于婷婷，李 強，王茂青，何 朋，尚 坤，吳秀菊*

1東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150030;2 黑龍江省農(nóng)墾總局科研育種中心，哈爾濱 150036

馬鈴薯(Solanum tuberosum L.)是我國重要的經(jīng)濟作物，其產(chǎn)量和種植面積隨產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)的調(diào)整逐年增加［1］，而塊莖腐爛是影響馬鈴薯產(chǎn)量和品質(zhì)的主要限制因素之一，其中由鐮刀菌引發(fā)的干腐病是馬鈴薯貯藏期間引起塊莖腐爛最常見的病害，可導(dǎo)致窖儲損失率高達60%，造成重大經(jīng)濟損失［2，3］。目前防治馬鈴薯干腐病的方法主要是在貯藏過程中保持干燥通風及以奧力克-霉止、多菌靈等農(nóng)藥消毒種薯，但隨之會產(chǎn)生病原菌抗藥性、農(nóng)藥長時間殘留、高毒性、高污染等問題［4，5］。因此開發(fā)環(huán)境友好、作用方式特異、對非靶標生物相對安全等特點的植物源農(nóng)藥倍受人們的關(guān)注［6，7］。

北細辛又名遼細辛，為馬兜鈴科細辛屬多年生藥用植物，除具有解熱、鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛等藥效外［8］，還有良好的殺蟲作用和一定的抗菌活性［9-11］。近年來研究表明，北細辛獨特的藥理作用，主要與其揮發(fā)油有關(guān)［12］。北細辛揮發(fā)油對灰霉病菌(Botrytis cinerea Pers.)等5 種黃瓜致病菌、茄子黃萎病致病菌大麗輪枝菌(Verticillium dahliae Kleb)、4 種人參致病菌均有良好的抑制效果［13-15］。作為植物源農(nóng)藥，北細辛具有一定的開發(fā)應(yīng)用前景。

本試驗探究了北細辛揮發(fā)油對5 種馬鈴薯干腐病致病菌鐮刀菌的抑菌效果，以期為馬鈴薯干腐病的有效防治和基于北細辛的植物源農(nóng)藥開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試植物北細辛(遼細辛)購于黑龍江省藥材市場，經(jīng)黑龍江省中醫(yī)藥大學(xué)王振月教授鑒定為馬兜鈴科細辛屬北細辛。供試菌種為引起馬鈴薯干腐病的5 種病原菌，分別為擬枝孢鐮刀菌(Fusarium sporotrichioides)、擬絲孢鐮刀菌(F.trichothecioides)、黃色鐮刀菌(F.culmorum)、燕麥鐮刀菌(F.avenaceum)、茄病鐮刀菌藍色變種(F.solani var.coeruleum)。5 種病原菌均由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)李鳳蘭老師提供，保存于本實驗室。

供試培養(yǎng)基為PDA 培養(yǎng)基和VBC 培養(yǎng)基。

1.2 方法

1.2.1 揮發(fā)油的提取

北細辛全株陰干，用粉碎機粉碎后過40 目篩，放在通風干燥處備用。稱取100 g 粉末，以1∶10 的料液比加入1000 mL 蒸餾水，超聲輔助浸提60 min后，用水蒸氣蒸餾法提取揮發(fā)油，重復(fù)3 次，揮發(fā)油提取率為2.1%。揮發(fā)油置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 菌種的活化

將保存在4 ℃的5 種鐮刀菌于室溫下恢復(fù)幾分鐘，然后挑取少量菌絲接種于PDA 培養(yǎng)基上，并置于25～28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待用。

1.2.3 揮發(fā)油對菌絲生長活性的抑制作用

采用菌絲生長速率法，用適量吐溫60 助溶揮發(fā)油后，加入到PDA 培養(yǎng)基中，配成質(zhì)量濃度為1.0、0.5、0.25、0.125、0.0625、0.0313 g/L 的培養(yǎng)基，以等體積的吐溫60 作為對照(CK)，充分搖勻后，倒入培養(yǎng)皿中制成平板。待凝固后，每個平板中央接入1 個直徑0.5 cm 的菌餅，每一菌種、每個梯度設(shè)3個重復(fù)。然后置于25～28 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，96 h 后采用十字交叉法測菌落直徑，取平均值，按下式計算菌絲抑制率。

菌絲抑制率(%)=(對照組菌落直徑-處理組菌落直徑)/(對照組菌落直徑-0.5)×100%

以菌絲抑制率為橫坐標，揮發(fā)油質(zhì)量濃度為縱坐標，繪制毒力回歸方程，并計算得出半抑制濃度IC50。

1.2.4 揮發(fā)油對鐮刀菌孢子萌發(fā)的抑制作用

以VBC 培養(yǎng)基誘導(dǎo)產(chǎn)生大量孢子，采用凹玻片法測定孢子的萌發(fā)率。具體做法是取在VBC 培養(yǎng)基上培養(yǎng)6～7 d 的鐮刀菌，以無菌水將孢子沖洗下，用4 層紗布過濾，將濾液充分搖勻制成孢子懸浮液，調(diào)節(jié)其濃度，在10 ×10 低倍鏡下觀察，每個視野50～60 個孢子。用少量吐溫60 溶解揮發(fā)油，與孢子懸液混合配成質(zhì)量濃度分別為0.1、0.2、0.4、0.8 g/L 的孢子懸液，以無菌水作為空白對照。在凹玻片上分別滴入1 滴含不同質(zhì)量濃度揮發(fā)油的孢子懸浮液。將凹玻片放在一個含有吸水濾紙的培養(yǎng)皿中，置于25～28 ℃培養(yǎng)箱中，12 h 后鏡檢，觀察孢子萌發(fā)情況，統(tǒng)計100～150 個孢子，每個處理重復(fù)3次。按下列公式計算孢子萌發(fā)率和孢子抑制率。

孢子萌發(fā)率(%)=萌發(fā)孢子數(shù)/總孢子數(shù)×100%

孢子抑制率(%)=(對照組萌發(fā)率-處理組萌發(fā)率)/對照組萌發(fā)率×100%

以孢子抑制率為橫坐標，揮發(fā)油質(zhì)量濃度為縱坐標，繪制毒力回歸方程，并計算得出IC50。

1.2.5 地上部分和地下部分揮發(fā)油的提取

分別以水蒸氣蒸餾法和超聲輔助浸提法對北細辛地上部分和地下部分進行揮發(fā)油的提取，獲得A(地上部分水蒸氣蒸餾法)、B(地下部分水蒸氣蒸餾法)、C(地上部分超聲輔助浸提法)和D(地下部分超聲輔助浸提法)等4 組揮發(fā)油。每次稱取50 g 植株粉末，每組設(shè)3 次重復(fù)。揮發(fā)油經(jīng)無水硫酸鈉干燥后，以安捷倫7890A-5975c 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀進行GC-MS 分析。GC-MS 分析條件參照李凡海等［16］。

1.3 數(shù)據(jù)分析

應(yīng)用SPSS 17.0 統(tǒng)計分析軟件對試驗數(shù)據(jù)進行方差分析，并進行Duncan’s 多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 揮發(fā)油對5 種鐮刀菌菌絲生長的影響

采用二倍稀釋法設(shè)置濃度梯度，考察不同濃度揮發(fā)油對5 種鐮刀菌菌落直徑的抑制作用。由表1可以看出，0.0313～1 g/L 的揮發(fā)油均可抑制供試鐮刀菌的菌落直徑，抑制效果隨揮發(fā)油質(zhì)量濃度的升高而增加。與對照(不加揮發(fā)油)相比，當揮發(fā)油濃度為0.0313 g/L 時，對供試鐮刀菌菌落直徑的抑制作用均達極顯著水平(P＜0.01)。可見，北細辛揮發(fā)油對供試鐮刀菌有良好的抑制作用。

由表1 可知，隨著質(zhì)量濃度的增加，北細辛揮發(fā)油對5 種鐮刀菌菌絲生長的抑制作用明顯增強。通過5 個線性毒力回歸方程(y=ax +b)，得出半抑制濃度(IC50)均小于0.5 g/L，說明北細辛揮發(fā)油對5種供試鐮刀菌菌絲生長均具有較強的抑制作用。比較半抑制濃度IC50，燕麥鐮刀菌＜黃色鐮刀菌＜擬絲孢鐮刀菌＜擬枝孢鐮刀菌＜茄病鐮刀菌藍色變種。其中，對燕麥鐮刀IC50為0.148 g/L，說明揮發(fā)油對燕麥鐮刀菌菌絲生長的抑制效果最顯著;其次為對黃色鐮刀菌、擬絲孢鐮刀菌和擬枝孢鐮刀菌，IC50在0.228～0.333 g/L;對茄病鐮刀菌藍色變種菌絲生長的抑制作用最弱，IC50為0.387 g/L。當揮發(fā)油質(zhì)量濃度為1 g/L 時，對燕麥鐮刀菌、黃色鐮刀菌具有殺菌的作用。

表1 揮發(fā)油對5 種鐮刀菌菌絲生長的抑制作用Table 1 Inhibitory effects of essential oil on the mycelial growth of five Fusariums

2.2 揮發(fā)油對5 種鐮刀菌孢子萌發(fā)的影響

由表2 可知，北細辛揮發(fā)油對5 種鐮刀菌孢子萌發(fā)均有明顯的抑制作用，除茄病鐮刀菌藍色變種外，對其它4 種鐮刀菌的IC50均小于0.5 g/L。隨著揮發(fā)油濃度的增加，萌發(fā)率減小，抑制率增加。比較半抑制濃度IC50，燕麥鐮刀菌＜擬枝孢鐮刀菌＜黃色鐮刀菌＜擬絲孢鐮刀菌＜茄病鐮刀菌藍色變種，說明揮發(fā)油對燕麥鐮刀菌孢子萌發(fā)的抑制效果最好。

表2 揮發(fā)油對5 種鐮刀菌孢子萌發(fā)的抑制作用Table 2 Inhibitory effects of A.heterotropoides essential oil on the germination of Fusarium spores

注:“x”代表抑制率，“y”代表揮發(fā)油濃度。Note:“x”represents the inhibition rate，“y”represents concentration of essential oil.

2.3 不同提取方法下地上部分和地下部分揮發(fā)油提取率的比較

采用水蒸氣蒸餾法和超聲輔助浸提法分別對地上部分和地下部分揮發(fā)油進行提取，每次稱取50 g樣品，每組設(shè)3 次重復(fù)，結(jié)果如表3 所示?？芍?，地下部分揮發(fā)油含量明顯高于地下部分，且超聲輔助浸提法提取率更高，而且出油很快，大大縮短了提取時間，從而節(jié)省了工藝時間。

表3 四組揮發(fā)油提取率的比較Table 3 Comparison of extraction rates of 4 groups of essential oils

2.4 GC-MS 分析結(jié)果

各取4 種北細辛揮發(fā)油1 μL 注入GC-MS 聯(lián)用儀進行分析，得到4 個總離子流色譜圖，見圖1。通過檢索NIST 05 標準譜庫，并結(jié)合質(zhì)譜裂解規(guī)律進行核對，共鑒定出51 種成分，并采用峰面積歸一法計算各化學(xué)成分的相對含量，結(jié)果見表4。

其中，地上部分水蒸氣蒸餾法揮發(fā)油中分離出74 個化學(xué)成分，鑒定了32 個成分，已鑒定成分占揮發(fā)油總量的96.081%;地下部分水蒸氣蒸餾法揮發(fā)油中分離出61 個化學(xué)成分，鑒定出31 個成分，已鑒定成分占揮發(fā)油總量的95.713%;地上部分超聲輔助浸提法揮發(fā)油中分離出105 個化學(xué)成分，鑒定出36 個成分，已鑒定成分占揮發(fā)油總量的94.858%;地下部分超聲輔助浸提法揮發(fā)油中分離出42 個化學(xué)成分，鑒定出28 個成分;已鑒定成分占揮發(fā)油總量的98.374%。4 種揮發(fā)油中共有18 種相同成分，其中包括甲基丁香酚、黃樟醚、3，4，5-三甲氧基甲苯、3，5-二甲氧基甲苯、優(yōu)香芹酮等，分別占4 種揮發(fā)油含量的66.5%、81.54%、66.85%、85.44%。可見地下部分揮發(fā)油中主要成分比地上部分含量高。

圖1 地上部分水蒸氣蒸餾法(A)、地下部分水蒸氣蒸餾法(B)、地上部分超聲輔助浸提法(C)及地下部分超聲輔助浸提法(D)提取揮發(fā)油總離子流色譜圖Fig.1 Total ion chromatograms of essential oils of aerial (A)or underground (B)part extracted by steam distillation and aerial(C)or underground (D)part extracted by ultrasonic-assisted extraction

表4 四組揮發(fā)油成分的GC-MS 分析結(jié)果Table 4 Chemical composition of four groups of essential oils

注:“-”表示未檢出。Note:“-”represents not detected.

3 討論

由鐮刀菌引發(fā)的馬鈴薯干腐病發(fā)病率高，危害嚴重。目前主要依靠化學(xué)農(nóng)藥進行防治。雖然防治效果顯著，但病原菌極易產(chǎn)生抗藥性，同時危害對人類健康和環(huán)境。而植物源農(nóng)藥來源于植物，污染較小，易降解，使用效果好，是發(fā)展綠色農(nóng)業(yè)的理想農(nóng)藥。但是相關(guān)研究主要集中在殺蟲劑類，而對殺菌劑研究較少。因此，不斷開發(fā)新的植物源殺菌劑成為當務(wù)之急。揮發(fā)油是植物源農(nóng)藥中研究比較廣泛一類化合物。已有報道細辛揮發(fā)油可以有效抑制番茄早疫病菌、茄子枯萎病菌等多種病菌［17，18］。本研究發(fā)現(xiàn)北細辛揮發(fā)油對馬鈴薯干腐病致病菌鐮刀菌的抑菌效果顯著，且抑制作用與揮發(fā)油質(zhì)量濃度呈劑量依賴性。說明北細辛揮發(fā)油可有效防治馬鈴薯干腐病，可將北細辛開發(fā)為植物源農(nóng)藥。

比較看來揮發(fā)油對供試菌絲生長與孢子萌發(fā)的抑制效果有所不同，孢子萌發(fā)的抑制試驗中，抑制效果擬枝孢鐮刀菌＞黃色鐮刀菌＞擬絲孢鐮刀菌，而在菌絲生長的抑制試驗中，黃色鐮刀菌＞擬絲孢鐮刀菌＞擬枝孢鐮刀菌。

揮發(fā)油GC-MS 結(jié)果顯示，其主要成分與前人研究大致相同［16，19］，其中甲基丁香酚含量最高。本研究發(fā)現(xiàn)地下部分超聲輔助浸提法中甲基丁香酚的含量近于50%，甲基丁香酚為北細辛主要的藥用成分，其提取方法的優(yōu)化對于提高北細辛的利用率具有重要意義。不同栽培技術(shù)、存放時間、產(chǎn)地、提取方法等對揮發(fā)油的有效成分均有所影響［20］。4 組揮發(fā)油雖然有18 種共同成分，但是其他成分及含量存在差異，說明提取方法及地上部分與地下部分所含成分不同所致。

本研究尚未對北細辛揮發(fā)油抑菌機制、4 種揮發(fā)油的抑菌活性比較進行系統(tǒng)性的探討，對其抑菌活性成分也尚未明確。下一步將對北細辛揮發(fā)油作用后致病菌菌絲和孢子形態(tài)、生理生化指標以及致病菌基因和蛋白表達水平變化等方面進行深入研究，進一步闡明北細辛揮發(fā)油的抑菌機制，為北細辛揮發(fā)油的實際應(yīng)用提供理論指導(dǎo)。

4 結(jié)論

以水蒸氣蒸餾法對北細辛全株提取的揮發(fā)油對5 種供試鐮刀菌菌絲生長和孢子萌發(fā)均有較強的抑制作用，且抑制作用與揮發(fā)油質(zhì)量濃度呈劑量依賴性。說明北細辛揮發(fā)油可有效抑制馬鈴薯干腐病鐮刀菌，可進一步開發(fā)成為植物源農(nóng)藥。

采用水蒸氣蒸餾法、超聲輔助浸提法提取北細辛揮發(fā)油，通過GC-MS 分析，鑒定出的成分占各揮發(fā)油的含量均達94%以上。初步鑒定出51 種成分，其中地上部分水蒸氣蒸餾法中32 種，地下部分31 種;地上部分超聲輔助浸提法中36 種，地下部分28 種。

地下部分揮發(fā)油提取率高于地上部分，揮發(fā)油以甲基丁香酚和黃樟醚為主要成分，因此推測兩種物質(zhì)為北細辛產(chǎn)生抑菌作用的有效成分。

1 Li YC，Bi Y，Ge YH，et al.Antifungal activity of sodium silicate on Fusarium sulphureum and its effect on dry rot of potato tubers.J Food Sci，2009，74:213-218.

2 Hou ZY (侯忠艷).Occurrence and control of dry rot of potato.Mod Agric Sci Technol (現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù))，2012，10:173-179.

3 Du M，Ren X，Sun QH，et al.Characterization of Fusarium spp.causing potato dry rot in China and susceptibility evaluation of Chinese potato germplasm to the pathogen.Potato Res，2012，55:175-184.

4 Li M (李梅)，Tian SL (田世龍)，Cheng JX (程建新)，et al.Virulence and inhibition activity of three kinds of preservatives against the pathogen of the potato tuber dry rot.Plant Protect (植物保護)，2013，39:188-192.

5 Cabanas R，Castella G，Abarca ML，et al.Thiabendazole resistance and mutations in the β-tubulin gene of Penicillium expansum strains isolated from apples and pears with blue mold decay.FEMS Microbiol Lett，2009，297:189-195.

6 Sun XC (孫現(xiàn)超)，Peng JF (彭健芳)，Zhang N (張寧)，et al.Inhibitory effect and identification of an antagonistic actinomyces strain JY-22 against Fusarium solani causing potato dry rot.Acta Phytophyl Sin (植物保護學(xué)報)，2013，40:38-44.

7 Han JY (韓俊艷)，Sun CL (孫川力)，Ji MS (紀明山).Recent advance of Chinese herb-Asarum.Chin Agric Sci Bull(中國農(nóng)學(xué)通報)，2011，27(9):46-50.

8 Zhu YL (朱躍蘭)，Hou XJ (侯秀娟)，Zhao FM (趙鳳毛).Research progress of Asarum application security use.Chin Arch Tradit Chin Med (中華中醫(yī)藥學(xué)刊)，2010，28:1175-1177.

9 Han JY (韓俊艷)，Wang J (王軍)，Han X (韓雪)，et al.Effects of essential oil from Asarum heterotropoides on toxicity and related enzymes of Tetranychus urticae..Nat Prod Res Dev (天然產(chǎn)物研究與開發(fā))，2012，24:525-528.

10 Dan Y，Liu H，Gao W，et al.Activities of essential oils from Asarum heterotropoides var.mandshuricum against five phytopathogens.Crop Prot，2010，29:295-299.

11 Ji LZ (姬蘭柱)，Wang GQ (王桂清)，Liu Y (劉艷)，et al.Effects of Asarum essential oils on physiological and biochemical indexes of two agricultural pest insects.Guangdong Agric Sci (廣東農(nóng)業(yè)科學(xué))，2013，8:87-91.

12 Wang XL (王曉麗).Recent advance of Chinese herb-Asarum.Asia-Pacific Tradit Med (亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥)，2013，9(7):68-71.

13 Wang GQ (王桂清).In vitro antibacterial activity of Asarum essential oils on five kinds of cucumber disease pathogens.J Changjiang Veget (長江蔬菜)，2008，8:44-47.

14 Zhou BL (周寶利)，Jiang CY (姜春云)，Chen ZX (陳志霞)，et al.Effects of Herba Asari extracts on eggplant Verticillium dahliae，its growth and resistance physiological indexes.China Veget (中國蔬菜)，2012，24:86-91.

15 Feng SF (逢世峰)，Wu LJ (吳連舉)，Guang YM (關(guān)一鳴)，et al.Inhibition effects of volatile oil of Asarum on 4 kinds of pathogens of Ginseng using in vitro tests.Special Wild Econ Animal Plant Res (特產(chǎn)研究)，2008，5(3):37-39.

16 Chen YL (陳燕鑾)，Liu QQ (劉秋瓊)，Wang JZ (王建壯)，et al.Composition analysis of volatile oil of Asarum heterotropoides var.mandshuricum extracted by three different methods.J Chin Med Mater (中藥材)，2013，36:1447-1451.

17 Li SH (李少華).Antifungal activities and active compounds of the extracts from Asarum himalaicum against Alternaria solani.J China Agric Univ (中國農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報)，2011，16(3):67-71.

18 Li FH (李凡海)，Wang GQ (王桂清).Antibacterial activity of Asarum essential oils and three chemical pesticides on the Fusarium Oxysporum.Agric Sci Technol Equip (農(nóng)業(yè)科技與裝備)，2014，7:10-13.

19 Wang B (王波)，Jiang B (蔣斌)，Shen XK (沈夕坤)，et al.Analysis of essential oil components by gas chromatography.Chin Arch Tradit Chin Med (中華中醫(yī)藥學(xué)刊)，2014，32:2726-2729.

20 Liu DJ (劉東吉)，Liu CS (劉春生).Chemical components of volatile oil of cultivated Asarum produced in different places.Chin J Exp Tradit Med Form (中國實驗方劑學(xué)雜志)，2010，16(9):79-82.