張馳翔，王 周，朱奇奇，蒲 博，焦士蓉

西華大學(xué)生物工程學(xué)院，成都 610039

黃連(C.chinensis)是常見(jiàn)的抗菌消炎中藥，臨床上長(zhǎng)期用于抗腸道細(xì)菌感染、降熱鎮(zhèn)痛?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)證明，其特殊的藥理性質(zhì)主要與其根莖中所含生物堿相關(guān)，其中主要包括小檗堿、黃連堿、巴馬汀、藥根堿［1］，其分子結(jié)構(gòu)均屬異喹啉生物堿。關(guān)于黃連提取物中主要成分生物堿的抑制細(xì)菌實(shí)驗(yàn)，其中小檗堿的抑菌活性最大，黃連堿和巴馬汀次之，藥根堿最?。?］。4 種黃連生物堿對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌的抑制活性大于革蘭氏陰性菌和酵母菌。為開(kāi)發(fā)新型真菌抑制劑提供方向。

植物病原真菌是引起農(nóng)作物病害的主要原因，是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中重大的問(wèn)題，因此選取五種常見(jiàn)的植物病原真菌小麥赤霉菌、水稻立枯絲病菌、玉米小斑病菌、番茄灰霉菌和油菜菌核病菌為實(shí)驗(yàn)對(duì)象。本文主要對(duì)黃連提取物抑制真菌作用進(jìn)行了測(cè)定，并對(duì)其抑制機(jī)理進(jìn)行了初步探究。

1 儀器與材料

DHG-9070A 型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，HH-S 型數(shù)顯恒溫水浴鍋，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀RE-52B，SHZ-D(II)循環(huán)水式真空泵，TB-214 型電子天平，F(xiàn)DU-1100 冷凍干燥機(jī)，超低溫冰箱Heto Mltra Freeze MF 3410，DL-1 萬(wàn)能電爐，YJ-875 醫(yī)用凈化工作臺(tái)，自動(dòng)臺(tái)式滅菌器，SGSP-02 電熱恒溫隔水式培養(yǎng)箱，萬(wàn)能視頻成像裝置(成都勵(lì)揚(yáng)精密機(jī)電有限公司)，UV-2600型紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)等。

分析純葡萄糖(成都市科龍化工試劑廠)，瓊脂粉(成都市科龍化工試劑廠)，硫酸鏈霉素原藥(Amresco.0382)。

小麥赤霉菌(Gibberella zeae，子囊菌亞門(mén)，ACCC編號(hào):31053)，水稻立枯絲病菌(Rhizoctonia solani，半知菌亞門(mén)，ACCC 編號(hào):30374)，玉米小斑病菌(Helminthosporium maydis，半知菌亞門(mén)，ACCC 編號(hào):30138)，番茄灰霉菌(Botrytis cinerea，半知菌亞門(mén)，ACCC 編號(hào):30387)，油菜菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum，子囊菌亞門(mén)，ACCC 編號(hào):36169)，菌種均購(gòu)自中國(guó)農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏。

西華大學(xué)生物工程學(xué)院提供黃連提取物成品(小檗堿≧19.09%，巴馬汀≧4.90%，藥根堿≧2.79%)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 平板生長(zhǎng)速率法

將黃連提取物溶解于無(wú)菌水中(濃度為50 mg/mL 溶液)，采用平板生長(zhǎng)速率法，在無(wú)菌條件下接入含毒培養(yǎng)基和對(duì)照培養(yǎng)基的中心，適宜溫度下分別恒溫培養(yǎng)一段時(shí)間后采用十字交叉法測(cè)量菌落直徑取其平均值［3，4］。通過(guò)以下公式計(jì)算其相對(duì)抑菌率:

2.2 二倍稀釋平板生長(zhǎng)速率法

初篩后抑菌活性達(dá)90%以上的菌株，采用二倍稀釋法，重復(fù)處理3 次，按照2.1 方法培養(yǎng)一段時(shí)間測(cè)量菌落直徑取其平均值。通過(guò)以下公式計(jì)算其相對(duì)抑菌率，再根據(jù)幾率值分析法，采用SPSS 軟件計(jì)算EC50值及其置信區(qū)間并求出相關(guān)系數(shù)和回歸方程。

2.3 孢子形成的抑制作用測(cè)定方法

將抑菌穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)中培養(yǎng)6 d 的各處理和對(duì)照組，用Φ=6.0 mm 打孔器于距菌落邊緣3～4 mm處打取菌塊，用無(wú)菌水將菌塊上的孢子洗下，血球計(jì)數(shù)板在光學(xué)顯微鏡下直接計(jì)孢子數(shù)，每塊菌重復(fù)3次。用下列公式計(jì)算形成孢子數(shù)量及對(duì)孢子形成的抑制率［5］:

2.4 孢子萌發(fā)的抑制作用測(cè)定方法

采用凹玻片培養(yǎng)法［6］，室溫下培養(yǎng)。孢子萌發(fā)以芽管的長(zhǎng)度超過(guò)孢子的直徑長(zhǎng)度的一半為準(zhǔn)，每?jī)尚r(shí)計(jì)數(shù)一次，直至陰性對(duì)照萌發(fā)率達(dá)到50%以上，每個(gè)片選3 個(gè)視野計(jì)數(shù)，最后9 個(gè)觀察數(shù)據(jù)平均作為試驗(yàn)數(shù)據(jù)。用下列公式計(jì)算孢子萌發(fā)抑制率，計(jì)算出毒力回歸方程式、EC50及相關(guān)系數(shù)。

2.5 對(duì)菌絲形態(tài)的影響

將培養(yǎng)的各處理和對(duì)照菌落，在恒溫培養(yǎng)6 d后，用撥針挑取病原菌菌落邊緣的菌絲體和正常菌絲體制成玻片標(biāo)本，在顯微鏡下觀察病源菌菌絲形態(tài)［7］。

2.6 對(duì)菌絲形態(tài)的影響

2.6.1 電導(dǎo)率的測(cè)定方法

將菌種接種在PDA 培養(yǎng)基上培養(yǎng)4 d，用直徑6 mm 的打孔器沿菌落邊緣打取菌餅，移入PDB 培養(yǎng)基內(nèi)，120 rpm 振蕩培養(yǎng)5 d。然后將培養(yǎng)液抽濾，菌絲用生理鹽水沖洗干凈，備用。稱(chēng)取2 g 菌絲放入50 mL 燒杯中，使用無(wú)菌去離子水清洗3 次。加入20 mL 去離子水和供試提取液，使藥液呈濃度梯度。然后分別在0、5、15、30、60、90 和120 min 時(shí)測(cè)定電導(dǎo)率，重復(fù)3 次［8］。

2.6.2 總多糖的測(cè)定

總多糖采用蒽酮比色法測(cè)定，參考鐘芳曉［9］的實(shí)驗(yàn)方法。

2.6.3 總蛋白質(zhì)的測(cè)定

蛋白質(zhì)的測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)G250 染色法［10］。

3 結(jié)果與討論

3.1 黃連提取物抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1.1 提取物抑菌初篩

按照2.1 實(shí)驗(yàn)方法，以多菌靈為參考組進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)下表1。

從上表可知，黃連提取物對(duì)于小麥赤霉菌、玉米小斑菌、番茄灰霉菌、油菜菌核菌四種真菌具有較好的抑制率。

3.1.2 提取物抑菌穩(wěn)定性

按照2.2 實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)一步篩選，測(cè)定其穩(wěn)定性，結(jié)果見(jiàn)下表2。

表1 抑菌實(shí)驗(yàn)初篩Table 1 Prelimiary screening of antifungal activity

表2 抑菌實(shí)驗(yàn)穩(wěn)定性Table 2 Stability of antifungal experiments

由上表可知，4 種菌的穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果經(jīng)SPSS軟件計(jì)算，分析可得其檢驗(yàn)結(jié)果可靠，進(jìn)一步說(shuō)明黃連提取物對(duì)于4 種菌具有較好的抑制作用。

3.2 黃連水提取物對(duì)真菌抑制機(jī)理初探

3.2.1 提取物對(duì)真菌孢子形成的影響

按照2.3 的實(shí)驗(yàn)方法，將提取物配制成濃度為1.5、0.75、0.375、0.188、0.094 mg/mL 的PDA 培養(yǎng)基，接種油菜菌核菌28 ℃培養(yǎng)6 d，測(cè)定其孢子數(shù)并計(jì)算孢子形成抑制率，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下。

圖1 提取物對(duì)油菜菌核菌孢子形成的影響Fig.1 Effects of extract on formation of S.sclerotiorum spores

圖2 提取物對(duì)油菜菌核菌孢子形成的抑制作用Fig.2 Inhibition of extract against formation of S.sclerotiorum spores

從圖1 及圖2 可以看出，黃連提取物對(duì)油菜菌核菌孢子形成有一定的抑制作用。隨著提取物濃度的增大抑制率也增加，當(dāng)處理組濃度為1.5 mg/mL時(shí)抑制率達(dá)到59.54%。

3.2.2 提取物對(duì)真菌孢子萌發(fā)的影響

按照2.4 的實(shí)驗(yàn)方法，提取物制成濃度為1.5、0.75、0.375、0.188、0.094 mg/mL 的溶液，在凹面載玻片上進(jìn)行孢子萌發(fā)率的測(cè)定，結(jié)果如圖3 和表3。

圖3 提取物對(duì)油菜菌核菌孢子萌發(fā)影響Fig.3 Effects of extract on formation of S.sclerotiorum spores

從上表可以看出，黃連提取物對(duì)油菜菌核菌孢子萌發(fā)有較好地抑制作用。當(dāng)提取物濃度達(dá)到1.5 mg/mL 的時(shí)候，抑制率達(dá)到76.19%，具有較好的抑制效果，其EC50為0.478 mg/mL。

3.2.3 提取物對(duì)真菌菌絲形態(tài)的影響

按照2.5 的實(shí)驗(yàn)方法，將黃連提取物配制成濃度為1.5 mg/mL 的PDA 培養(yǎng)基，接種油菜菌核菌培養(yǎng)6 d，挑取菌絲進(jìn)行顯微鏡測(cè)定，結(jié)果如下。

表3 提取物對(duì)油菜菌核菌孢子萌發(fā)毒力測(cè)定結(jié)果Table 3 Toxicity of extract against formation of S.sclerotiorum spores

圖4 提取物對(duì)油菜菌核菌菌絲形態(tài)的影響Fig.4 Effects of extract on mycelial shape of S.sclerotiorum

從上圖可知，經(jīng)黃連提取物處理后的油菜菌核菌菌絲形態(tài)與對(duì)照組菌絲形態(tài)沒(méi)有較大差別。

3.2.4 提取物對(duì)真菌菌膜通透性的影響

3.2.4.1 電導(dǎo)率測(cè)定結(jié)果

按照2.6.1 的實(shí)驗(yàn)方法，將黃連提取物配制成濃為1.5、0.75、0.375、0.188、0.094 mg/mL 的溶液，分別加入2 g 油菜菌核菌菌絲，于5、15、30、60、90、120 min 時(shí)測(cè)定電導(dǎo)率，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5。

圖5 提取物對(duì)油菜菌核菌菌體細(xì)胞膜滲透性的影響Fig.5 Effect of extract on permeability of cell membranes of S.sclerotiorum

從上圖可以看出，油菜菌核菌在加入藥液后培養(yǎng)一段時(shí)間電導(dǎo)率有所增大，說(shuō)明菌絲內(nèi)電解質(zhì)滲漏。在濃度為0.094、0.188、0.375 mg/mL 時(shí)電導(dǎo)率變化不大，濃度為1.5 mg/mL 時(shí)電導(dǎo)率大大增加了，說(shuō)明高濃度提取物對(duì)油菜菌核菌細(xì)胞體滲透性有明顯效果。

3.2.4.2 膜外滲透總多糖測(cè)定結(jié)果

按照2.6.2 的實(shí)驗(yàn)方法，將黃連提取物配制成濃為1.5、0.75、0.375、0.188、0.094 mg/mL 的溶液，分別加入2 g 油菜菌核菌菌絲，28 ℃培養(yǎng)48 h，離心，上清液測(cè)定總多糖含量。

圖6 提取物對(duì)油菜菌核菌膜外總多糖含量的影響Fig.6 Effect of extract on soluble polysaccharide content of S.sclerotiorum

從圖6 可知，加入黃連提取物處理后油菜菌核菌菌絲總多糖的滲透量隨著加入濃度的增加而增大。陰性對(duì)照組的滲透量為0.45 mg/g，加入樣液后滲透量增大。

3.2.4.3 膜外滲透總蛋白質(zhì)測(cè)定結(jié)果

按照2.6.3 的實(shí)驗(yàn)方法，將黃連提取物配制成濃為1.5、0.75、0.375、0.188、0.094 mg/mL 的溶液，分別加入2 g 油菜菌核菌菌絲，28 ℃培養(yǎng)48 h，離心，上清液測(cè)定蛋白質(zhì)含量。

圖7 提取物對(duì)油菜菌核菌膜外蛋白質(zhì)含量的影響Fig.7 Effect of extract on soluble protein content of S.sclerotiorum

油菜菌核菌蛋白質(zhì)滲透量隨著加入提取物的濃度增大而增加。對(duì)照的滲透量為0.57 mg/g。加入提取物濃度為1.5 mg/mL 時(shí)，蛋白質(zhì)滲透量為1.1 mg/g，說(shuō)明高濃度的提取物對(duì)油菜菌核菌細(xì)胞膜通透性有較大影響。

4 結(jié)論

抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，黃連提取物對(duì)于五種常見(jiàn)植物病原真菌均具有一定的抑制，以市面上常用的多菌靈為參考，提取物對(duì)小麥赤霉菌、玉米小斑菌、番茄灰霉菌、油菜菌核菌四種真菌具有較好的抑制率，為新型真菌抑制劑開(kāi)發(fā)做了基礎(chǔ)。

抑菌實(shí)驗(yàn)機(jī)理初探顯示，黃連水提物對(duì)油菜菌核菌孢子的形成有一定的抑制作用，對(duì)孢子的萌發(fā)也有明顯的作用。處理后的油菜菌核菌菌絲沒(méi)有明顯變化。電導(dǎo)率隨著處理液濃度增加而增大，胞外多糖和蛋白質(zhì)的滲透量也隨之增大。表明提取物能抑制油菜菌核菌孢子的形成及萌發(fā)，增大了細(xì)胞膜通透性。

1 Ma HM(馬紅梅)，Chen G(陳剛)，Li W(李文)，et al.Chemical composition the separation and identification of Rhizoma coptidis.J Shengyang Pharm Univ(沈陽(yáng)藥科大學(xué)學(xué)報(bào))，2011，9:695-699.

2 Yang Y(楊勇)，Ye XL(葉小利)，Li XG(李學(xué)剛).Antimicrobial effect of four alkaloids from Coptidis rhizome.Lishizhen Med Mater Med Res(時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥)，2007，18:3013-3014.

3 Yin SW(殷帥文)，Wang QX(王慶先)，Li Q(李強(qiáng))，et al.Antifungal activity of twenty common plant extracts againsttwo plant fungi:Flavonoids from Lycoris aurea.Nat Prod Res Dev (天然產(chǎn)物研究與開(kāi)發(fā))，2009，21:306-311.

4 Feng H，Zhang CX，Liu J，et al.Synthesis and fungicidal activity of 2-(3-fluorophenylcarbamoyl)phenyl acetate.3thed Asian J Chem，2013，25:4541-4543.

5 Fang ZD(方中達(dá)).Plant disease research method (植病研究方法，第三版)，1998.152.

6 Zhang JY(張繼英)，Qi YC(戚元成)，Wang LQ(王蘭青).Some bactericide put miscellaneous comparison experiment.Edible Fungi (食用菌)，2009，3:68-70.

7 Zhang XH(張新虎)，He J(何靜)，Shen HM(沈慧敏).Siberian cocklebur extract of tomato gray mold inhibitory effect and antibacterial mechanism.Acta Pratacul Sin(草業(yè)學(xué)報(bào))，2008，17(3):99-104.

8 Li HS(李合生).Biochemical experiment technology of plant physiology.Beijing:Higher Education Press，2000.

9 Zhong FX(鐘方曉)，Ren HH(任海華)，Li Y(李巖).Comparison of methods determination of polysaccharide content.Lishizhen Med Mater Med Res(時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥)，2007，18:1916-1917.

10 Li ZJ(李志江).Study on determination of protein content of beer by coomassie brilliant G-250 dyebinding.Liquor Making(釀酒)，2008，(35):70-72.