白建勇，宦海琳，閆俊書，溫 超，周巖民，周維仁＊

（1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧研究所，江蘇 南 京210014；2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，江蘇 南 京210095）

畜禽養(yǎng)殖中抗生素的濫用帶來的“藥物殘留”問題越來越受社會關(guān)注，由于抗生素的研發(fā)速度較慢，而抗藥性細(xì)菌的產(chǎn)生速度卻越來越快，因此，抗生素替代物的研發(fā)受到高度重視。抗菌肽是廣泛存在于動物、植物、微生物等大多數(shù)生物體內(nèi)的天然防御性多肽［1］，其主要特點是不易產(chǎn)生耐藥性［2-3］。

發(fā)酵床養(yǎng)豬又稱“自然養(yǎng)豬法”或“生態(tài)養(yǎng)豬法”，是一種以微生物發(fā)酵為核心的糞尿免清理養(yǎng)豬技術(shù)，它符合低排放、無臭氣、綠色環(huán)保的要求［4-5］。目前，對抗菌肽的研究主要集中在作用機(jī)制、抗菌活性及對畜禽生長性能的影響方面。在發(fā)酵床養(yǎng)豬模式下，系統(tǒng)地研究飼糧中添加抗菌肽對仔豬抗氧化、免疫及腸道主要菌群數(shù)量影響的報道較為少見。本試驗以發(fā)酵床飼養(yǎng)的仔豬為研究對象，研究抗菌肽對仔豬抗氧化、免疫及盲腸主要菌群數(shù)量的影響，以期為抗菌肽在發(fā)酵床養(yǎng)豬中的研究與應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

抗菌肽由北京中農(nóng)穎泰生物技術(shù)有限公司提供（活性單位為1.0×106U／g）；試驗所用抗生素為桿菌肽鋅和硫酸黏桿菌素；發(fā)酵床菌種（主要為芽孢桿菌）由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧研究所提供；發(fā)酵床墊料主要為稻殼、木屑（分別占50%左右）。

1.2 基礎(chǔ)飼糧

基礎(chǔ)飼糧參照NRC（1998）豬的營養(yǎng)需要配制?；A(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平（風(fēng)干基礎(chǔ)）Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet（air-dry basis）

1.3 試驗設(shè)計

本試驗分為3組，具體分組如下：對照組（CT）飼喂基礎(chǔ)飼糧；抗生素組（ABT）在基礎(chǔ)飼糧中添加40 mg／kg桿菌肽鋅和20 mg／kg硫酸黏桿菌素；抗菌肽組（AMPT）在基礎(chǔ)飼糧中添加300 mg／kg抗菌肽。

1.4 試驗動物及其管理

將108頭35日齡，體重（13.82±0.18）kg左右的蘇鐘豬，按公母各半的原則，隨機(jī)分成3組，每組3重復(fù)，每重復(fù)12頭。自由采食及飲水。驅(qū)蟲、免疫及墊料的維護(hù)按照豬場常規(guī)程序進(jìn)行。預(yù)試期7 d，正試期49 d。試驗于江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院六合基地發(fā)酵床豬場進(jìn)行。

1.5 樣品的采集與制備

于試驗期第49 d時，早上8∶00空腹稱重，每重復(fù)選2頭豬（公母各半）進(jìn)行屠宰采集血液，靜置，在低溫離心機(jī)中4 000 r／m離心15 min，取上清液-20℃保存；分離肝臟，并于肝臟的同一部位取1 g左右裝于凍存管在液氮中保存；分別取十二指腸（距幽門約5 cm）、空腸（中間）、回腸（距回腸末端約20 cm）1.5 cm左右放入4%甲醛溶液中固定；將盲腸結(jié)扎，在無菌操作臺取盲腸內(nèi)容物進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)。

1.6 測定指標(biāo)及方法

1.6.1 抗氧化指標(biāo) 血清和肝臟谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、總抗氧化能力（T-AOC）用試劑盒（購于南京建成生物工程研究所）進(jìn)行測定。

1.6.2 免疫指標(biāo) 血清Ig A、IgG用試劑盒測定（購于南京建成生物工程研究所）。

切片制作步驟：組織修整→脫水→透明→浸蠟→包埋→切片。

蘇木精-伊紅（HE）染色步驟：二甲苯脫蠟→脫二甲苯→染色→脫水→透明→封片。

小腸上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞計數(shù)：用Olympus顯微鏡觀察，Shineso（杭州迅數(shù)）顯微圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行拍照。每個樣品（重復(fù)）取2張切片，每張切片取5個放大400倍的視野，進(jìn)行上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞計數(shù)，結(jié)果用每100個上皮細(xì)胞中淋巴細(xì)胞個數(shù)來表示。

1.6.3 盲腸主要菌群數(shù)量 在超凈臺中，取盲腸內(nèi)容物0.5 g放于裝有45 m L無菌生理鹽水的試管中進(jìn)行10倍稀釋，再用無菌生理鹽水10倍比例梯度稀釋至10-6，然后選擇合適的濃度分別進(jìn)行培養(yǎng)和平板計數(shù)，用于芽孢桿菌培養(yǎng)的稀釋液要在80℃水浴10 min（參照國標(biāo)飼用微生物制劑中枯草芽孢桿菌的檢測，GB／T 26428-2010）。總細(xì)菌用營養(yǎng)瓊脂（NA）培養(yǎng)基37℃恒溫培養(yǎng)24 h；乳酸桿菌用乳酸細(xì)菌（MRS）培養(yǎng)基37℃恒溫培養(yǎng)36 h；大腸桿菌用伊紅美蘭（EMB）培養(yǎng)基37℃恒溫培養(yǎng)24 h；芽孢桿菌用營養(yǎng)瓊脂（NA）培養(yǎng)基37℃恒溫培養(yǎng)48 h。每個樣品做三個平行，細(xì)菌數(shù)量用每g內(nèi)容物中細(xì)菌個數(shù)的對數(shù)lg（CFU／g）表示。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

用Excel 2003對原始數(shù)據(jù)初步統(tǒng)計，用SPSS 19.0軟件進(jìn)行單因素方差分析（one-way ANOVA），并用Duncan法進(jìn)行多重比較，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗菌肽對仔豬抗氧化指標(biāo)的影響

從表2可以看出，與對照組相比，飼糧中添加抗菌肽能夠顯著提高血清GSH-PX的活性（P＜0.05），極顯著提高肝臟 GSH-PX 的活性（P＜0.01），能夠極顯著降低肝臟 MDA 含量（P＜0.01）；與抗生素組相比，抗菌肽組極顯著地提高了血清GSH-PX活性（P＜0.01）。

2.2 抗菌肽對仔豬血清Ig A和IgG的影響

由表3可知，抗菌肽組血清Ig A含量分別比對照組和抗生素組提高4.03%、2.27%，但差異均不顯著 （P＞0.05）；各組間血清IgG含量差異均不顯著（P＞0.05）。

2.3 抗菌肽對仔豬小腸上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞數(shù)量的影響

從表4可以看出，抗菌肽組仔豬十二指腸上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞數(shù)量比對照組極顯著提高（P＜0.01），比抗生素組顯著提高（P＜0.05），空腸上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞數(shù)量比對照組提高10.70%，但未達(dá)到顯著水平（P＞0.05）；抗生素組十二指腸和空腸上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞數(shù)量均比對照組顯著提高（P＜0.05）。

表2 抗菌肽對仔豬抗氧化指標(biāo)的影響Table 2 Effect of antimicrobial peptides on antioxidant indices in piglets

表3 抗菌肽對仔豬血清Ig A和IgG含量的影響Table 3 Effect of antimicrobial peptides on the content of serum Ig A and IgG in piglets

表4 抗菌肽對仔豬小腸上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞數(shù)量的影響Table 4 Effect of antimicrobial peptides on the number of intraepithelial lymphocyte in piglets 個／100

2.4 抗菌肽對仔豬腸道主要菌群數(shù)量的影響

由表5知，與對照組相比，飼糧中添加抗菌肽能夠顯著降低盲腸中大腸桿菌數(shù)量（P＜0.05），細(xì)菌總數(shù)降低5.98%，但差異不顯著（P＞0.05）；抗生素組仔豬大腸桿菌數(shù)量亦比對照組顯著降低（P＞0.05）。

表5 抗菌肽對仔豬腸道主要菌群數(shù)量的影響Table 5 Effect of antimicrobial peptides on the number of intestinal main microbial flora in piglets lg（CFU／g）

3 討 論

3.1 抗菌肽對仔豬抗氧化指標(biāo)的影響

機(jī)體內(nèi)的自由基主要是由細(xì)胞膜上的多不飽和脂肪酸被H2O2等強(qiáng)氧化劑氧化生成的，GSH-PX能夠催化GSH與H2O2反應(yīng)，減少體內(nèi)H2O2含量，從而間接減少自由基的產(chǎn)生。MDA是膜脂過氧化鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的產(chǎn)物之一，其含量能夠反映細(xì)胞的損傷程度。SOD能夠通過防止或減弱膜脂過氧化，對細(xì)胞膜系統(tǒng)起到保護(hù)作用。T-AOC是機(jī)體內(nèi)酶類和非酶類抗氧化能力的綜合反映［6-8］。本試驗中，飼糧中添加抗菌肽顯著提高仔豬血清和肝臟GSHPX活性；肝臟中MDA含量顯著降低，而血清中MDA也降低了5.24%，這可能與仔豬體內(nèi)GSHPX活性的顯著提高有關(guān)。綜合這四個抗氧化指標(biāo)來看，抗菌肽組仔豬的抗氧化能力優(yōu)于對照組和抗生素組，此結(jié)果與谷娟［9］的研究有所不同，可能是由飼養(yǎng)方式、豬的品種、試驗材料等不同造成的。

3.2 抗菌肽對仔豬免疫指標(biāo)的影響

血清Ig A、IgG具有抗菌、抗病毒和抗毒素等作用，其中，IgG是血清中含量最高的免疫球蛋白，在血清抗感染中起主要作用。血清Ig A、IgG含量是衡量機(jī)體體液免疫的重要指標(biāo)。淋巴細(xì)胞在機(jī)體細(xì)胞免疫中起重要作用，小腸上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞（IEL）主要分布于腸絨毛上皮細(xì)胞間，當(dāng)發(fā)生免疫反應(yīng)時，IEL可分泌多種細(xì)胞因子（如IL-2、TNF-2、IL-5及IFN-γ等）調(diào)節(jié)黏膜免疫反應(yīng)，因此，IEL數(shù)量能夠在一定程度上反映小腸局部黏膜免疫功能的強(qiáng)弱［10-11］。抗菌肽是存在于機(jī)體內(nèi)的一類天然防御性多肽，具有提高機(jī)體免疫力的作用［12-13］。有研究表明，飼糧中添加350 mg／kg的抗菌肽能夠提高蛋用仔公雞免疫器官指數(shù)和血清Ig A、IgG含量［14-15］。谷娟等［9］的研究表明，飼糧中添加1.0%的復(fù)合多肽能夠提高斷奶仔豬體液免疫（血清Ig A、IgG含量）和細(xì)胞免疫（淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率、白細(xì)胞介素-2、白細(xì)胞介素-6）功能。王阿榮等［16］在斷奶仔豬飼糧中添加320 mg／kg的天蠶素抗菌肽，發(fā)現(xiàn)仔豬血清IgG含量顯著提高。本試驗表明，飼糧中添加抗菌肽能夠顯著提高仔豬十二指腸IEL數(shù)量，同時，血清Ig A含量和空腸IEL數(shù)量也有提高趨勢，此結(jié)果與前人的研究類似。

3.3 抗菌肽對仔豬腸道主要菌群數(shù)量的影響

抗菌肽的抗菌機(jī)制，第一步是通過靜電吸引靠近并穿過細(xì)胞壁；第二步是通過胞外作用或胞內(nèi)作用殺滅病原菌?？咕姆肿佑H水端帶正電荷，而革蘭氏陽性菌細(xì)胞壁中的脂磷壁酸和革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁中的脂多糖都帶負(fù)電荷，抗菌肽通過靜電作用靠近并穿過細(xì)胞壁［17］?？咕牡陌鈿⒕饔弥饕峭ㄟ^在細(xì)胞膜表面形成膜通道或破壞細(xì)胞膜的完整性，使細(xì)胞內(nèi)容物外流，滲透壓失衡，而殺滅病原菌，此抗菌機(jī)制的具體模型為“木桶板模型”、“環(huán)形孔模型”及“地毯模型”［18-19］。天蠶素抗菌肽是通過胞外作用中的“木桶板模型”來達(dá)到抑菌殺菌目的的，即在細(xì)胞膜表面形成跨膜離子通道，導(dǎo)致內(nèi)容物外流，滲透壓失衡，天蠶素抗菌肽分子疏水基與膜脂相連，形成離子通道的外側(cè)，親水端構(gòu)成通道的內(nèi)側(cè)［20］。

本試驗所用的抗菌肽是通過培養(yǎng)工程菌獲得的雜合肽，其親水端有更多的正電荷，疏水端有更強(qiáng)的疏水作用，故其具有更強(qiáng)的抗菌作用。張勇軍［21］在斷奶仔豬飼糧中添加不同水平的天蠶素抗菌肽，發(fā)現(xiàn)各組仔豬糞中大腸桿菌數(shù)量顯著降低，但有益菌雙歧桿菌數(shù)量也顯著降低，乳酸桿菌降低8%～9%。谷娟等［9］對早期斷奶仔豬飼糧中添加復(fù)合多肽的研究表明，復(fù)合多肽能夠顯著降低仔豬糞中大腸桿菌數(shù)量，而添加0.5%水平的復(fù)合多肽能夠顯著增加糞中乳酸桿菌數(shù)量。本試驗中，與對照組相比，抗菌肽能夠顯著降低仔豬盲腸中大腸桿菌數(shù)量，這與前人的研究結(jié)果類似，對乳酸桿菌、芽孢桿菌等有益菌無顯著影響，這與張勇軍、谷娟的研究結(jié)果都不同，可能是由發(fā)酵床飼養(yǎng)條件下，仔豬拱食墊料中的微生物造成的。同時，抗菌肽組與抗生素組盲腸中大腸桿菌數(shù)量無顯著差異，說明在本試驗條件下，抗菌肽對盲腸中大腸桿菌的抑制作用能夠達(dá)到與抗生素相當(dāng)?shù)男Ч?/p>

4 結(jié) 論

本試驗條件下，飼糧中添加300 mg／kg的抗菌肽，能夠提高仔豬抗氧化和免疫功能；減少仔豬盲腸中大腸桿菌數(shù)量，而對盲腸有益菌群無不良影響。

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