選.

2.3 Ald蛋白晶體的篩選與優(yōu)化

經(jīng)過(guò)Hampton Research 公司的蛋白質(zhì)結(jié)晶試劑盒初篩后，多個(gè)條件長(zhǎng)出晶體，見(jiàn)表1.本實(shí)驗(yàn)主要針對(duì)晶體生長(zhǎng)較好的結(jié)晶條件進(jìn)行溫度、緩沖液pH、鹽的濃度、沉淀劑的種類和濃度以及蛋白質(zhì)量濃度的優(yōu)化，使最初較小的晶體經(jīng)優(yōu)化變?yōu)檩^大的塊狀晶體，如圖4 所示.最終得出當(dāng)結(jié)晶溫度為16,℃、蛋白質(zhì)量濃度為10,mg/mL、池液條件為有機(jī)酸鹽混合物(73.2,mmol/L 丙二酸，10,mmol/L 檸檬酸銨，4.8,mmol/L 丁二酸，12,mmol/L DL-蘋(píng)果酸，16,mmol/L 三水醋酸鈉，20,mmol/L 甲酸鈉，6.4,mmol/L 酒石酸氫銨)pH 5.0 和8%,PEG 3350 時(shí)，可優(yōu)化出理想的晶體.

圖3 Ald凝膠過(guò)濾層析純化后SDS-PAGE分析Fig.3 SDS-PAGE analysis of Ald after gel filtration chromatography

表1 Ald蛋白的初步結(jié)晶條件Tab.1 ,Initial crystallization conditions of Ald

優(yōu)化后的晶體經(jīng)X-ray 衍射和數(shù)據(jù)收集處理，最后得到 Ald 蛋白晶體的分辨率為 0.31 nm(見(jiàn)圖5).該晶體參數(shù)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表2.

圖4 Ald晶體圖片F(xiàn)ig.4 Crystal images of Ald

圖5 Ald晶體衍射圖Fig.5 X-ray diffraction pattern of Ald crystal

表2 Ald蛋白晶體衍射數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)表Tab.2 Statistics of the diffraction data of Ald

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)將假堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌Bacillus pseudofirmus的Ald 目的基因克隆到原核表達(dá)載體pET-22,b(+)上，成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒，并完成了其在大腸桿菌中的高效表達(dá).通過(guò)鎳離子親和層析、Resource Q 離子交換層析和Superdex 75 凝膠過(guò)濾層析等方法對(duì)目的蛋白進(jìn)行純化，將純化后的蛋白用于蛋白結(jié)晶.對(duì)蛋白結(jié)晶條件進(jìn)行篩選及優(yōu)化，最終在結(jié)晶溫度為16,℃、蛋白質(zhì)量濃度為10 mg/mL、池液條件為有機(jī)酸鹽混合物(73.2 mmol/L 丙二酸，10 mmol/L 檸檬酸銨，4.8 mmol/L 丁二酸，12 mmol/L DL-蘋(píng)果酸，16 mmol/L 三水醋酸鈉，20 mmol/L 甲酸鈉，6.4 mmol/L酒石酸氫銨)pH 5.0 和8%,PEG3350 時(shí)，獲得分辨率為0.31 nm 的蛋白晶體.晶體所屬空間群為P212121，晶胞參數(shù)為a＝9.74 nm、b＝15.67 nm、c＝16.91 nm、α＝β＝γ＝90°.本實(shí)驗(yàn)中得到的蛋白晶體的相關(guān)數(shù)據(jù)為蛋白空間結(jié)構(gòu)的解析提供了重要依據(jù)，并對(duì)深入了解Ald 蛋白的催化機(jī)制尤為重要，能為相關(guān)藥物的研發(fā)和疾病的預(yù)防奠定基礎(chǔ).

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