羅國勇，周 容，戴 亞

1中國科學(xué)院成都生物研究所，成都 610041;2 川渝中煙工業(yè)有限責(zé)任公司，成都 610066

自由基是生物體內(nèi)正常的代謝產(chǎn)物，并參與多種生命活動過程［1，2］。正常生理條件下，自由基的產(chǎn)生與消除存在一個動態(tài)平衡。一旦平衡被破壞，體內(nèi)過量存在的自由基可損傷蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、DNA等生物大分子，造成氧化應(yīng)激，誘導(dǎo)諸如癌癥、糖尿病、衰老等多種疾病的發(fā)生［3，4］。適當(dāng)?shù)乩猛庠葱钥寡趸瘎捎行У仡A(yù)防和治療與氧化應(yīng)激相關(guān)的疾病。

與常見的天然抗氧化劑茶多酚或銀杏提取物等類似，竹葉提取物在體內(nèi)或體外試驗中均表現(xiàn)出較強的抗氧化活性，是一種潛在的植物抗氧化劑［5］。因其資源豐富，天然無毒［6］，近年來備受關(guān)注，尤其在天然功能性食品添加劑和醫(yī)藥保健品等領(lǐng)域。四川栽竹用竹歷史悠久，現(xiàn)有竹子140 種(含變種、變型)，資源豐富。按功用可分為材用竹林、紙漿竹林、筍用竹林和生態(tài)公益竹林等，而竹葉卻未得到充分利用［7］。慈竹(Neosinocalamus affinis)是四川分布最廣的竹類品種之一，主要含有黃酮、木脂素、三萜等化學(xué)成分［8-11］，其提取物具有鈣拮抗作用［12］，對心肌缺血的大鼠心臟亦有保護作用［13］。然而，與其竹葉相關(guān)的研究很少［14］。因此，本研究擬選取慈竹竹葉為研究對象，以抗氧化活性成分得率為指標(biāo)，通過單因素試驗以及正交試驗優(yōu)化其抗氧化活性成分的提取工藝。同時測定與其活性相關(guān)的總酚含量和總黃酮含量，為其進一步的開發(fā)和利用奠定一定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

新鮮慈竹竹葉于2011 年9 月采自四川彭州，經(jīng)中國科學(xué)院成都生物研究所傅發(fā)鼎研究員鑒定系慈竹(Neosinocalamus affinis)竹葉。室溫下風(fēng)干后粉碎，過篩，按粉末粗細將樣品分成三份:10～20 目、20～28 目以及＞28 目，室溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 實驗儀器與藥品

集熱式恒溫加熱攪拌器(鄭州長城科工貿(mào)有限公司);多功能讀數(shù)儀(Thermo Fisher Scientific Inc.);FA1204B 電子天平(上海精科天美科學(xué)儀器有限公司);蘆丁(成都曼斯特生物科技有限公司，MUST-130104510);沒食子酸(成都曼斯特生物科技有限公司，MUST-130404302);Vitamin C(天津博迪化工股份有限公司);DPPH(Sigma-Aldrich Co.LLC.);96 孔細胞培養(yǎng)板(Nest Biotech.Co.，Ltd)。

2 實驗方法

2.1 抗氧化活性成分的提取方法

以抗氧化活性為指標(biāo)，通過預(yù)試驗考察提取溶劑的種類:乙酸乙酯、丙酮、甲醇、95%乙醇和水。結(jié)果發(fā)現(xiàn)甲醇提取物和95%乙醇提取物抗氧化活性最高，且前者稍強于后者。綜合考慮環(huán)境保護和所得慈竹葉抗氧化物的安全性及其應(yīng)用等方面，最終選擇了乙醇水溶液作為提取溶劑。

以乙醇水溶液按照相應(yīng)條件提取慈竹竹葉的抗氧化活性成分。完畢，經(jīng)濾紙過濾得提取液，竹葉殘渣以提取溶劑蕩洗三次。合并提取液，以提取溶劑稀釋并定容至100 mL，即為抗氧化活性成分樣品溶液。置于4 ℃下保存?zhèn)溆茫?4 h 內(nèi)完成其抗氧化活性成分的含量測定，含量以Vitamin C(VC)為參照表示。

2.2 抗氧化活性成分得率的計算

VC 是公認的天然抗氧化劑，在溶液中可清除DPPH 自由基而使后者的吸光度降低，且在一定范圍內(nèi)其吸光度降低值與VC 的濃度之間存有線性關(guān)系。因此，本實驗采用VC 當(dāng)量抗氧化能力(VCEAC，Vitamin C Equivalent Antioxidant Capacity)分析法測定慈竹竹葉抗氧化活性成分的得率［15］，具體操作如下:精密稱取DPPH 粉末58.9 mg，以無水乙醇溶解并定容至100 mL，置-20 ℃保存?zhèn)溆谩Ｊ褂脮r將此液以無水乙醇稀釋20 倍，即配即用。往96 孔板中加入不同濃度(0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.12 mg/mL)的VC 溶液10 μL 后，再分別依次加入290 μL DPPH 溶液。完畢，將96 孔板置室溫下避光反應(yīng)30 min 后，于517 nm 處以多功能讀數(shù)儀測定反應(yīng)液的吸收值，即可建立DPPH 溶液吸光度降低值與VC 濃度之間的標(biāo)準(zhǔn)曲線(Y=kX+b)。

同理，測定慈竹竹葉抗氧化活性成分樣品液相對應(yīng)的DPPH 溶液吸光度降低值，即可得慈竹竹葉抗氧化活性成分的得率(mg VC/g 竹葉樣品)，計算公式如下:

慈竹竹葉抗氧化活性成分得率=(Y-b)/k×100

式中Y 為慈竹竹葉抗氧化活性成分樣品液相對應(yīng)的DPPH 溶液吸光度降低值;b 為標(biāo)準(zhǔn)曲線的截距;k 為標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率。

2.3 單因素試驗

乙醇濃度:取20～28 目竹葉粉末1 g，60 ℃下，料液比(g/mL，下同)為1∶25，以不同濃度的乙醇水溶液(0%、30%、50%、70%、92%、100%;v/v，下同)靜置提取2 h。通過比較抗氧化活性成分的得率確定最佳乙醇濃度。

樣品粒度與提取方式:取不同目數(shù)的竹葉粉末(10～20 目;20～28 目;＞28 目)各1 g，60 ℃下，料液比為1∶25，以70%乙醇靜置或攪拌提取2 h。通過比較抗氧化活性成分的得率確定最佳樣品粒度與提取方式。

提取時間:取20～28 目竹葉粉末1 g，60 ℃下，料液比為1 ∶25，以70% 乙醇靜置提取不同時間(0.5、1、1.5、2、2.5、3 h)。通過比較抗氧化活性成分的得率確定最佳提取時間。

料液比:取20～28 目竹葉粉末1 g，60 ℃下，不同料液比(1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶40)，以70%乙醇靜置提取2 h。通過比較抗氧化活性成分的得率確定最佳料液比。

提取溫度:取20～28 目竹葉粉末1 g，不同溫度(30、40、50、60、70、80 ℃)下，料液比為1 ∶25，以70%乙醇靜置提取2 h。通過比較抗氧化活性成分的得率確定最佳提取溫度。

提取次數(shù):取20～28 目竹葉粉末1 g，70 ℃下，料液比為1∶25，以70%乙醇靜置提取2 h。小心倒出提取液，相同條件下重復(fù)提取0～2 次。完畢，合并相應(yīng)提取液。通過比較抗氧化活性成分的得率確定最佳提取次數(shù)。

2.4 正交試驗

以單因素試驗結(jié)果為依據(jù)，結(jié)合考慮工業(yè)成本與可操作性，確定以提取溶劑的乙醇濃度(A)、料液比(B)、提取溫度(C)為考察因素，通過正交試驗優(yōu)化慈竹竹葉抗氧化活性成分的提取工藝，因素水平設(shè)計見表1。

表1 正交試驗因素水平表Table 1 Factors and levels of the orthogonal test

2.5 化學(xué)成分含量測定

2.5.1 總酚含量測定

以沒食子酸為對照品，通過福林酚法測定最佳工藝條件下所提取的總酚含量［16］。具體操作如下:精密稱取沒食子酸2.0 mg，以蒸餾水溶解并定容至10 mL，作為對照液儲存?zhèn)溆?。將不同體積(20、40、60、80、100 μL)的對照液分別加至750 μL 以水稀釋了10 倍的Folin-Ciocalteau phenol 試劑中，混勻后室溫下避光反應(yīng)5 min，再加入60 g/L 的NaHCO3溶液750 μL，混勻，再加適量蒸餾水將反應(yīng)液體積補至2 mL。此反應(yīng)液置于30 ℃下避光反應(yīng)90 min后，取200 μL 反應(yīng)液加入96 孔板中，于725 nm 下以多功能讀數(shù)儀測定吸收值，即可建立吸光度與沒食子酸對照液的體積之間的標(biāo)準(zhǔn)曲線(Y=kX +b)。

取慈竹竹葉抗氧化活性成分樣品液100 μL，按上述流程操作，于725 nm 下測定相應(yīng)的吸收值，即可得最佳工藝條件下所提取的總酚含量(mg/g 竹葉樣品)，計算公式如下:

式中Y 為100 μL 慈竹竹葉抗氧化活性成分樣品液相應(yīng)的紫外吸收值;b 為標(biāo)準(zhǔn)曲線的截距;k 為標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率。

2.5.2 總黃酮含量測定

以蘆丁為對照品，采用經(jīng)典的亞硝酸鈉-三氯化鋁-氫氧化鈉法測定最佳工藝條件下所提取的總黃酮含量［17］。具體操作如下:精密稱取蘆丁2.2 mg，以甲醇溶解并定容至10 mL，作為對照液儲存?zhèn)溆?。將不同體積(25、50、100、150、200 μL)對照液分別置于2 mL 離心管中，依次加入200 μL 蒸餾水和5%亞硝酸鈉溶液30 μL，混勻，反應(yīng)5 min 后，再加入10%三氯化鋁溶液60 μL，混勻后反應(yīng)6 min，再加入1 M 氫氧化鈉溶液200 μL，并加入適量蒸餾水將反應(yīng)液體積補至900 μL。此反應(yīng)液混勻后靜置15 min，取300 μL 反應(yīng)液加入96 孔板中，于510 nm下以多功能讀數(shù)儀測定吸收值，即可建立吸光度與蘆丁對照液的體積之間的標(biāo)準(zhǔn)曲線(Y=kX+b)。

取慈竹竹葉抗氧化活性成分樣品液250 μL，按上述流程操作，于510 nm 下測定相應(yīng)的吸收值，即可得最佳工藝條件下所提取的總黃酮含量(mg/g 竹葉樣品)，計算公式如下:

式中Y 為250 μL 慈竹竹葉抗氧化活性成分樣品液相應(yīng)的紫外吸收值;b 為標(biāo)準(zhǔn)曲線的截距;k 為標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率。

3 結(jié)果與分析

3.1 VC 標(biāo)準(zhǔn)曲線

試驗結(jié)果表明DPPH 溶液吸光度降低值Y517與VC 標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度X 在0.02～0.12 mg/mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，回歸方程為:Y517=3.3994X-0.0062，R2=0.9975。

3.2 單因素試驗結(jié)果

分別考察了提取溶劑的乙醇濃度、樣品粒度與提取方式、提取時間、料液比、提取溫度和提取次數(shù)對慈竹竹葉抗氧化活性成分得率的影響，結(jié)果如圖1 所示。由此可以確定乙醇濃度、料液比和提取溫度這三個因素對抗氧化活性成分的得率影響顯著。

3.3 正交試驗

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，結(jié)合考慮工業(yè)成本與操作簡便性，選取20～28 目竹葉粉末靜置提取1 次，提取時間1.5 h，以提取溶劑的乙醇濃度(A)、料液比(B)、提取溫度(C)為考察因素，通過正交試驗優(yōu)化慈竹竹葉抗氧化活性成分的提取工藝，結(jié)果如表2 所示。極差分析結(jié)果(表2)表明，在所考察的水平范圍內(nèi)，各因素作用的主次順序為C ＞A ＞B。同時，空白列D 的R 值最小，佐證了正交設(shè)計試驗數(shù)據(jù)的可靠性。方差分析結(jié)果(表3)顯示只有因素A和C 對抗氧化活性成分得率的影響具有顯著性意義(P＜0.05)，由此可得出最佳提取工藝為A2B1-3C3。進一步成對比較因素各水平之間的差異性(表4)，發(fā)現(xiàn)因素A 水平1 和水平2 之間并無顯著差別;因素B 各水平間均無顯著性差別;因素C 各水平之間差異顯著。因此，綜合考慮，確定慈竹竹葉抗氧化活性成分的最佳提取工藝為A1B1C3，即選取20～28 目竹葉粉末，70 ℃下，料液比為1∶10，以60%乙醇靜置提取1.5 h。

圖1 乙醇濃度(A)、樣品粒度與提取方式(B)、提取時間(C)、料液比(D)、提取溫度(E)及提取次數(shù)(F)對慈竹竹葉抗氧化活性成分得率的影響Fig.1 Effects of ethanol concentration (A)，particle size and extraction methods (B)，extraction duration (C)，ratio of solid to liquid (D)，extraction temperature (E)，and times of extraction (F)on yields of antioxidants from N.affinis leaves

表2 正交試驗結(jié)果Table 2 Results of orthogonal test

表3 方差分析Table 3 Analysis of variance

表4 因素各水平之間差異分析Table 4 Variation analysis between factor levels

3.4 驗證試驗

精密稱取三份20～28 目竹葉樣品各1 g，按確定的最佳提取工藝條件提取。結(jié)果顯示，抗氧化活性成分的得率為7.44 mg/g，基本達到了正交試驗中的最優(yōu)水平，表明了最佳提取工藝的合理性。同時，RSD=3.61%，也證明了所得最佳提取工藝是穩(wěn)定可靠的。

3.5 抗氧化活性成分含量測定

3.5.1 總酚含量測定

沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸收值Y725與其體積X 在20～100 μL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，回歸方程為:Y725=0.0078X-0.0285，R2=0.9996。由此，可知1 g 竹葉粉末提取的總酚含量為4.73 mg。

3.5.2 總黃酮含量測定

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸收值Y510與其體積X 在25～200 μL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，回歸方程為:Y510=0.0036X +0.0109，R2=0.9952。由此，可知1 g 竹葉粉末提取的總黃酮含量為5.52 mg。

4 結(jié)論

VCEAC 分析法的基本原理是以天然抗氧化劑Vitamin C 為對照品，測定提取物中抗氧化活性成分的含量。以慈竹竹葉抗氧化活性成分含量為指標(biāo)，通過單因素試驗以及正交試驗，初步確定慈竹竹葉抗氧化活性成分的最佳提取工藝為:選取20～28 目竹葉粉末，70 ℃下，料液比為1/10，以60%乙醇靜置提取1.5 h。此工藝條件下可由1 g 竹葉粉末中提取得到7.44 mg 抗氧化活性成分?？偡雍涂傸S酮類成分是公認的抗氧化活性物質(zhì)，故進一步測定此工藝條件下提取得到的總酚和總黃酮含量。結(jié)果表明從1 g 竹葉粉末中提取的總酚含量為4.73 mg，總黃酮含量為5.52 mg。以抗氧化活性為導(dǎo)向?qū)χ袢~提取物中的有效成分進行分離和鑒定［18］，得到了竹葉中公認的抗氧化活性指標(biāo)性成分之一異葒草素，和另一個與之活性相當(dāng)?shù)念愃莆飂arobin A，這從側(cè)面反應(yīng)了所得工藝條件的合理性。

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