張學(xué)江+曾凡松+楊立軍+龔雙軍

摘 要：實(shí)驗(yàn)以抗稻瘟病鏈霉菌JK-1的基因組DNA為材料構(gòu)建了其BAC（bacterial artificial chromosome）文庫(kù)。該文庫(kù)共有3 456個(gè)克隆，插入片段在40～100kb，平均插入片段55kb，空載率低于5%，覆蓋了鏈霉菌基因組約17.3倍?？沟疚敛℃溍咕鶭K-1基因組BAC文庫(kù)的構(gòu)建，為進(jìn)一步研究基因組結(jié)構(gòu)及其功能基因的利用等奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：鏈霉菌；BAC文庫(kù)；基因組

中圖分類(lèi)號(hào) S435.111 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1007-7731（2014）24-17-03

Construction of the Bacterial Artificial Chromosome Library of Streptomyces JK-1 Resistance to Magnaporthe oryzae

Zhang Xuejiang et al.

（Institute of Plant Protection and Soil Science，Hubei Academy of Agricultural Sciences/Key Laboratory of Integrated Pest Management on Crops in Central China，Ministry of Agriculture/Hubei Key Laboratory of Crop Diseases，Insect Pests and Weeds Control，Wuhan 430064，China）

Abstract：A genomic bacterial artificial chromosome（BAC）library was constructed using nuclear DNA of Streptomyces JK-1 resistance to Magnaporthe oryzae. The library collected 3 456 recombinant clones carrying inserts with sizes ranging from 40kb to 100kb. The average insert size was about 55kb with empty-vector rate less than 5%. This BAC library represented 17.3 equivalents of Streptomyces genome. The BAC library will help further genome and fucntional gene research.

Key words：Streptomyces；BAC library；Genome

放線菌聚酮合酶基因（polyketide synthase genes，PKSs）合成的聚酮化合物具有廣譜生物活性，表現(xiàn)出抗細(xì)菌、抗真菌、抗癌、治療心血管疾病、降低膽固醇等效果[1]。放線菌中最重要的成員鏈霉菌，其產(chǎn)生的聚酮化合物占人類(lèi)醫(yī)用抗生素的60%以上[2]。在過(guò)去的幾十年里，許多聚酮生物合成途徑中的重要基因已被克隆并被異源表達(dá)[3-5]。

近年來(lái)，本實(shí)驗(yàn)室從藍(lán)花鼠尾草（Salvia farinacea）中分離到一株內(nèi)生鏈霉菌JK-1，其次生代謝產(chǎn)物經(jīng)平板生測(cè)實(shí)驗(yàn)表明，對(duì)稻瘟病菌的抑制率達(dá)99%以上。次生代謝產(chǎn)物經(jīng)質(zhì)譜分析表明，活性物質(zhì)屬于七烯類(lèi)化合物，該化合物在化學(xué)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)中沒(méi)有相應(yīng)的結(jié)構(gòu)，屬于一種全新的聚酮化合物。因此本項(xiàng)目試圖將本實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)的這株鏈霉菌JK-1基因組中的多烯類(lèi)聚酮合成酶基因/簇通過(guò)構(gòu)建基因組BAC（Bacterial artificial chromosome）文庫(kù)的方法克隆出來(lái)，并進(jìn)行生物信息學(xué)分析和功能預(yù)測(cè)，為抗水稻稻瘟病提供新的抗性基因。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 鏈霉菌JK-1由本實(shí)驗(yàn)室保存，該菌自藍(lán)花鼠尾草（Salvia farinacea）（于2008年采自中國(guó)科學(xué)院武漢植物園）內(nèi)分離得到，其孢子的甘油懸浮液于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 BAC載體的制備 克隆載體pHZAUBAC1[6]由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)羅美中教授惠贈(zèng)。pHZAUBAC1質(zhì)粒采用Qiagen plasmid midi kit提取，用BamHI（NEB）酶切，再用CIAP（NEB）酶脫磷酸化并進(jìn)行自連反應(yīng)，用脈沖電泳分離目的DNA片段pIndigoBAC36-S，用電洗脫法回收估測(cè)濃度，根據(jù)DNA的濃度加入甘油調(diào)整終濃度至25ng/μL，分裝后于-80℃保存。

1.2.2 高分子量基因組DNA BamHI部分酶切產(chǎn)物的制備 鏈霉菌JK-1高純度大分子量基因組DNA凝膠塊（plug）的制備參照王萬(wàn)群的實(shí)驗(yàn)方法[7]。將制備好的plug做BamHI部分酶切，確定能產(chǎn)生50～150kb范圍片段的內(nèi)切酶用量。設(shè)0、0.3、0.6、1.2、2.4、4.8共6個(gè)不同用量的BamHI酶濃度梯度，3/8的plug，冰上輕搖2h，然后30℃酶切10min。對(duì)酶切產(chǎn)物進(jìn)行脈沖場(chǎng)凝膠電泳：1%瓊脂糖凝膠，1×TAE，泵70，溫度12℃，電壓6V/cm，角度120°，脈沖時(shí)間0.1～40s，運(yùn)行16h。根據(jù)電泳結(jié)果，確定最適內(nèi)切酶用量。然后做大量酶切，經(jīng)2次脈沖場(chǎng)電泳、電洗脫法分離純化50～100kb和100～150kb間的DNA片段的凝膠塊，用λDNA來(lái)定量所回收大片段DNA的濃度。

1.2.3 BAC文庫(kù)的構(gòu)建 回收的大片段DNA與載體按1∶1、5∶1、10∶1的比例進(jìn)行連接，篩選最佳連接比例。連接產(chǎn)物用30%PEG8000透析，脫鹽和濃縮。然后取2μL連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化20μL感受態(tài)細(xì)胞ElectroMAX DH10B T1 Phage-Resistant（Epicentre公司），轉(zhuǎn)化條件：1.25kV/cm，200Ω，25μF。轉(zhuǎn)化產(chǎn)物中加入980μL的SOC培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)1h，涂布LB平板（12.5μg/mL氯霉素、80μg/mL X-gal和100μg/mL IPTG），37℃倒置培養(yǎng)18h，通過(guò)藍(lán)白斑篩選，鑒別可能的重組克隆[8]。挑取白色菌落，LB液體培養(yǎng)基37℃ 225r震蕩培養(yǎng)18h，用BAC/PAC DNA Isolation kit（omegabiotek，US）提取BAC DNA，用I-SceI酶切檢測(cè)插入片段大小和空載率。最后挑取白色克隆到含有70μL凍存培養(yǎng)基的384孔培養(yǎng)板里，37℃培養(yǎng)至培養(yǎng)基液變渾濁，用384針的Replicator將文庫(kù)復(fù)制2份，一并貯存于-80℃低溫冰箱保存。

1.2.4 BAC文庫(kù)的質(zhì)量分析 從制備好的BAC文庫(kù)中隨機(jī)挑取100個(gè)克隆，用BAC/PAC DNA Isolation kit（omegabiotek，US）提取BAC DNA，用I-SceI酶切，脈沖電泳檢測(cè)插入片段大小，脈沖條件：1%瓊脂糖凝膠，1×TAE，泵70，溫度12℃，電壓6V/cm，角度120°，脈沖時(shí)間5～15s，運(yùn)行15h。計(jì)算平均插入片段大小和空載率，估算全基因組覆蓋度。

2 結(jié)果與分析

2.1 高分子量DNA制備與檢測(cè) 本研究采用菌絲包埋法制備plug，制備好的plug經(jīng)酶解釋放DNA，蛋白酶K消化處理，脈沖電泳檢測(cè)表明該方法提取的基因組DNA質(zhì)量高，片段大，DNA降解少，完全能滿足建庫(kù)需求（圖1）。

[M 1 2 3]

圖1 鏈霉菌JK-1 HMW DNA脈沖電泳

注：M：Low range PFGE Marker（NEB產(chǎn)品）。1、2、3泳道為提取的基因組DNA。脈沖電泳條件：1%瓊脂糖，1×TAE，8℃，泵70，角度120°，6v/cm，5～50s，16h。

2.2 基因組DNA酶切 酶切后脈沖結(jié)果顯示，第4道的大部分片段集中在50～150kb，所以1/3的plug所用酶量在1.2U和2.4U最佳（圖2）。以此為基礎(chǔ)進(jìn)行大量酶切，回收50～100kb及100～150kb的片段。

[M 1 2 3 4 5 6]

圖2 鏈霉菌JK-1 HMW DNA的BamHI不完全酶切

注：M：Low range PFGE Marker（NEB產(chǎn)品）。1～6泳道為1/3 plug分別為0，0.3U，0.6U，1.2U，2.4U，3.6U的BamHI于30℃酶切10min的結(jié)果。脈沖電泳條件為：1%瓊脂糖，1×TAE，8℃，泵70，角度120°，6v/cm，0.1～40s，16h。

2.3 大片段選擇回收 本實(shí)驗(yàn)用1.2U BamHI對(duì)plug進(jìn)行了大量酶切，然后用脈沖場(chǎng)電泳分離，切下50～150kb的大片段，再分割成50～100kb、100～150kb的2個(gè)膠塊，進(jìn)行第2次片段選擇。經(jīng)過(guò)2次選擇，有效地去除了較小的片段。

2.4 連接與轉(zhuǎn)化 電泳結(jié)果顯示本實(shí)驗(yàn)的載體質(zhì)量高純度好。本實(shí)驗(yàn)設(shè)置了片段與載體1∶1、5∶1、10∶1這3個(gè)梯度連接比例。結(jié)果顯示，在5∶1的比例下，長(zhǎng)出的克隆數(shù)目明顯多于其它連接比例。連接后的產(chǎn)物經(jīng)偷襲除鹽處理以提高轉(zhuǎn)化效率。

2.5 BAC文庫(kù)質(zhì)量檢測(cè) 隨機(jī)挑取100個(gè)克隆，接種到5mL含有12.5μg/mL氯霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃ 240r/min培養(yǎng)12h，用BAC/PAC DNA Isolation kit（omegabiotek，US）提取BAC DNA，I-SceI酶切檢測(cè)插入片段的大小。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示插入判斷長(zhǎng)度集中于50～100kb，平均大小55kb，文庫(kù)空載率低于5%（圖3）。鏈霉菌基因組大小約10M。本文庫(kù)共有3 456個(gè)克隆，覆蓋了鏈霉菌JK-1基因組至少17.3倍。

[M1 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13]

圖3 隨機(jī)挑取13個(gè)鏈霉菌JK-1 BAC克隆的I-SceI酶切片段大小圖譜

注：M：Low range PFG Marke（NEB產(chǎn)品），1～13泳道為BAC克隆的I-SceI酶切結(jié)果。脈沖電泳條件為：1%瓊脂糖，1×TAE，8℃，泵70，角度120°，6v/cm，5～15s，16h。 （下轉(zhuǎn)129頁(yè)）

（上接18頁(yè)）3 討論

本文所用的BAC載體pCUGIBAC1由pIndigoBAC536和pGEM-4Z 2個(gè)載體連接而成，該載體綜合了傳統(tǒng)BAC載體穩(wěn)定性好和鏈霉菌整合型載體的優(yōu)勢(shì)，完全滿足了本實(shí)驗(yàn)的要求。在制備高質(zhì)量DNA時(shí)是將菌絲體先包埋到低熔點(diǎn)瓊脂糖之后，再用1mg/mL的溶菌酶消化菌絲體釋放DNA，該方法規(guī)避了鏈霉菌基因組DNA容易被氧化而發(fā)生降解的缺點(diǎn)。制備好的基因組DNA經(jīng)脈沖電泳二次回收選擇，去除了中小片段等雜質(zhì)片段的干擾，使得回收片段長(zhǎng)度均一，從而有效提高了連接效率和轉(zhuǎn)化效率。

連接產(chǎn)物的脫鹽濃縮有助于提高轉(zhuǎn)化效率。而最佳的連接效率往往需要進(jìn)行載體與外源片段不同摩爾比的預(yù)連接實(shí)驗(yàn)[9]。經(jīng)過(guò)摸索發(fā)現(xiàn)，載體與外源片段在1∶5比例下，連接效率最高。

本實(shí)驗(yàn)所構(gòu)建BAC文庫(kù)克隆總數(shù)達(dá)3 456個(gè)，容量為鏈霉菌基因組DNA含量的17.3倍，平均插入片段達(dá)55kb，根據(jù)經(jīng)驗(yàn)公式[10]計(jì)算，本文庫(kù)得到任一基因的概率為99.99%，適合于單基因的克隆和分離。本文庫(kù)的成功構(gòu)建為進(jìn)一步克隆鏈霉菌基因組重要功能基因提供了必備的物質(zhì)平臺(tái)。

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（責(zé)編：張宏民）