王丹丹，何紅鵬，張同存

(天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457)

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，已成為全球范圍內(nèi)危害女性身體健康的頭號殺手，其發(fā)病率在歐美及亞洲地區(qū)都逐漸呈現(xiàn)上升趨勢，且發(fā)病年齡日趨年輕化[1-4].乳腺癌主要是由于乳腺導(dǎo)管上皮或小葉乳腺組織出現(xiàn)惡性改變而產(chǎn)生的[5]，轉(zhuǎn)移引起的并發(fā)癥是患者死亡的主要原因[6]，而腫瘤細(xì)胞的遷移能力又是腫瘤轉(zhuǎn)移擴散的關(guān)鍵.

腺病毒E1A 結(jié)合蛋白p300(E1A binding protein p300，EP300)是具有多個結(jié)構(gòu)域的大分子蛋白質(zhì)，在生物進(jìn)化中高度保守，因其相對分子質(zhì)量接近3×105而被命名為p300[7].p300 作為特殊的轉(zhuǎn)錄輔因子，本身具有組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶活性，能通過多種機制參與許多基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控過程.p300 基因的改變導(dǎo)致許多人類癌癥的形成[8].在結(jié)直腸癌和前列腺癌中，野生型p300 的過表達(dá)與癌細(xì)胞向血管轉(zhuǎn)移和不良預(yù)后有關(guān)[9-11]，表明p300 可能在某些癌癥的發(fā)展進(jìn)程中起促進(jìn)作用.Yokomizo 等[12]評估了肝細(xì)胞型肝癌(HCC)患者中p300 過表達(dá)的預(yù)后值，發(fā)現(xiàn)p300過表達(dá)與血管侵襲增強、肝內(nèi)轉(zhuǎn)移和生存期縮短密切相關(guān)；另外，在培養(yǎng)的HCC 細(xì)胞中通過siRNA 沉默技術(shù)干擾掉p300 的表達(dá)后，發(fā)現(xiàn)隨著上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白Snail 和Twist 表達(dá)量的減少及E-cadherin表達(dá)的增加，細(xì)胞的侵襲遷移受到抑制，表明p300 在HCC 的侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要作用.研究顯示[13]，用小分子乙酰轉(zhuǎn)移酶抑制劑C646 抑制p300/CBP 的活性，或通過siRNA 干擾p300/CBP 的表達(dá)后，前列腺癌細(xì)胞傾向于凋亡且侵襲和遷移能力明顯下降，揭示出p300 抑制劑可作為未來癌癥治療的發(fā)展方向.Xiao 等[14]研究乳腺癌病人標(biāo)本時發(fā)現(xiàn)p300 在乳腺癌細(xì)胞中的表達(dá)強于非乳腺癌細(xì)胞以及癌旁組織，此結(jié)果提示p300 的過表達(dá)與乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展存在相關(guān)性.另外有研究報道p300 可募集MTA1 蛋白到乳腺癌增強子序列3(BCAS3)，促進(jìn)乳腺腫瘤細(xì)胞的癌性表型[15].目前p300 對乳腺癌細(xì)胞遷移的影響尚無報道.

非肌細(xì)胞肌球蛋白Ⅱ(Nonmuscle myosin Ⅱ，NMⅡ)是細(xì)胞骨架的組成成分，參與細(xì)胞極性的產(chǎn)生、遷移與黏附等過程，在腫瘤轉(zhuǎn)移過程中具有重要作用.NMⅡ分子是由兩條重鏈和兩對輕鏈組成的六聚體.MYH9(myosin heavy chain 9)是NMⅡ重鏈的一種亞型.Betapudi 等[16]研究發(fā)現(xiàn)MYH9 對細(xì)胞的遷移發(fā)揮著關(guān)鍵作用，干擾其表達(dá)將抑制細(xì)胞的遷移.MYL9(myosin regulatory light chain 9)是肌球蛋白調(diào)節(jié)輕鏈的一個亞型，其表達(dá)上調(diào)與人乳腺癌細(xì)胞的侵襲遷移呈正相關(guān)[17-18].CYR61(cysteine-rich 61)與腫瘤發(fā)生相關(guān)的生長因子、趨化因子及基質(zhì)金屬蛋白酶等分子之間有相互作用，參與腫瘤細(xì)胞的遷移、侵襲、黏附、細(xì)胞外基質(zhì)降解、新生血管生成等轉(zhuǎn)移過程.所以，本研究選取上述3 個基因作為乳腺癌細(xì)胞遷移標(biāo)志基因.

本研究在人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231 中過表達(dá)p300，再用靶向p300 的siRNA 干擾掉p300，運用分子生物學(xué)方法檢測了腫瘤遷移相關(guān)基因MYL9、CYR61 和MYH9 在mRNA 和蛋白水平的變化情況，探討了p300 對乳腺癌細(xì)胞遷移的調(diào)控作用，為研究乳腺癌轉(zhuǎn)移機制和防治乳腺癌轉(zhuǎn)移提供了理論基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 主要試劑

青鏈霉素、L-谷氨酸，Gibco 公司；胎牛血清，天津康源生物技術(shù)有限公司；p300 抗體、MYH9 抗體、GAPDH 單克隆抗體，Santa 公司；MYL9 抗體、CYR61 抗體，Abcam 公司；p300 siRNA 及陰性對照siRNA，廣州銳博生物科技公司；M-MLV 逆轉(zhuǎn)錄酶、Turbo 轉(zhuǎn)染試劑、Trizol 裂解液，Invitrogen 公司.

1.2 細(xì)胞株和細(xì)胞培養(yǎng)

人乳腺癌細(xì)胞 MDA-MB-231 為本實驗室保藏.用RPMI-1640 培養(yǎng)基(Gibco 公司)，添加10%,滅活胎牛血清、100,U/mL 青霉素和100,μg/mL 鏈霉素，于37,℃、5%,CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng).細(xì)胞用0.25%,的胰酶消化傳代.

1.3 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染實驗

以轉(zhuǎn)染空載體(pCDNA3.1)的MDA-MB-231 細(xì)胞為對照組，轉(zhuǎn)染p300 表達(dá)質(zhì)粒的MDA-MB-231細(xì)胞為實驗組，每組設(shè)3 個復(fù)孔.將MDA-MB-231細(xì)胞接種于6 孔板，接種密度為2×105個/孔，置37,℃、5%,CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24,h，待貼壁細(xì)胞達(dá)60%,～70%,融合時開始細(xì)胞轉(zhuǎn)染實驗.細(xì)胞轉(zhuǎn)染過程參照TurbofectTM細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑說明書進(jìn)行.

1.4 小分子干擾RNA(siRNA)的合成

根據(jù)p300 基因在GenBank 中的序列設(shè)計3 組靶向p300 的siRNA 和2 組非靶向p300 的陰性對照，由廣州銳博生物科技有限公司合成.經(jīng)前期篩選，本實驗使用p300-siRNA 設(shè)計序列中最高效的一組干擾序列.p300-siRNA 序列如下：Sense：5′-CGACUUACCAGAUGAAUUAdTdT-3′，Antisense：5′-UAAUUCAUCUGGUAAGUCGdTdT-3′，陰性對照siRNA 序列由公司設(shè)計并合成.

1.5 siRNA的轉(zhuǎn)染過程

轉(zhuǎn)染前1 天接種細(xì)胞于6 孔板，使轉(zhuǎn)染時細(xì)胞密度達(dá)到50%,～80%,.siRNA 凍干粉5,nmoL 瞬時離心后加250,μL 冰上預(yù)冷的DEPC-H2O 配成20,μmol/L儲存液，分裝保存于-80,℃冰箱.用DEPC 水配制的PBS 稀釋 riboFECTTMCP buffer(10×)制備 ribo FECTTMCP buffer(1×)，并取出riboFECTTMCP Reagent，在漩渦振蕩器充分振蕩后，室溫放置15,min.取 250,μL riboFECTTMCP buffer(1×)，加入 5,μL siRNA 20,μmol/L 儲存液，輕輕混勻，室溫放置5,min.加入25,μL riboFECTTMCP Reagent，輕輕吹打混勻，室溫放置15,min.最后將混合液加入1,720,μL 細(xì)胞培養(yǎng)基中，使 6 孔板中 siRNA 的終濃度為50,nmol/L，輕輕混勻.細(xì)胞培養(yǎng)48,h 后，收樣檢測.

1.6 細(xì)胞劃痕實驗

將MDA-MB-231 細(xì)胞接種于6 孔板，接種密度為2×105個/孔，置37,℃、5%,CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24,h.向各孔細(xì)胞中轉(zhuǎn)染不同質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染6,h 后換液，此時在每孔中央用10,μL 吸頭劃一寬度為300～500,μm 的無細(xì)胞劃痕區(qū).用PBS 充分洗去漂浮細(xì)胞，加入含1%,FBS 的RPMI-1640 培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng).每隔12,h 在倒置顯微鏡下觀察每孔中劃痕寬度變化情況，劃痕愈合快慢代表細(xì)胞在培養(yǎng)板上遷移速率大小.

1.7 RT-PCR檢測

收集處理組和陰性對照組的細(xì)胞，提取總RNA后逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，以此為模板進(jìn)行PCR 反應(yīng).在Invitrogen 公司合成以下引物：GAPDH 上下游引物5′-ATTCAACGGCACAGTCAAGG-3′，5′-GCAGAA GGGGCGGAGATGA-3′，產(chǎn)物大小213,bp.p300 上下游引物5′-GCAAACAATCGAGCGGAATAC-3′，5′-CGGATCATACTTGGGTCAGGT-3′，擴增產(chǎn)物大小218,bp .MYL9 上 下 游 引 物 5′-GAGCCCAAGC GCCTTCT-3′，5′-GTCAATGAAGCCATCACGGT-3′，擴增產(chǎn)物大小202,bp.CYR61 上下游引物5′-GTC GTCACCCTTCTCCACTT-3′，5′-CTTGGCGCAGAC CTTACAG-3′，擴增產(chǎn)物大小141,bp.MYH9 上下游引 物 5′-AGCGTTACTACTCAGGGCTCATC-3′，5′-TCATACTCCTGTAGGCGGTGTCT-3′，擴增產(chǎn)物大小177,bp.擴增產(chǎn)物進(jìn)行2%,瓊脂糖凝膠電泳，EB 染色10,min 后用BioRad 圖像分析儀成像進(jìn)行半定量分析，檢測目的基因的表達(dá)水平.

1.8 免疫印跡(Western blot)檢測

收集處理組及陰性對照組MDA-MB-231 細(xì)胞，棄上清液后，加入200,μL SDS 細(xì)胞裂解液，4,℃裂解20,min，用細(xì)胞刮刀收集蛋白于1.5,mL EP 中，煮沸5,min.取蛋白進(jìn)行SDS-PAGE 電泳.電泳完畢，利用半干轉(zhuǎn)膜儀將蛋白轉(zhuǎn)移至NC 膜上，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%,的脫脂奶粉室溫封閉1,h，一抗于4,℃下孵育過夜.然后用PBS 緩沖液(PBST)漂洗NC 膜3 次，每次5,min.洗完后于室溫下二抗避光孵育1,h，PBST漂洗3 次，每次5,min.洗完后，用Odyssey 紅外激光成像系統(tǒng)成像，以GAPDH 作對照.

2 結(jié)果與分析

2.1 過表達(dá)p300對乳腺癌細(xì)胞遷移的影響

為了探究p300 對乳腺癌細(xì)胞遷移的影響，首先使用MDA-MB-231 細(xì)胞做了體外劃痕實驗.細(xì)胞轉(zhuǎn)染空載體pCDNA3.1 作為對照組，轉(zhuǎn)染p300 表達(dá)質(zhì)粒為處理組，每隔12,h 觀察細(xì)胞的愈合情況，結(jié)果如圖1 所示.與對照組相比，轉(zhuǎn)染24,h 和48,h 后，明顯看到過表達(dá)p300 的細(xì)胞劃痕愈合的更快，表明p300能夠促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的遷移.

2.2 過表達(dá)p300對MDA-MB-231細(xì)胞遷移相關(guān)基因mRNA水平的影響

為了檢測過表達(dá)p300 對乳腺癌細(xì)胞遷移相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平的影響，運用RT-PCR 方法檢測了MDAMB-231 細(xì)胞中MYL9、CYR61 和MYH9 的mRNA的變化情況.細(xì)胞轉(zhuǎn)染空載體pCDNA3.1 作為對照組，轉(zhuǎn)染p300 表達(dá)質(zhì)粒為處理組.結(jié)果如圖2 所示，第1 行檢測了p300 的mRNA 水平，表明細(xì)胞轉(zhuǎn)染效果理想且 p300 在細(xì)胞中成功表達(dá)，之后檢測了MDA-MB-231 細(xì)胞中MYL9、CYR61 和MYH9 的mRNA 水平，與對照組相比，過表達(dá)p300 后這些遷移標(biāo)志基因在mRNA 上均上調(diào).

圖1 細(xì)胞劃痕實驗檢測過表達(dá)p300 后乳腺癌細(xì)胞遷移情況Fig.1 Effect of p300 overexpression on cell migration detected with wound-healing assay

圖2 RT-PCR 法檢測MDA-MB-231 細(xì)胞中遷移相關(guān)基因在mRNA水平的變化Fig.2 RT-PCR assay of the mRNA of metastasis-related genes in MDA-MB-231 cells

2.3 過表達(dá)p300 對乳腺癌細(xì)胞遷移相關(guān)基因蛋白質(zhì)表達(dá)水平的影響

為了檢測過表達(dá)p300 對乳腺癌細(xì)胞遷移相關(guān)基因蛋白表達(dá)水平的影響，運用Western blot 方法檢測了MDA-MB-231 細(xì)胞中MYL9、CYR61 和MYH9的蛋白質(zhì)的變化情況.細(xì)胞轉(zhuǎn)染空載體pCDNA3.1作為對照組，轉(zhuǎn)染p300 表達(dá)質(zhì)粒為處理組.Western blot 分析表明(圖3)，與對照組相比，在MDA-MB-231 細(xì)胞中轉(zhuǎn)染p300 后，其蛋白水平呈高表達(dá)；繼續(xù)檢測了細(xì)胞中MYL9、CYR61 和MYH9 的蛋白表達(dá)水平，結(jié)果表明過表達(dá)p300 后這些蛋白的表達(dá)明顯增強.

圖3 Western blot 法檢測MDA-MB-231 細(xì)胞中遷移相關(guān)基因在蛋白水平的變化Fig.3 Western blot analysis of the protein expression of metastasis-related genes in MDA-MB-231 cells

2.4 siRNA干擾p300表達(dá)對乳腺癌細(xì)胞遷移的影響

為了進(jìn)一步驗證p300 對乳腺癌細(xì)胞遷移的影響，運用siRNA 干擾技術(shù)下調(diào)p300 的表達(dá)，繼續(xù)做了體外劃痕實驗.細(xì)胞轉(zhuǎn)染陰性非靶向siRNA 作為對照組，轉(zhuǎn)染p300-siRNA 作為處理組，同樣每隔12,h 觀察細(xì)胞的愈合情況，結(jié)果如圖4 所示.細(xì)胞轉(zhuǎn)染24,h 和48,h 后，干擾p300 表達(dá)的細(xì)胞劃痕愈合明顯比對照組慢，再次表明p300 對乳腺癌細(xì)胞的遷移有促進(jìn)作用.

2.5 下調(diào)p300對MDA-MB-231細(xì)胞遷移相關(guān)基因mRNA和蛋白表達(dá)水平的影響

為了檢測下調(diào)p300 對乳腺癌細(xì)胞遷移相關(guān)基因的影響，運用RT-PCR 和Western blot 方法從mRNA和蛋白表達(dá)水平上檢測了MDA-MB-231 細(xì)胞中MYL9、CYR61 和MYH9 的變化情況.轉(zhuǎn)染陰性對照siRNA 作為對照組，轉(zhuǎn)染p300-siRNA 作為處理組，實驗結(jié)果如圖5 所示.由圖5(a)可知，RT-PCR分析表明MDA-MB-231 細(xì)胞中p300 基因在mRNA水平呈高表達(dá)，RNA 干擾48,h 后p300 在mRNA水平的表達(dá)明顯下調(diào)，說明p300-siRNA 能有效抑制p300,mRNA 的表達(dá).轉(zhuǎn)染p300-siRNA 下調(diào)p300的表達(dá)后，細(xì)胞遷移相關(guān)基因 MYL9、CYR61 和MYH9 的mRNA 與對照組相比有明顯的降低.與RT-PCR 的結(jié)果一致，圖5(b)的Western blot 分析表明p300 基因在蛋白水平呈高表達(dá)，RNA 干擾48,h后p300 表達(dá)下調(diào)，導(dǎo)致細(xì)胞遷移相關(guān)基因的表達(dá)也顯著下調(diào).

圖4 細(xì)胞劃痕實驗檢測下調(diào)p300 表達(dá)后乳腺癌細(xì)胞遷移情況Fig.4 Effect of p300 knock-down on cell migration detected with wound-healing assay

圖5 干擾p300 表達(dá)對MDA-MB-231 細(xì)胞遷移標(biāo)志基因的影響Fig.5 Effect of p300 interference on the migration of MDA-MB-231 cell

3 討論

乳腺癌的病因?qū)W機制至今尚未完全闡明，對乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的研究是一個熱點，也是難點.細(xì)胞遷移是一種復(fù)雜的生物學(xué)行為，是整個轉(zhuǎn)移過程的關(guān)鍵步驟，涉及眾多的調(diào)節(jié)因子、信號通路以及分子機制.

p300 是組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶(HAT)家族中研究最多的酶蛋白之一，它除了能乙酰化組蛋白，還能乙?；墙M蛋白.p300 在已知的各種轉(zhuǎn)錄活化因子與轉(zhuǎn)錄復(fù)合物的相互作用中起重要作用，對有關(guān)啟動子抑或激活抑或失活，通過不同機制影響細(xì)胞的生長、增殖、分化及癌癥的發(fā)生和進(jìn)展等.p300 的功能失調(diào)被認(rèn)為可引發(fā)多種人原發(fā)性惡性腫瘤，但至今仍不十分清楚p300 是如何參與癌癥發(fā)生的.本研究在MDAMB-231 細(xì)胞中轉(zhuǎn)染p300 表達(dá)質(zhì)粒，體外劃痕實驗觀察到，外源表達(dá)p300 后細(xì)胞的遷移能力增強(圖1).同時，細(xì)胞內(nèi)遷移相關(guān)基因MYL9、CYR61 和MYH9 的mRNA 和蛋白表達(dá)水平增加(圖2 和圖3).以上實驗結(jié)果表明p300 可能通過提高遷移相關(guān)基因的表達(dá)促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的遷移，但其具體的促遷移機制還需后續(xù)的研究進(jìn)一步闡明.

RNAi(RNA interfering，RNA 干擾)是指外源性或內(nèi)源性的雙鏈 RNA(double-silencing RNA，dsRNA)誘導(dǎo)與其同源的mRNA 特異性降解，引起轉(zhuǎn)錄后階段的基因沉默，使細(xì)胞表現(xiàn)出特定基因缺失的表型.自1998 年Fire 等[19]發(fā)現(xiàn)RNA 干擾現(xiàn)象之后，RNAi 技術(shù)迅速被成功用于線蟲、果蠅、植物和哺乳動物以及人的基因功能研究，并用于某些腫瘤、病毒感染性疾病治療的研究中.siRNA 是通過與靶mRNA 的特異性結(jié)合，激活RNA 酶，促使mRNA 的降解[20].在siRNA 轉(zhuǎn)染細(xì)胞48,h 后即可了解靶基因表達(dá)受抑制后的生物學(xué)現(xiàn)象.

本研究選用靶向干擾p300 最強的siRNA 序列，成功下調(diào)MDA-MB-231 細(xì)胞中p300 的表達(dá)，RTPCR 和Western blot 結(jié)果表明，腫瘤遷移相關(guān)基因MYL9、CYR61 和MYH9 的mRNA 和蛋白表達(dá)水平均下調(diào)(圖5)，反過來證明了乙酰轉(zhuǎn)移酶p300 對這些腫瘤遷移基因表達(dá)非常重要，p300 通過調(diào)節(jié)腫瘤遷移基因的表達(dá)促進(jìn)人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231 的遷移.同時，本研究結(jié)果還提示利用siRNA 干擾p300 的表達(dá)，從而抑制乳腺癌細(xì)胞的遷移，達(dá)到減少乳腺癌轉(zhuǎn)移的抗癌效果，在乳腺癌治療中將有廣闊的應(yīng)用前景.

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