李良玉，劉 巖，宋大巍，張麗萍*

1黑龍江八一農(nóng)大學(xué)國家雜糧工程技術(shù)研究中心，大慶 163319;2東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，哈爾濱 150040;3黑龍江省農(nóng)墾建三江前進(jìn)農(nóng)場，佳木斯 156331

肝素類物質(zhì)是一類重要的功能性聚陰離子糖胺聚糖物質(zhì)，主要包括未分級肝素(unfractionated heparin，UFH)、低分子肝素(low molecular weight heparin，LMWH)、多硫酸化肝素(poly sulfated heparin，PSH)和其他衍生物［1］，具有廣泛的抗血栓，抗炎、調(diào)整血脂等多種生物學(xué)功能，主要分布在哺乳動物的肺、肝、腸粘膜中［2］。肝素類化合物的降血脂作用已有報(bào)道但均為早期的研究，陶芳等研究表明低劑量肝素鈣能明顯降低急性心肌梗塞患者的血液粘度和血清膽固醉水平，促進(jìn)心肌供血［3］;付學(xué)令研究表明肝素具有降低總膽固醇(total cholesterol，TC)和甘油三酯(triglyceride，TG)的作用［4］。劉兆平研究發(fā)現(xiàn)堿提類肝素對患有高膽固醇血癥和高甘油三酯血癥的大鼠均有明顯的抑制作用［5］。現(xiàn)在報(bào)道的研究大部分集中在UFH、LMWH 的抗癌、抗凝血等效果，在UFH、LMWH、PSH 的降血脂效果研究方面還是個空白，并且UFH、PSH、LMWH 三者之間的降血脂效果差異機(jī)理研究方面也從未報(bào)道過，因此，對比這三種肝素類化合物實(shí)驗(yàn)性高脂血癥模型的降血脂效果具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

低分子量肝素(法安明，25000 IU/mL)，美國Pfizer Inc;普通肝素、多硫酸化肝素，自制;TC 測定試劑盒、TG 測定試劑盒、HDL-C 測定試劑盒、LDL-C測定試劑盒、丙二醛，MDA 檢測試劑盒，南京建成生物工程研究所。超低溫冰箱，日本日立公司;AEC-200 型電子天平，杭州新力機(jī)械廠;Pharo300 紫外可見光分光光度計(jì);高速臺式離心機(jī)，日本日立公司;恒溫水浴箱，上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 食物性高脂血癥模型的建立及喂養(yǎng)方法

健康昆明種小鼠(批準(zhǔn)號:醫(yī)動字第10-5101)，體質(zhì)量(20 ±2)g，由長春生物制品研究所提供。實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)溫度為23 ±1 ℃，濕度:30%～70%，噪音:＜50dB。高脂飼料的配方為每1000 g 基礎(chǔ)飼料添加200 g 奶粉、300 g 豬油、十個雞蛋、100 滴魚肝油、2500 g 黃豆芽，喂養(yǎng)3 w 后，尾部取血，TC 較對照組高出約1/3 時認(rèn)定為已形成高血脂癥模型［6］。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)動物的分組方法

選取70 只昆明小鼠以普通飼料喂養(yǎng)1 w，禁食2 h 后尾部取血，根據(jù)TC 情況隨機(jī)分為正常組、高脂模型對照組、LMWH 高劑量組、LMWH 中劑量組、LMWH 低劑量組、UFH 組及PSH 組7 組，每組10只。對照組以普通飼料喂養(yǎng)，其余以高脂飼料喂養(yǎng)。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)動物的給藥方法

高脂模型組形成后改喂普通飼料，并開始ip 給藥，正常對照組和高脂模型組分別ip 生理鹽水(NS)2 mL/只，LMWH 高、中、低劑量組分別ipLMWH 0.5、1、2 mg/(mL·d)，UFH 組為1 mg/(mL·d)，PSH 組為1 mg/(mL·d)，給藥劑量的選擇參考山東醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)系生化制藥教研室崔慧斐教授關(guān)于低分子肝素口服制劑的降血脂作用研究中的給藥劑量［7］，以觀察制劑對高脂血癥的治療作用。

1.2.4 小鼠體重測定方法

在喂養(yǎng)期間小鼠自由飲水，每天16∶00 稱量體重并紀(jì)錄，喂養(yǎng)2 w。

1.2.5 TC、TG、HDL-C、LDL-C 測定方法

試驗(yàn)小鼠給藥2 W 后禁食，12 h 后取血，準(zhǔn)確按照試劑盒操作說明測定小鼠血液中的總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL-C)、低密度脂蛋白(LDL-C)含量。

1.2.6 熒光比色法測定肝臟及血漿丙二醛(MDA)

取一定量的試驗(yàn)小鼠肝臟組織，勻漿后加入冷生理鹽水，反復(fù)勻漿，制成10%組織勻漿(W/V)，4000 rpm 離心，10 min，取上層清液在532 nm 波長處測定OD 值。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法

所有實(shí)驗(yàn)經(jīng)過至少三次重復(fù)(n≥3)，每次重復(fù)實(shí)驗(yàn)都在不同時間進(jìn)行，且每次重復(fù)實(shí)驗(yàn)都進(jìn)行了三次平行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)得到的數(shù)據(jù)采用SAS8.2 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 小鼠體重變化情況

由圖1 的試驗(yàn)結(jié)果表明，各劑量肝素類多糖組小鼠的體重普遍低于正常對照組，高血脂模型組體重增長最明顯，模型組次之，其他組均有降低，其中高劑量LMWH 組體重減輕最為明顯。

圖1 小鼠體重變化曲線Fig.1 Changing curve of mice body weight

2.2 肝素類多糖對小鼠血脂指標(biāo)的影響

測定各組間有無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SAS8.2 數(shù)據(jù)分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)表示格式為:均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

表1 試驗(yàn)數(shù)據(jù)可以看出，試驗(yàn)小鼠通過高脂飼料的喂養(yǎng)，膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白膽固醇含量明顯提高，高密度脂蛋白明顯降低，證明本試驗(yàn)已經(jīng)成功建立了高脂血癥小鼠模型。給藥后，不同劑量的肝素組膽固醇含量與模型組相比都有不同程度的下降:UFH 組下降33.4%;PSH 組下降40.3%;低劑量LMWH 組下降39.0%;中劑量LMWH 組下降48.5%;高劑量LMWH 組下降64.6%。結(jié)果表明，中劑量LMWH 組和高劑量LMWH 組可以顯著降低高脂血癥小鼠的血膽固醇含量(P＜0.01)。肝素各組膽固醇含量均高于正常對照組，但都低于模型組。肝素各組對甘油三酯和低密度脂蛋白的含量均有不同程度的降低，以高劑量LMWH 組下降最明顯。而肝素各組能夠顯著升高高密度脂蛋白的含量，說明大部分血脂可由動脈內(nèi)膜滲入到動脈壁，再由動脈外膜的淋巴管排出，不在動脈壁上沉積。模型組小鼠體內(nèi)MDA 含量明顯增高，機(jī)體抗氧化能力明顯下降。各劑量肝素多糖組都低于模型組，隨著劑量增加MDA 也隨之降低。

表1 肝素類多糖對高脂血癥小鼠血漿TC、TG、HDL-C、LDL-C 及MDA 的影響Table 1 Effect of heparin polysaccharide on the levels of TC，TG，HDL-C，LDL-C and MDA in hyperlipidemic mice plasma

3 討論

通過試驗(yàn)可以看出肝素類多糖具有明顯的降血脂作用，這可能是由于肝素改變了載脂蛋白A1 的構(gòu)象，促進(jìn)了載脂蛋白A1 與脂類的結(jié)合，激活卵磷脂膽固醇?；D(zhuǎn)移酶，促進(jìn)高密度脂蛋白成熟，增加高密度脂蛋白，降低血液粘滯度，加快血液循環(huán)使膽固醇酯化并運(yùn)送至肝臟，加速清除血液中的膽固醇，從而降低血脂［8，9］，此外，肝素類化合物中多糖結(jié)構(gòu)與膽固醇、膽酸結(jié)合形成復(fù)合物，抑制脂肪在腸內(nèi)的吸收，促進(jìn)脂肪降解和排泄。通過試驗(yàn)可以看出UFH 與LMWH 都可以顯著降低高脂血癥動物血脂中的TC、TG 水平，同時提高HDL 與TC 的比值。自由基在人體正常及病理過程中具有重要作用，它會造成細(xì)胞永久性損傷，甚至導(dǎo)致細(xì)胞死亡［10，11］，MDA 是脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)物，MDA 含量的增減能夠反應(yīng)出脂質(zhì)過氧化的程度。自由基可引起脂質(zhì)過氧化，LDL 變形，導(dǎo)致泡沫細(xì)胞形成，引起脂質(zhì)沉著和平滑肌細(xì)胞移植，最終形成AS。本試驗(yàn)表明，肝素類多糖能夠降低高脂血癥小鼠的MDA，中、高劑量LMWH 組MDA 含量顯著降低，說明LMWH 具有增強(qiáng)機(jī)體的抗氧化能力，保護(hù)血管內(nèi)皮功能的作用，即對動脈粥樣硬化有較好的防治作用。

本文結(jié)果顯示不同類肝素多糖均有一定的降血脂性能，低分子肝素活性最強(qiáng)，多硫酸化肝素次之，未分級肝素最弱，低分子肝素的中劑量組和高劑量組極為顯著，這可能與肝素類化合物的結(jié)構(gòu)與分子量有關(guān)。多硫酸化肝素的降血脂能力強(qiáng)于未分級肝素主要是由于以下幾個原因:硫酸基的引入會引起多糖理化性質(zhì)、特別是立體構(gòu)象的變化，而構(gòu)象變化恰恰是活性變化的決定因素［12］。多硫酸化肝素的降血脂能力在一定程度上源于硫酸根賦予其聚陰離子的特性。首先，硫酸根聚陰離子具有很強(qiáng)的負(fù)電荷，能改變載脂蛋白的構(gòu)象，從而起到降血脂的作用;其次，硫酸根聚陰離子可以與某些細(xì)胞表面的正電荷分子結(jié)合，干擾正常的脂肪在腸內(nèi)的吸收，促進(jìn)脂肪降解和排泄［13］;再次，度硫酸化肝素硫酸化后的降血脂能力較強(qiáng)可能與糖鏈空間結(jié)構(gòu)有關(guān)，多糖硫酸化后，糖環(huán)構(gòu)象可能扭曲或轉(zhuǎn)變，且硫酸基間的排斥作用導(dǎo)致卷曲構(gòu)象呈伸展，糖鏈柔性降低、剛性增強(qiáng)。因而表現(xiàn)出降血脂能力［14］。

此外，低分子肝素的降血脂能力強(qiáng)于多硫酸化肝素這與前人研究較為相似。Yoshida O、Nakashima H 等人研究認(rèn)為盡管硫酸根與肝素的降血脂能力密切相關(guān)，但不是硫酸根數(shù)量越多活性越強(qiáng)，過多的硫酸根會產(chǎn)生抗凝血的副作用。一般認(rèn)為，在平均每單位糖殘基含1.5～2.0 個硫酸根為最佳［15］。分子量較大的多糖，硫酸化后，由于分子量過大而限制了其降血脂活性的發(fā)揮，一般硫酸化多糖分子量在5000～6000 Da 最佳［16］。低分子肝素的分子量在4000～8000 Da 左右，且含有1.5～2.0 個硫酸根符合上述條件，因此，可能是導(dǎo)致低分子肝素的降血脂能力強(qiáng)于多硫酸化肝素的原因。通過研究發(fā)現(xiàn)肝素分子量與硫酸化程度是影響肝素類物質(zhì)降血脂能力的主要原因，哪個因素起主導(dǎo)作用還需進(jìn)行研究。

4 結(jié)論

本研究采用高脂血癥小鼠模型為研究對象，研究不同類肝素多糖的降血脂性能，研究表明，不同劑量的低分子肝素、多硫酸化肝素和未分級肝素具有降低高脂血癥小鼠膽固醇的作用，低分子肝素活性最強(qiáng)，多硫酸化肝素次之，未分級肝素最弱，低分子肝素的中劑量組和高劑量組極為顯著。同時，高劑量的低分子肝素可降低高脂血癥小鼠血液中的甘油三酯，體重減輕明顯;中、高劑量肝素組小鼠的MDA含量顯著降低，說明肝素類多糖具有增強(qiáng)機(jī)體的抗氧化能力。

1 Hernaiz MJ，Yang HO，Gunay NS，et al.Purification and characterization of heparan sulfate peptidoglycan from bovine liver.Carbohydr Poly，2002，48:153-160.

2 Zhang LP(張麗萍).Study on a novel extraction and purification technology of heparin and bioactivity of degraded heparin.Changchun:Jilin University(吉林大學(xué))，PhD.2010.

3 Tao F(陶芳)，Sun SM(孫勝玫)，Liu YP(劉一平).Effect of low dose heparin calcium on acute myocardial infarction with high cholesterol.J Clin Cardiol(臨床心血管病雜志)，1994，10:156-157.

4 Fu XL.Clinical observation of 36 cases of hyperlipidemia treated with heparin.Clinical Focus，1990，5:359.

5 Liu ZP(劉兆平)，Wu BJ(吳葆杰).Comparison of hypolipemic effect of alkali-extracted heparinoid and its two fractions.Pharm Ind(醫(yī)藥工業(yè))，1987，18:401-404.

6 Hu HM(胡慧明)，Shao F(邵峰)，Zhu YC(朱彥陳).Effect of the extract of the south hawthorn on cholesterol biosynthesis in mice.J Chin Med Mater(中藥材)，2015，38:1036-1038.

7 Cui HF(崔慧斐)，Li H(李華)，Cao JC(曹吉超)，et al.Antihyperlipidemic effect of oral preparation of low molecular weight heparin.Chin J Biocheml Pharm(中國生物制品學(xué)雜志)，1998，19:22-24.

8 Li HY (李厚勇)，Wang R(王蕊)，Gao XQ (高曉奇).Effect ofLaminaria japonica-extract on peroxidation and hemorheoloy.China Public Health(中國公共衛(wèi)生)，2002，18:263-264.

9 Ames BN，Shigenaga MK，Hagen TM.Oxidants，antioxidants，and the degenerative disease of aging.Proc Natl Acad Sci USA，1993，90:7915-7922.

10 Zhang L(張琳).The relationship between structures of heparin-like glycosamionglycans and tumor.Jinan:Shandong University(山東大學(xué))，MD.2005.

11 Alban S，F(xiàn)ranz G.Characterization of the anticoagulant actions of a semisynthetic curdlan sulfate.Thromb Res，2000，99:377-388.

12 Liang J(梁進(jìn)).Studies on chemical modification anticoagulant functionin vitroof tea polysaccharide.Hefei:Anhui Agricultural University(安徽農(nóng)業(yè)大學(xué))，MD.2008.

13 Takano R，Nagai T，Wu X，et al.Sulfation of polysaccharide using monomethylsulfate.Carbohydr Chem，2000，19:1185-1190.

14 Yapani M.In:Polysaccharides-Syntheses.Modifications and Structure Property Relations.Amsterdam:Elsevier，1988.444-453.

15 Yoshida O，Nakashima H，Yoshida T，et al.Sulfation of the immunomodulating polysaccharide lentinan:A noval strategy for antivirals to human immunodeficiency virus (HIV).Biochem Pharm，1998，37:2887-2889.

16 Liao ZH(廖灶輝).Studies on the relationship between SO2+4content of polysaccharide fromGracilaria lemaneiformisand anti-influenza virus activities.Shaotou:Shaotou University(汕頭大學(xué))，MD.2008.