朱桂池許文靜,2張春陽

1(中國科學院深圳先進技術研究院 深圳 518055)

2(中國科學院大學深圳先進技術學院 深圳 518055)

基于信號擴增的熒光技術檢測 MicroRNAs的研究進展

朱桂池1許文靜1,2張春陽1

1(中國科學院深圳先進技術研究院 深圳 518055)

2(中國科學院大學深圳先進技術學院 深圳 518055)

基于信號擴增的熒光技術結合了熒光檢測與擴增技術兩者的優(yōu)點，是一種擁有廣闊發(fā)展前景的生化分析方法。因其具有擴增效率高、信號易于讀取和實時分析等優(yōu)點，正成為核酸檢測中的一個研究熱點。文中綜述了近年來基于信號擴增的熒光技術應用于 microRNAs 檢測的最新進展，包括鏈置換擴增、滾環(huán)擴增、基于外切酶的信號擴增、基于雙鏈特異性核酸酶的信號擴增和無酶信號擴增等，并對今后的發(fā)展方向進行了展望。

熒光；信號擴增技術；microRNAs；超靈敏檢測；生物標志物

1 引 言

生物醫(yī)學作為一門新興的交叉學科展現(xiàn)了巨大的發(fā)展?jié)摿Γ渥钪匾娜蝿罩皇菍δ[瘤進行早期的診斷與治療。腫瘤在演變過程中會產生一些特異性的生物標志物，測定這些標志物分子可用于腫瘤的早期診斷。MicroRNAs(miRNAs)是一種具有代表性的腫瘤標志物。miRNAs 是一類內源性的具有調控功能的非編碼 RNA 小分子，由較長的初級轉錄產物經過 Drosha 酶和Dicer 酶的剪切加工而產生[1,2]。在人類基因組中已經有幾百種 miRNAs 被確定，大部分在細胞增殖、分化和凋亡等生物學過程中起著關鍵的調控作用[3-5]。目前，越來越多的研究表明 miRNAs在細胞內的異常表達與人類疾病具有密切的關系，例如肺癌、肝癌、乳腺癌和胃癌等[6-9]。近年來，miRNAs 已經被當作一種擁有巨大潛力的腫瘤標志物和治療靶點。

傳統(tǒng)的 miRNAs 分析方法通常包括 Northern印跡法[10]和微陣列芯片技術[11]，但這些方法通常靈敏度低、樣品需求量大、特異性差、操作步驟繁瑣。為了提高檢測的靈敏度和應用性，反轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)獲得了廣泛的發(fā)展，已經成為 miRNAs 檢測的常用方法[12]。但該方法需要精確的溫度控制和復雜的引物設計，這無疑增加了實驗的成本和復雜性。另外，PCR 方法很容易遭受非特異性擴增的影響，產生假陽性的實驗結果。因此，建立一種簡單、準確且高靈敏度的 miRNAs 檢測方法，對于 miRNAs 的生物學研究、疾病的早期診斷和治療靶點的發(fā)現(xiàn)都具有非常重要的意義。

基于信號擴增的熒光技術能在某一特定的溫度下對待測物(DNA 或 RNA)進行熒光信號放大，具有設計簡單、反應快速、儀器要求簡單等優(yōu)點。經過二十多年的不斷完善與進步，基于信號擴增的熒光技術已經在分子生物學、生物醫(yī)學、藥物篩選和環(huán)境監(jiān)測等多個領域得到應用，在 miRNAs 檢測領域中也日益受到重視。本文將分別從鏈置換擴增技術、滾環(huán)擴增技術、基于外切酶的信號擴增技術、基于雙鏈特異性核酸酶的信號擴增技術和無酶信號擴增技術等五個方面介紹 miRNAs 檢測的最新進展，并對今后的發(fā)展方向進行展望。

2 鏈置換擴增技術

自上世紀 90 年代初，為了尋找更加簡單的核酸分析方法，很多實驗室致力于發(fā)展無需熱變性的等溫擴增技術。鏈置換擴增(Strand Displacement Amplification，SDA)是一種典型的且應用廣泛的等溫擴增技術，由 Walter 課題組于 1992 年首次提出[13]。SDA 反應主要基于切口酶(Nicking Enzyme)和聚合酶(Polymerase)的協(xié)同作用，在DNA 雙鏈中打開缺口并在缺口處延伸而取代下游鏈的原理，其擴增效率在數分鐘內能夠達到106～109倍[14,15]。Li 課題組[16]利用 SDA 方法的高擴增效率成功地對 miRNA 進行了檢測。如圖 1 所示，他們設計一條 5＇端和 3＇端具有相同序列的單鏈 DNA 模板，在模板中間具有切口酶的識別序列。當加入待測 miRNA 后，DNA 模板的 3＇端能與其互補結合，形成聚合酶的作用底物。在聚合酶的催化下，miRNA 本身作為引物不斷被延伸直到與模板形成完整的雙鏈結構。此時雙鏈結構中間區(qū)域的序列將被切口酶識別并進行切割，形成的缺口被聚合酶利用，進行下一輪的延伸置換反應，產生大量的寡核苷酸鏈，這是第一階段的SDA 反應。這些新產生的寡核苷酸鏈與 miRNA 具有相同的序列，它們能夠與新的 DNA 模板互補結合，啟動第二階段的 SDA 反應，生成大量寡核苷酸片段產物。這種方法操作簡單，反應快速(半小時左右)，檢測限能夠達到 0.1 zmol。

圖 1 鏈置換擴增技術用于 miRNA 檢測示意圖Fig. 1 Scheme of SDA method for miRNA assay

結合基于單個量子點的熒光能量共振轉移技術(Fluorescence Resonance Energy Transfer，F(xiàn)RET)，Zhang 課題組[17]發(fā)展了一種 SDA 方法實現(xiàn)了對 miRNA 的超靈敏檢測。如圖 2 所示，這種方法分為三個主要步驟：指數 SDA反應，線性 SDA 反應和量子點表面自組裝反應。首先，miRNA 通過與模板 X＇-X＇互補結合，在 DNA 聚合酶和切口酶的共同作用下啟動第一步指數 SDA 反應，產生大量寡核苷酸鏈X0。然后，所擴增的產物 X0能夠與另一條模板X＇-Y＇互補結合，啟動第二步線性 SDA 反應，將 X0轉變成更多數量的寡核苷酸鏈 Y。最后，擴增產物 Y 被兩條標記有信號分子(Cy5)和生物素(Biotin)的探針捕獲，形成三明治結構。當加入鏈霉親和素修飾的量子點后，三明治結構能夠自組裝至量子點表面。在 488 nm 激光的激發(fā)下，量子點和 Cy5 之間發(fā)生 FRET。這種方法的靈敏度達 0.1 aM?；陬愃频?SDA 擴增原理，Zhang 課題組以發(fā)夾探針作為 SDA 擴增模板之一成功進行了 miRNA 的檢測[18]。miRNA 首先與單鏈 DNA 模板結合以啟動第一步 SDA 反應。所產生的寡核苷酸鏈能夠與 3＇端突出的發(fā)夾探針結合，在聚合酶的作用下發(fā)夾探針被打開，使熒光基團與淬滅基團分離，產生強烈熒光信號。最后被打開的發(fā)夾探針能夠被切口酶識別，在聚合酶的催化作用下進行第二步 SDA 反應。這兩步SDA 反應有機結合起來，形成指數擴增。

Zhong 課題組[19]和 Wang 課題組[20]分別采用兩條不同的 DNA 模板對待測 miRNA 進行 SDA擴增，檢測限分別達 16 zmol 和 0.1 aM。Ye 課題組[21-23]發(fā)展了一系列雙功能 SDA 擴增技術用于檢測 miRNA。他們利用一條較長的 DNA 模板可同時擴增出兩條不同序列的寡核苷酸鏈。DNA模板鏈中一般含三個功能區(qū)域，分別為 miRNA的互補區(qū)域和兩條寡核苷酸鏈的互補區(qū)域。2014年的文獻顯示，DNA 修復酶[24]和 DNA 三線結構(Three-way Junction Structure)[25]也被引入 SDA用于 miRNA 檢測。

圖 2 鏈置換擴增技術結合基于單個量子點的 FRET 技術用于 miRNA 檢測示意圖Fig. 2 Scheme of SDA and single quantum dot-based FRET method for miRNA assay

3 滾環(huán)擴增技術

滾環(huán)擴增(Rolling Circle Amplification，RCA)是一種簡單高效的等溫擴增技術，于 90年代中期發(fā)展起來，主要借鑒于噬菌體中環(huán)狀DNA 分子滾環(huán)式的復制方式。經典 RCA 方法以環(huán)狀 DNA 為模板，以一段單鏈 DNA 或RNA 作為引物，在聚合酶的作用下引物不斷被延伸，產生包含許多重復片段的單鏈 DNA 分子。RCA 方法可以分為線性擴增和指數擴增，其中指數擴增的效率高達 109倍[26]。2006 年，Kjems 課題組[27]將 RCA 方法應用于 miRNA檢測。鎖式探針(Padlock Probe)首先與待測miRNA 互補結合，然后在連接酶的作用下將鎖式探針變成環(huán)狀，最后以 miRNA 為引物在聚合酶的催化作用下不斷延伸，產生大量的單鏈重復片段。這種方法簡單快速，但由于屬于線性擴增，靈敏度不高。為了進一步提高 miRNA 檢測的靈敏度，Li 課題組[28]在 2009 年利用雙引物發(fā)展了一種指數 RCA(即分支滾環(huán)擴增技術Branched Rolling Circle Amplification，BRCA)檢測 miRNA。如圖 3 所示，待測 miRNA 作為第一條引物啟動線性 RCA 反應，形成較長具有重復片段的 DNA 產物，接著第二條引物以產物為模板啟動下一步擴增反應，形成指數擴增。靈敏度可達 10 fM。

圖 3 分支滾環(huán)擴增技術用于 miRNA 檢測示意圖Fig. 3 Scheme of BRCA method for miRNA assay

2013 年，Tang 課題組[29]發(fā)展了一種新的指數型 RCA 方法用于 miRNA 檢測，只需要一條引物就實現(xiàn)指數擴增。如圖 4 所示，待測 miRNA與鎖式探針互補雜交后，在 T4 RNA 連接酶作用下將鎖式探針連接成環(huán)狀，作為 RCA 的擴增模板。加入 Phi29 DNA聚合酶后，引物不斷被延伸，形成包含有切口酶識別序列的重復片段。這些重復片段能夠與新的鎖式探針互補結合形成雙鏈 DNA 結構。隨后這些雙鏈 DNA 被切口酶識別并切割，產生大量寡核苷酸鏈(Trigger)。這些寡核苷酸鏈可作為引物與新的鎖式探針作用啟動下一輪 RCA 反應，不斷循環(huán)實現(xiàn)指數擴增。Zhang課題組結合 RCA 方法和基于單個量子點的 FRET技術對 miRNA 實現(xiàn)了超高靈敏度的檢測，檢測限可達 50.9 aM[30]。這種方法可應用于臨床肺癌樣品的分析。近年來，許多其他類型 RCA 方法也被廣泛應用于 miRNA 檢測[31-35]。

圖 4 指數型滾環(huán)擴增技術用于 miRNA 檢測示意圖Fig. 4 Scheme of exponential RCA method for miRNA assay

4 基于外切酶的信號擴增技術

外切酶(Exonuclease)是一類從核酸鏈的末端開始，依次水解磷酸二酯鍵而生成單個核苷酸的核酸酶。近年來，基于外切酶的信號擴增技術在生化分析領域得到了廣泛應用。Xia 課題組[36]利用 Lambda 外切酶的循環(huán)酶切信號放大原理，發(fā)展了一種超靈敏 miRNA 檢測方法。如圖 5 所示，這種方法包括兩步循環(huán)過程：首先分子信標(Molecular Beacon)與待測 miRNA 結合，導致熒光團和淬滅團分開，產生較強熒光信號；然后，miRNA 在聚合酶和引物延伸的作用下被置換下來，被替換的 miRNA 又可以結合新的分子信標。經過一段時間的循環(huán)后，越來越多的分子信標被打開，形成大量 Lambda 外切酶作用底物。這些雙鏈底物在切口酶的作用下暴露出 5＇端磷酸基團(PO4)，迅速被 Lambda 外切酶識別并消化，導致熒光基團與淬滅基團的距離進一步擴大，產生更強熒光信號。這種方法通過兩步循環(huán)擴增對熒光信號放大，檢測限在 37℃ 和 4℃ 分別達 10 fM 和 1 aM。

圖 5 基于 Lambda 外切酶的信號擴增技術用于 miRNA 檢測示意圖Fig. 5 Scheme of Lambda exonuclease-assisted signal amplification method for miRNA assay

2014 年，Zhang 課題組結合 Lambda 外切酶與 2-氨基嘌呤(2-aminopurine)發(fā)展了一種新型無需淬滅團基團標記(Quencher-free)的 miRNA 檢測方法[37]。2-氨基嘌呤是一種具有熒光信號的腺嘌呤類似物，其熒光信號在 DNA 鏈中會被鄰近的堿基所淬滅[38]。如圖 6 所示，一條含有 2-氨基嘌呤的 DNA 探針可捕獲待測 miRNA，在聚合酶和切口酶的共同催化作用下，形成可被Lambda 外切酶作用的底物，導致 2-氨基嘌呤分子從 DNA 鏈中釋放出來，產生強烈熒光信號。這種方法操作簡單，只需一步反應即可完成，不需要額外修飾淬滅基團。除 Lambda 外切酶外，外切酶 III[39]和 T7 外切酶[40]也可應用于miRNA 的檢測。

圖 6 基于 2-氨基嘌呤和 Lambda 外切酶的信號擴增技術用于 miRNA 檢測示意圖Fig. 6 Scheme of 2-aminopurine and Lambda exonucleaseassisted signal amplification method for miRNA assay

5 基于雙鏈特異性核酸酶的信號擴增技術

雙鏈特異性核酸酶(Duplex Specific Nuclease，DSN)能特異性識別并切割雙鏈 DNA或雜交鏈DNA/RNA 中的 DNA，但對單鏈DNA、單鏈或雙鏈 RNA 均沒有切割作用。DSN被廣泛應用于基因工程領域，但由于其獨特切割方式，也被用于 miRNA 檢測。Ye 課題組于 2012年將 DSN 用于 miRNA 分析[41]。如圖 7 所示，這種方法采用傳統(tǒng) Taqman 探針。當反應體系中不存在待測 miRNA 時，Taqman 探針保持單鏈狀態(tài)不會被 DSN 切割，因而熒光背景信號很低。當在反應體系中加入待測 miRNA 后，其與 Taqman探針形成完全配對的 DNA/RNA 雜交鏈。DSN 能夠識別雜交鏈并切割其中的 DNA 鏈(即 Taqman探針)，導致熒光基團和淬滅基團分離，產生增強熒光信號。釋放的 miRNA 可結合新的 Taqman探針參與到下一個循環(huán)中。這種方法極為簡單，一步反應即可完成，靈敏度可達 0.1 pM?；陬愃频脑恚琘ang 課題組[42]將 Taqman 探針換成分子信標，改善了 miRNA 檢測的特異性，可分辨具有單個堿基錯配的 miRNA。此外，Zhou 課題組[43]利用 DSN 對雜交鏈特異性切割，產生一段具有催化活性的 8-17 DNAzyme。這種 DNAzyme 能特異性切割發(fā)夾分子信標，產生增強熒光信號。

圖 7 基于雙鏈特異性核酸酶的信號擴增技術用于 miRNA檢測示意圖Fig. 7 Scheme of DSN-assisted signal amplification method for miRNA assay

利用金納米粒子的高效熒光淬滅功能，F(xiàn)iammengo 課題組[44]發(fā)展了一種新的 miRNA 檢測方法。如圖 8 所示，他們在金納米粒子表面修飾 DNA 熒光探針，由于熒光分子與金納米之間的距離很近，熒光信號被淬滅。當加入待測miRNA，其與熒光探針形成雜交鏈結構，該結構被 DSN 識別并切割，使熒光探針遠離金納米表面，產生增強熒光信號。釋放的 miRNA 可進入下一個循環(huán)去形成更多的 DSN 作用底物，導致熒光信號的循環(huán)放大。除金納米外，DSN 結合其他納米材料也可用于 miRNA 的檢測[45,46]。

圖 8 基于金納米粒子與雙鏈特異性核酸酶的信號擴增技術用于miRNA檢測示意圖Fig. 8 Scheme of gold nanoparticles and DSN-assisted signal amplification method for miRNA assay

6 無酶信號擴增技術

上述四類信號擴增技術都必須依賴于蛋白酶的催化作用，如聚合酶、切口酶、外切酶和DSN 等。為了發(fā)展一種更為簡單的 miRNA 檢測方法，無需蛋白酶參與(Enzyme-free)的信號擴增技術引起研究者的重視。雜交鏈式反應(Hybridization Chain Reaction，HCR)是一種典型的無酶擴增技術，其利用待測目標物作為啟動器，依次打開兩條部分互補配對的發(fā)夾 DNA，形成具有多個重復單元的雙鏈 DNA[47]。如圖 9所示[48]，在不存在 miRNA 的情況下，兩條具有部分互補序列的發(fā)夾 DNA 熒光探針各自保持獨立狀態(tài)。當加入待測 miRNA，其中一條發(fā)夾DNA 被打開，引發(fā)第二條發(fā)夾 DNA 結構的改變，依此方式不斷循環(huán)，最后形成一段較長帶有很多熒光分子的雙鏈 DNA。由于雙鏈 DNA 具有剛性結構，能夠直立在氧化石墨烯表面，導致熒光分子與氧化石墨烯的距離增大，減弱熒光淬滅效果。此外，基于發(fā)夾 DNA 設計的無酶擴增也可用于 miRNA 檢測[49,50]。

圖 9 基于雜交鏈式反應的信號擴增技術用于 miRNA 檢測示意圖Fig. 9 Scheme of HCR-based signal amplification method for miRNA assay

7 結論與展望

近年來，信號擴增技術以其靈敏度高、特異性強和快速簡便等優(yōu)點日益受到研究者們的關注。本文主要針對應用廣泛的信號擴增技術，包括鏈置換擴增、滾環(huán)擴增、基于外切酶的信號擴增、基于雙鏈特異性核酸酶的信號擴增和無酶信號擴增技術等，介紹了 miRNAs 檢測的最新研究進展。因為在實際臨床樣本(如血清)中 miRNA含量通常非常低，如何建立一種簡單高效的基于信號擴增的熒光技術顯得尤為重要。未來的發(fā)展方向應聚焦于提高檢測靈敏度與拓展復雜樣品分析兩個方面，使該技術在生物學研究和臨床早期診斷中得到廣泛應用。

[1] Kim VN, Han J, Siomi MC. Biogenesis of small RNAs in animals [J]. Nature Reviews Molecular Cell Biology, 2009, 10(2): 126-139.

[2] Krol J, Loedige I, Filipowicz W. The widespread regulation of microRNA biogenesis, function and decay [J]. Nature Reviews Genetics, 2010, 11(9): 597-610.

[3] Calin GA, Croce CM. MicroRNA signatures in human cancers [J]. Nature Reviews Cancer, 2006, 6(11): 857-866.

[4] Bartel DP. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function [J]. Cell, 2004, 116(2): 281-297.

[5] Bartel DP, Chen CZ. Micromanagers of gene expression: the potentially widespread influence of metazoan microRNAs [J]. Nature Reviews Genetics, 2004, 5(5): 396-400.

[6] Yanaihara N, Caplen N, Bowman E, et al. Unique microRNA molecular profiles in lung cancer diagnosis and prognosis [J]. Cancer Cell, 2006, 9(3): 189-198.

[7] Murakami1 Y, Yasuda T, Saigo K, et al. Comprehensive analysis of microRNA expression patterns in hepatocellular carcinoma and nontumorous tissues [J]. Oncogene, 2006, 25(17): 2537-2545.

[8] Iorio MV, Ferracin M, Liu CG, et al. MicroRNA gene expression deregulation in human breast cancer [J]. Cancer Research, 2005, 65(16): 7065-7070.

[9] Tsujiura M, Ichikawa D, Komatsu S, et al. Circulating microRNAs in plasma of patients with gastric cancers [J]. British Journal of Cancer, 2010, 102(7): 1174-1179.

[10] Lagos-Quintana M, Rauhut R, Lendeckel W, et al. Identification of novel genes coding for small expressed RNAs [J]. Science, 2001, 294(5543): 853-858.

[11] Thomson JM, Parker J, Perou CM, et al. A custom microarray platform for analysis of microRNA gene expression [J]. Nature Methods, 2004, 1(1): 47-53.

[12] Chen C, Ridzon DA, Broomer AJ, et al. Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR [J]. Nucleic Acids Research, 2005, 33(20): e179.

[13] Walker GT, Little MC, Nadeau JG, et al. Isothermal in vitro amplification of DNA by a restriction enzyme/DNA polymerase system [J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 1992, 89(1): 392-396.

[14] Van Ness J, Van Ness LK, Galas DJ. Isothermal reactions for the amplification of oligonucleotides [J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2003, 100(8): 4504-4509.

[15] Tan E, Wong J, Nguyen D, et al. Isothermal DNA amplification coupled with DNA nanosphere-based colorimetric detection [J]. Analytical Chemistry, 2005, 77(24): 7984-7992.

[16] Jia HX, Li ZP, Liu CH, et al. Ultrasensitive detection of microRNAs by exponential isothermal amplification [J]. Angewandte Chemie International Edition, 2010, 49(32): 5498-5501.

[17] Zhang Y, Zhang CY. Sensitive detection of microRNA with isothermal amplification and a single-quantum-dot-based nanosensor [J]. Analytical Chemistry, 2012, 84(1): 224-231.

[18] Wang GL, Zhang CY. Sensitive detection of microRNAs with hairpin probe-based circular exponential amplification assay [J]. Analytical Chemistry, 2012, 84(16): 7037-7042.

[19] Shi C, Liu Q, Ma CP, et al. Exponential stranddisplacement amplification for detection of microRNAs [J]. Analytical Chemistry, 2014, 86(1): 336-339.

[20] Wang K, Zhang K, Lv Z, et al. Ultrasensitive detection of microRNA with isothermal amplification and a time-resolvedfluorescence sensor [J]. Biosensors and Bioelectronics, 2014, 57: 91-95.

[21] Liu YQ, Zhang M, Yin BC, et al. Attomolar ultrasensitive microRNA detection by DNA-scaffolded silver-nanocluster probe based on isothermal amplification [J]. Analytical Chemistry, 2012, 84(12): 5165-5169.

[22] Wang XP, Yin BC, Ye BC. A novel fluorescence probe of dsDNA-templated copper nanoclusters for quantitative detection of microRNAs [J]. RSC Advances, 2013, 3: 8633-8636.

[23] Yin BC, Liu YQ,Ye BC. Sensitive detection of microRNA in complex biological samples via enzymatic signal amplification using DNA polymerase coupled with nicking endonuclease [J]. Analytical Chemistry, 2013, 85(23): 11487-11493.

[24] Zhou DM, Du WF, Xi Q, et al. Isothermal nucleic acid amplification strategy by cyclic enzymatic repairing for highly sensitive microRNA detection [J]. Analytical Chemistry, 2014, 86(14): 6763-6767.

[25] Zhang Q, Chen F, Xu F, et al. Target-triggered three-way junction structure and polymerase/ nicking enzyme synergetic isothermal quadratic DNA machine for highly specific, one-step, and rapid microRNA detection at attomolar level [J]. Analytical Chemistry, 2014, 86(16): 8098-8105.

[26] Lizardi PM, Huang XH, Zhu ZR, et al. Mutation detection and single-molecule counting using isothermal rolling-circle amplification [J]. Nature Genetics, 1998, 19(3): 225-232.

[27] Jonstrup SP, Koch J, Kjems J. A microRNA detection system based on padlock probes and rolling circle amplification [J]. RNA, 2006, 12(9): 1747-1752.

[28] Cheng Y, Zhang X, Li Z, et al. Highly sensitive determination of microRNA using target-primed and branched rolling-circle amplification [J]. Angewandte Chemie International Edition, 2009, 48(18): 3268-3272.

[29] Liu HY, Li L, Duan LL, et al. High specific and ultrasensitive isothermal detection of microRNA by padlock probe-based exponential rolling circle amplification [J]. Analytical Chemistry, 2013, 85(16): 7941-7947.

[30] Zeng YP, Zhu GC, Yang XY, et al. A quantum dotbased microRNA nanosensor for point mutation assays [J]. Chemical Communications, 2014, 50(54): 7160-7162.

[31] Zhou Y, Huang Q, Gao J, et al. A dumbbell probemediated rolling circle amplification strategy for highly sensitive microRNA detection [J]. Nucleic Acids Research, 2010, 38(15): e156.

[32] Li Y, Liang L, Zhang CY. Isothermally sensitive detection of serum circulating miRNAs for lung cancer diagnosis [J]. Analytical Chemistry, 2013, 85(23): 11174-11179.

[33] Ge J, Zhang LL, Liu SJ, et al. A highly sensitive target-primed rolling circle amplification (TPRCA) method for fluorescent in situ hybridization detection of microRNA in tumor cells [J]. Analytical Chemistry, 2014, 86(3): 1808-1815.

[34] Zhang LR, Zhu G, Zhang CY. Homogeneous and label-free detection of microRNAs using bifunctional strand displacement amplificationmediated hyperbranched rolling circle amplification [J]. Analytical Chemistry, 2014, 86(13): 6703-6709.

[35] Xu F, Shi H, He X, et al. Concatemeric dsDNA-templated copper nanoparticles strategy with improved sensitivity and stability based on rolling circle replication and its application in microRNA detection [J]. Analytical Chemistry, 2014, 86(14): 6976-6982.

[36] Duan RX, Zuo XL, Wang ST, et al. Lab in a tube:ultrasensitive detection of microRNAs at the single cell level and in breast cancer patients using quadratic isothermal amplification [J]. Journal of the American Chemical Society, 2013, 135(12): 4604-4607.

[37] Zhu G, Liang L, Zhang CY. Quencher-free fluorescent method for homogeneously sensitive detection of microRNAs in human lung tissues [J]. Analytical Chemistry,2014, 86(22): 11410-11416.

[38] Mitsis PG, Kwagh JG. Characterization of the interaction of lambda exonuclease with the ends of DNA [J]. Nucleic Acids Research, 1999, 27(15): 3057-3063.

[39] Huang RC, Chiu WJ, Li YJ, et al. Detection of microRNA in tumor cells using exonuclease III and graphene oxide-regulated signal amplification [J]. ACS Applied Materials & Interfaces, 2014, 6(24): 21780-21787.

[40] Cui L, Zhu Z, Lin NH, et al. A T7 exonucleaseassisted cyclic enzymatic amplification method coupled with rolling circle amplification: a dual-amplification strategy for sensitive and selective microRNA detection [J]. Chemical Communications, 2014, 50(13): 1576-1578.

[41] Yin BC, Liu YQ, Ye BC. One-Step, multiplexed fluorescence detection of microRNAs based on duplex-specific nuclease signal amplification [J]. Journal of the American Chemical Society, 2012, 134(11): 5064-5067.

[42] Lin XY, Zhang C, Huang YS, et al. Backbonemodified molecular beacons for highly sensitive and selective detection of microRNAs based on duplex specific nuclease signal amplification [J]. Chemical Communications, 2013, 49(65): 7243-7245.

[43] Tian T, Xiao H, Zhang Z, et al. Sensitive and convenient detection of microRNAs based on cascade amplification by catalytic DNAzymes [J]. Chemistry-A European Journal, 2013, 19(1): 92-95.

[44] Degliangeli F, Kshirsagar P, Brunetti V, et al. Absolute and direct microRNA quantification using DNA-gold nanoparticle probes [J]. Journal of the American Chemical Society, 2014, 136(6): 2264-2267.

[45] Guo S, Yang F, Zhang YL, et al. Amplified fluorescence sensing of miRNA by combination of graphene oxide with duplex specific nuclease [J]. Analytical Methods, 2014, 6(11): 3598-3603.

[46] Xi Q, Zhou DM, Kan YY, et al. Highly sensitive and selective strategy for microRNA detection based on WS2 nanosheet mediated fluorescence quenching and duplex-specific nuclease signal amplification [J]. Analytical Chemistry, 2014, 86(3): 1361-1365.

[47] Dirks RM, Pierce NA. Triggered amplification by hybridization chain reaction [J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2004, 101(43): 15275-15278.

[48] Yang L, Liu CH, Ren W, et al. Graphene surfaceanchored fluorescence sensor for sensitive detection of microRNA coupled with enzyme-free signal amplification of hybridization chain reaction [J]. ACS Applied Materials & Interfaces, 2012, 4(12): 6450-6453.

[49] Jiang ZZ, Wang H, Zhang XB, et al. An enzymefree signal amplification strategy for sensitive detection of microRNA via catalyzed hairpin assembly [J]. Analytical Methods, 2014, 6(23): 9477-9482.

[50] Zhu D, Zhang L, Ma W, et al. Detection of microRNA in clinical tumor samples by isothermal enzyme-free amplification and label-free graphene oxide-based SYBR Green I fluorescence platform [J]. Biosensors and Bioelectronics, 2015, 65: 152-158.

Progress in Signal Amplification-Based Fluorescence Methods for MicroRNAs Assay

ZHU Guichi1XU Wenjing1,2ZHANG Chunyang1

1(Shenzhen Institutes of Advanced Technology,Chinese Academy of Sciences,Shenzhen518055,China)
2(Shenzhen College of Advanced Technology,University of Chinese Academy Academy of Sciences,Shenzhen518055,China)

Signal amplification-based fluorescent methods combine the advantages of both fluorescence detection and signal amplification strategy. Recently, they have gained increasing attention in nucleic acid detection due to their high efficiency, easy read-out, and real-time monitoring. In this review, we summarize the recent progress in signal amplification-based fluorescent methods for microRNAs assay, and focus on five categories including strand displacement amplification (SDA), rolling circle amplification (RCA), exonuclease-assisted signal amplification, duplex specific nuclease (DSN)-assisted signal amplification, and enzyme-free signal amplification. We highlight their future direction as well.

fluorescence; signal amplification; microRNAs; sensitive detection; biomarker

O 657.3 Q 522

A

2015-04-13

：2015-04-25

朱桂池，助理研究員，研究方向為熒光型生物傳感器應用于腫瘤標志物的檢測；許文靜，碩士研究生，研究方向為生化分析與生物傳感器；張春陽(通訊作者)，博士，研究員，研究方向為單分子檢測與成像及其臨床應用研究，E-mail：zhangcy@siat.ac.cn。