羅 楊 ，楊 勇，* ，吳 振，鄧麗莉，陳 崗，譚紅軍，，詹 永，石文娟

1重慶市中藥研究院，重慶 400065;2 西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶 400715;3重慶市銀耳營(yíng)養(yǎng)食品企業(yè)工程技術(shù)研究中心，重慶 409003

銀耳(Tremella fuciformis)，又名白木耳、雪耳，歷來(lái)同人參、鹿茸、燕窩齊名，其含有多糖、酚類、黃酮類和多種氨基酸等生物活性成分，是一種傳統(tǒng)的高級(jí)滋補(bǔ)品和甜食珍品。銀耳藥性平和，服用安全;中醫(yī)認(rèn)為，銀耳味甘淡性平，歸肺、胃經(jīng)，具有滋陰潤(rùn)肺、養(yǎng)胃生津的功效［1］。銀耳含有豐富的營(yíng)養(yǎng)成分，其鮮品水分含量極高，采收前后都極易感染病害，導(dǎo)致霉變腐爛，貯藏保鮮難度大，所以銀耳一般只以干制品形式出售，產(chǎn)品出路少，附加值低，感官品質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較鮮品大幅下降。因此，研究適于新鮮銀耳采后保鮮的天然保鮮劑具有重要意義。

殼聚糖(Chitosan，CTS)是一種資源豐富的甲殼類動(dòng)物天然提取物，是由甲殼素脫去乙?；纬傻膸ш?yáng)離子的多糖，無(wú)味、無(wú)毒、安全，對(duì)人體具有一定的生理保健功能，為可食性物質(zhì)。殼聚糖良好的成膜性和抗菌性，可降低機(jī)體組織中活性氧的形成，延緩細(xì)胞衰亡并保持其質(zhì)量［2］。殼聚糖廣泛應(yīng)用于果蔬保鮮領(lǐng)域，在食用菌中也有應(yīng)用［3］。有研究表明殼聚糖能誘導(dǎo)提高雙孢蘑菇和白靈菇的SOD 和CAT 活性［4，5］。目前，新鮮銀耳貯藏保鮮相關(guān)研究很少，本文在殼聚糖對(duì)新鮮銀耳有良好的保鮮作用基礎(chǔ)上，研究殼聚糖保鮮劑對(duì)銀耳的活性氧代謝的影響，探討殼聚糖對(duì)新鮮銀耳貯藏保鮮機(jī)理，為殼聚糖在新鮮銀耳保鮮領(lǐng)域應(yīng)用提供理論參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

銀耳:采摘自朵朵潤(rùn)爾營(yíng)養(yǎng)食品股份有限公司袋料銀耳智能培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)間，菌種為朵朵3 號(hào)，選取已除蒂、朵形硬實(shí)飽滿、表面光潔、無(wú)病蟲(chóng)害、大小一致、外形佳且無(wú)機(jī)械損傷的新鮮銀耳。

1.2 主要儀器與試劑

主要儀器:UV1000 紫外分光光度計(jì)(上海天美科學(xué)儀器有限公司)，3H16R1 高速冷凍離心機(jī)(湖南赫西儀器裝備有限公司)，HWS-26 電熱恒溫水浴鍋(上海齊欣科學(xué)儀器有限公司)，DW-FL 超低溫冷凍儲(chǔ)存箱(合肥美菱股份有限公司)，F(xiàn)A2004B 電子天平(上海精科天美科學(xué)儀器有限公司)。

包裝材料:保鮮用圓形帶蓋碗盒，PP5 材質(zhì)，口徑×底徑×高=185 mm ×150 mm ×88 mm，佛山市順德區(qū)泓生吸塑包裝有限公司。

主要試劑:殼聚糖(食品級(jí)，脫乙酰度50%～60%，黏度200 mps，山東濰坊海之源生物科技有限公司)。

1.3 保鮮處理

選取質(zhì)量為130～150 g/朵的鮮銀耳，清除菌體表面的雜質(zhì)，噴灑濃度為0.3%殼聚糖和0.05%檸檬酸配置而成的保鮮液20 次(每次劑量為1 mL)。對(duì)照組以蒸餾水噴灑20 次(每次劑量為1 mL)。待銀耳表面液體自然吸收瀝干后，將其放入PE 材質(zhì)的塑料保鮮盒中(每個(gè)盒子裝1 朵銀耳)，覆上PE保鮮膜，置于室溫20 ±2 ℃，相對(duì)濕度80%的環(huán)境中貯藏22 d，定期觀察及取樣測(cè)定。

1.4 測(cè)定方法

1.4.1 銀耳發(fā)病病情指數(shù)測(cè)定

0 級(jí):全朵無(wú)病;1 級(jí):全朵1/4 以下的耳片有少數(shù)病斑;2 級(jí):全朵1/2 以下的耳片有少量病斑或1/4 以下的耳片有較多的病斑數(shù);3 級(jí):全朵3/4 以下的耳片發(fā)病或全朵1/4 以下的耳片完全霉變腐爛;4級(jí):全朵3/4 以上的耳片發(fā)病或全朵1/2 以下的耳片完全霉變腐爛～整朵霉變腐爛。

1.4.2 過(guò)氧化物酶(POD)和多酚氧化酶(PPO)的提取及活力測(cè)定

參照Z(yǔ)auberman 的方法測(cè)定并改進(jìn)［6］。取1.0 g 鮮銀耳樣品，在冰浴條件下研磨成勻漿，于4 ℃、12000 rpm 離心15 min。分別在室溫470 nm 和420 nm 時(shí)測(cè)定吸光值的變化，以每min 吸光值變化0.01 為一個(gè)酶活力單位(U)。重復(fù)三次。

參照王愛(ài)國(guó)的方法并作改進(jìn)測(cè)定［7］。稱取2.0 g 鮮銀耳，在冰浴條件下研磨提取，離心(12000 rpm，20 min，4°C)。取1 mL 上清液，加入0.9 mL 磷酸緩沖液(pH 7.8)和0.1 mL 10 mM 的鹽酸輕胺溶液，在25°C 混合并培養(yǎng)30 min。然后加入1 mL 17 mM 對(duì)氨基苯磺酸和1 mL α-萘胺，于25 ℃保溫40 min。保溫后加入4 mL 正丁醇充分搖動(dòng)，靜置分層后取正丁醇相在530 nm 處測(cè)定OD 值，重復(fù)三次。以KNO2溶液作標(biāo)準(zhǔn)曲線，按濃度的2 倍為的濃度，計(jì)算產(chǎn)生的速率，以μmol/min·gFW 表示。

1.4.4 過(guò)氧化氫(H2O2)含量測(cè)定

H2O2含量的測(cè)定參照Patterson 的方法進(jìn)行測(cè)定并改進(jìn)［8］。取1.0 g 鮮銀耳樣品，加入6.0 mL 經(jīng)4 ℃預(yù)冷的丙酮，在通風(fēng)櫥中冰浴研磨充分，于4℃、12000 rpm 離心20 min，取0.5 mL 上清液，依次加入0.1 mL 10%四氯化鈦-鹽酸溶液和0.2 mL 的濃氨水，混合反5 min，于4 ℃、12000 rpm 離心15 min，沉淀用丙酮洗滌3 次，以消除色素干擾。最后將沉淀加入3.0 mL 2 mol/L H2SO4，待沉淀完全溶解后于412 nm 波長(zhǎng)處比色。以標(biāo)準(zhǔn)H2O2溶液制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。H2O2含量以μmol/g FW 表示。重復(fù)三次。

1.4.5 過(guò)氧化氫酶(CAT)、抗壞血酸過(guò)氧化物酶(APX)的提取及活力測(cè)定

取1.0 g 鮮銀耳，加入3.0 mL 經(jīng)4 ℃預(yù)冷的50 mmol/L 磷酸緩沖液(pH 7.5，含5 mmol/L 二硫代蘇糖醇和2%聚乙烯吡咯烷酮)，在冰浴條件下研磨勻漿，于4 ℃、12000 rpm 離心30 min，收集上清液。

CAT 活性參考Beers、Jr 和Sizer 的方法進(jìn)行并改進(jìn)［9］。取0.05 mL 粗酶提取液加入2.95 mL 20 mmol/L H2O2，于波長(zhǎng)240 nm 處測(cè)吸光度值的變化，以每min 反應(yīng)體系吸光度值變化0.01 定義為1個(gè)酶活性單位(U)，CAT 活性單位以U/g FW 表示。重復(fù)三次。

APX 活性參考Nakano 的方法進(jìn)行并改進(jìn)［10］。取0.05 mL 粗酶提取液依次加入2.65 mL 50 mmol/L 磷酸緩沖液(pH 7.5，含0.1 mmol/L EDTA 和0.5 mmol/L 抗壞血酸)、0.3 mL 0.002 mol/L H2O2，于波長(zhǎng)290 nm 處測(cè)吸光度值的變化，以每min 反應(yīng)體系吸光度值變化0.01 定義為1 個(gè)酶活性單位(U)，APX 活性單位以U/g FW 表示。重復(fù)三次。

1.4.6 超氧化物歧化酶(SOD)的提取及活力測(cè)定

使用南京建成總超氧化物歧化酶(T-SOD)測(cè)試盒測(cè)試(貨號(hào)A001-1-羥胺法)。

酶液制備:取2.0 g 銀耳組織，用7 mL 樣品提取液(pH 7.2，100 mM 磷酸緩沖液)，冰浴研磨勻漿，在4 ℃條件下靜置5 h，在4 ℃條件下10000 rpm離心15 min，上清液用于SOD 活性測(cè)定。

酶活測(cè)定:酶活測(cè)定操作步驟見(jiàn)表1。

表1 酶活測(cè)定試劑Table 1 Reagent for determination of enzyme activity

漩渦混勻器充分混勻，37 ℃水浴40 min 后加入顯色劑，混勻，室溫放置10 min，于波長(zhǎng)550 nm 處，1 cm 光徑，雙蒸水調(diào)零，測(cè)各管吸光值。酶活定義:以每克組織在1 mL 反應(yīng)液中SOD 抑制率大50%所對(duì)應(yīng)的SOD 量定義為1 個(gè)酶活性單位(U)，SOD 活性單位以U/g FW 表示。重復(fù)三次。按如下公式計(jì)算酶活性:

式中:反應(yīng)液總體積為3.4 mL;取樣量為0.1 mL;組織濕重為2.0 g;勻漿介質(zhì)體積為7.0 mL。

1.4.7 抗壞血酸(ASA)含量的測(cè)定

ASA 含量測(cè)定參考Bulk 等的方法進(jìn)行［11］。取5.0 g 鮮銀耳樣品，加入5 mL 2%草酸在冰浴條件下研磨后轉(zhuǎn)入100 mL 容量瓶定容，過(guò)濾，取濾液10.0 mL，用已標(biāo)定的2，6-二氯酚靛酚溶液滴定至微紅色，15 s 不褪色，記錄消耗的2，6-二氯酚靛酚溶液用量，同時(shí)以10.0 mL 2%草酸做空白滴定。鮮銀耳中抗壞血酸含量以mg/100 g 表示。重復(fù)三次。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及圖形分析

用Excel2010 統(tǒng)計(jì)分析所有數(shù)據(jù)，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)誤、制圖;并對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，利用鄧肯式多重比較對(duì)差異顯著性進(jìn)行分析。P＜0.05 表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 殼聚糖處理對(duì)鮮銀耳病情指數(shù)的影響

由圖1 可知，整個(gè)貯藏期間鮮銀耳的殼聚糖處理組病情指數(shù)顯著低于對(duì)照組(P＜0.05)。新鮮銀耳在20 ℃貯藏5 d 時(shí)殼聚糖處理組病情指數(shù)為0，對(duì)照組為2.5;貯藏10 d 時(shí)處理組病情指數(shù)為1.25，對(duì)照組為9.17，對(duì)照組病情指數(shù)約是處理組的7.3 倍;貯藏15 d 時(shí)殼聚糖處理組病情指數(shù)為4.17，對(duì)照組為17.5，對(duì)照組比處理組高4.2 倍。整個(gè)貯藏期間，殼聚糖處理都顯著降低了新鮮銀耳的病情指數(shù)。

圖1 殼聚糖處理對(duì)鮮銀耳病情指數(shù)的影響Fig.1 Effect of chitosan treatment on disease index of fresh T.fuciformis

圖2 殼聚糖處理對(duì)鮮銀耳POD 活性的影響Fig.2 Effect of chitosan treatment on POD activities of fresh T.fuciformis

2.2 殼聚糖處理對(duì)鮮銀耳POD、PPO 活性的影響

過(guò)氧化物酶(POD)是植物細(xì)胞中主要的氧化酶，在許多果蔬上表現(xiàn)為一種衰老酶，其活性提高是果蔬成熟衰老的體現(xiàn)。本研究結(jié)果表明，鮮銀耳的POD 活性在貯藏期間成先上升后下降趨勢(shì)(圖2)，相比對(duì)照組在貯藏5 d 時(shí)POD 活性急劇上升，殼聚糖處理明顯抑制了鮮銀耳的POD 活性，其活性僅為對(duì)照組的42.1%，差異顯著(P＜0.05)。在整個(gè)貯藏期內(nèi)，殼聚糖處理組POD 活性都低于對(duì)照組，這表明殼聚糖對(duì)鮮銀耳POD 活性的上升有抑制作用，從而延緩褐變、衰老，延長(zhǎng)鮮銀耳的貯藏保鮮期。

圖3 殼聚糖處理對(duì)鮮銀耳PPO 活性的影響Fig.3 Effect of chitosan treatment on PPO activities of fresh T.fuciformis

多酚氧化酶不僅是引起植物體褐變的重要酶之一，而且與植物體的抗病性有關(guān)。鮮銀耳PPO 活性在貯藏期間呈下降趨勢(shì)(圖3)。但殼聚糖處理可延緩鮮銀耳PPO 活性下降，在貯藏5、10、22 d 時(shí)均高于對(duì)照，這表明殼聚糖處理提高了鮮銀耳PPO 活性。

圖4 殼聚糖處理對(duì)鮮銀耳含量的影響Fig.4 Effect of chitosan treatment on content of fresh T.fuciformis

2.3 殼聚糖處理對(duì)鮮銀耳和H2O2含量的影響

鮮銀耳H2O2含量水平在貯藏初期無(wú)明顯變化(圖5)，從第10 d 開(kāi)始下降，15 d 后又有所上升。

圖5 殼聚糖處理對(duì)鮮銀耳H2O2含量的影響Fig.5 Effect of chitosan treatment on H2O2content of fresh T.fuciformis

殼聚糖處理鮮銀耳H2O2含量在貯藏中后期一直低于對(duì)照，15 d 和22 d 處理組H2O2含量比對(duì)照低33.9%和50.3%，差異顯著(P＜0.05)。

2.4 殼聚糖處理對(duì)鮮銀耳CAT、SOD 活性的影響

CAT 和SOD 在生物體清除體內(nèi)自由基、延緩衰老等方面有著重要的作用。鮮銀耳CAT 活性在貯藏期間呈逐漸上升趨勢(shì)(圖6)，而殼聚糖處理可顯著誘導(dǎo)提高鮮銀耳貯藏前期的CAT 活性，第5 d 和第10 d 時(shí)其活性分別是是對(duì)照組的2.4 和2.9 倍，差異顯著(P＜0.05)。第15 d 時(shí)處理組CAT 活性有所下降，可能與H2O2在后期積累降低有關(guān)。

殼聚糖處理有提高鮮銀耳SOD 活性提高的作用(圖7)，貯藏第10 d 及15 d 時(shí)，處理組SOD 活性為對(duì)照組的2.18 和1.31 倍，差異顯著(P＜0.05)。SOD 是活性氧清除反應(yīng)中第一個(gè)發(fā)揮作用的抗氧化酶，它催化發(fā)生歧化反應(yīng)，生成H2O2和分子氧，從而清除了。處理組SOD 活性在貯藏期間呈上升趨勢(shì)，與含量在貯藏后期逐漸下降的結(jié)果一致。

圖6 殼聚糖處理對(duì)鮮銀耳CAT 活性的影響Fig.6 Effect of chitosan treatment on CAT activities of fresh T.fuciformis

圖7 殼聚糖處理對(duì)鮮銀耳SOD 活性的影響Fig.7 Effect of chitosan treatment on SOD activities of fresh T.fuciformis

2.5 殼聚糖處理對(duì)鮮銀耳APX 活性及ASA 含量的影響

鮮銀耳貯藏期間APX 活性呈先上升后下降趨勢(shì)(圖8)。處理組與對(duì)照組的APX 活性分別在第5 d 和第15 d 達(dá)到峰值，第5 d 時(shí)，處理組銀耳APX活性為對(duì)照組的1.76 倍，差異顯著(P＜0.05)，說(shuō)明殼聚糖處理在貯藏初期促進(jìn)了APX 活性，并將其峰值提前。處理組APX 活性在第5 d 得到誘導(dǎo)提高后，在第10 d 后開(kāi)始下降，與H2O2在后期積累不斷降低的結(jié)果一致。

圖8 殼聚糖處理對(duì)鮮銀耳APX 活性的影響Fig.8 Effect of chitosan treatment on APX activities of fresh T.fuciformis

圖9 殼聚糖處理對(duì)鮮銀耳抗壞血酸含量的影響Fig.9 Effect of chitosan treatment on ASA content of fresh T.fuciformis

ASA 作為氧化還原代謝產(chǎn)物，在APX 作用下清除掉果蔬體內(nèi)多余有害的活性氧。殼聚糖處理鮮銀耳ASA 含量在貯藏前期高于對(duì)照，貯藏后期低于對(duì)照，此趨勢(shì)與APX 活性相對(duì)應(yīng)(圖9)。

3 小結(jié)與討論

銀耳是一種采后生理活動(dòng)旺盛、極易腐爛變質(zhì)的食用菌，本研究使用殼聚糖對(duì)其進(jìn)行保鮮處理，結(jié)果顯示殼聚糖處理明顯降低了新鮮銀耳的腐爛發(fā)病程度(圖1)，這不僅與殼聚糖良好的抗菌作用和成膜性有關(guān)，可能還與其誘導(dǎo)活性氧代謝作用有關(guān)。有大量研究表明，殼聚糖對(duì)誘導(dǎo)提高果蔬活性氧代謝，增強(qiáng)果蔬抗病性有著顯著的作用［12，13］。

POD、PPO 都是果蔬體內(nèi)誘導(dǎo)抗病性的重要酶類。POD 催化可產(chǎn)生自由基產(chǎn)物，造成膜脂過(guò)氧化，從而加劇組織褐變。因此，POD 活性可作為果實(shí)成熟和衰老的指標(biāo)之一。PPO 可催化木質(zhì)素及其它酚類氧化產(chǎn)物的形成，構(gòu)成保護(hù)性屏蔽而抵抗病菌的入侵［14］。PPO 也可將酚類物質(zhì)氧化成高毒性的醌類物質(zhì)從而可對(duì)入侵病原物進(jìn)行毒殺［15］。本研究結(jié)果表明，殼聚糖提高了鮮銀耳PPO 活性(圖3)，對(duì)鮮銀耳POD 活性的上升有抑制作用(圖2)，說(shuō)明殼聚糖可誘導(dǎo)鮮銀耳抗病性增強(qiáng)，延緩褐變、衰老，延長(zhǎng)鮮銀耳的貯藏保鮮期。

在植物體的抗病反應(yīng)中，活性氧(reactive oxygen species，ROS)爆發(fā)在早期抗病反應(yīng)中起著重要的作用［16，17］，包括直接的抗菌功能，促進(jìn)細(xì)胞壁的木質(zhì)化等，爆發(fā)的活性氧分子如超氧陰離子(superoxide anion，)和過(guò)氧化氫(hydrogen peroxide，H2O2)可作為過(guò)氧化物合成酶信號(hào)途徑的第二信使，通過(guò)產(chǎn)生其它信號(hào)，如水楊酸(salicylic acid，SA)，在誘導(dǎo)植保素信號(hào)中起作用［18］。H2O2參與細(xì)胞壁蛋白的氧化交聯(lián)和木質(zhì)素的形成，同時(shí)還對(duì)微生物有直接的毒性［19，20］。許多研究表明，在誘導(dǎo)處理的前期，果蔬體內(nèi)的活性氧水平迅速升高［21］，本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果與上述結(jié)果相似，殼聚糖處理在貯藏初期即第5 d 時(shí)促進(jìn)了鮮銀耳H2O2和的含量的積累(圖4、圖5)，表明殼聚糖處理誘導(dǎo)了鮮銀耳體內(nèi)的活性氧爆發(fā)，而H2O2和可能是銀耳抗病信號(hào)傳遞途徑中的重要組分。

H2O2在CAT、POD 以及抗壞血酸-谷胱甘肽循環(huán)系統(tǒng)作用下轉(zhuǎn)變?yōu)樗头肿友酰?2］。本研究結(jié)果表明，殼聚糖處理能顯著提高新鮮銀耳的CAT、SOD活性(圖6、圖7)，這與李成華在用殼聚糖在雙孢菇上的研究的結(jié)果一致［3］。鮮銀耳的SOD 活性被殼聚糖誘導(dǎo)提高，而后在SOD 作用下被歧化分解，所以貯藏后期含量下降;CAT、APX 活性的提高也使H2O2含量逐漸下降。

綜上所述，殼聚糖在貯藏初期通過(guò)誘導(dǎo)銀耳體內(nèi)的活性氧爆發(fā)，激發(fā)銀耳體內(nèi)包括SOD、CAT、APX 等一系列酶以清除活性氧，同時(shí)提高PPO 活性以增強(qiáng)抗病性，從而達(dá)到保鮮新鮮銀耳的目的。

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