趙 媛， 徐麗廣， 吳曉玲， 劉麗強， 胥傳來

（江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無錫 214122）

基于SPR技術(shù)的磺胺二甲氧嘧啶高靈敏檢測

趙 媛， 徐麗廣， 吳曉玲， 劉麗強， 胥傳來*

（江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無錫 214122）

磺胺類藥物的過量使用會對人體造成過敏性反應(yīng)，并可能具有致癌性，而磺胺二甲氧嘧啶（Sulfadimethoxine，SDM）在食品中磺胺類藥物的使用中占有很大的比例，因此基于表面等離子體共振（Surface plasmon resonance，SPR）技術(shù)建立了奶粉樣品中SDM的快速、高靈敏檢測方法。通過待測樣品與SPR芯片表面修飾的SDM抗體分子特異性識別引起金膜表面折射率變化，進而導(dǎo)致SPR角的變化以實現(xiàn)檢測。建立SPR響應(yīng)信號和SDM濃度間的標(biāo)準(zhǔn)曲線，最低檢測限達到0.19 ng/mL，奶粉樣品添加回收率在94.0%～98.3%。和傳統(tǒng)方法相比，SPR技術(shù)具有較高的靈敏度、準(zhǔn)確性且操作簡便，SPR傳感芯片完整性好且可重復(fù)用于實際樣品檢測中。

表面等離子體共振；生物傳感器；共振信號；磺胺二甲氧嘧啶

SDM是一種磺胺類藥，具有較強的抗細(xì)菌及原蟲感染的作用，常被用作飼料添加劑及畜禽疾病的治療和預(yù)防，同時SDM也具有的一定毒性，引起過敏、造血系統(tǒng)障礙、急性溶血性貧血等[1]，因此磺胺二甲氧嘧啶在肉類、乳類、禽蛋等食品性動物組織中的殘留問題備受關(guān)注[2-6]。中國農(nóng)業(yè)部2002年發(fā)布的動物性食品中獸藥最高殘留量，嚴(yán)格規(guī)定了動物性食品中磺胺類藥物最大殘留量為25 ng/mL。目前針對磺胺二甲氧嘧啶大致分為一下幾種，TTC法是中國制定的抗生素殘留量的檢驗標(biāo)準(zhǔn) （GB5409-85），但耗時長、要求操作人員具有一定的專業(yè)知識并且實驗過程中菌液的制備和水浴過程的控制都要求嚴(yán)格遵守操作規(guī)程，否則易出現(xiàn)假陽性，以致出現(xiàn)檢驗結(jié)果的不穩(wěn)定性[6-7]。高效液相色譜檢測法屬于一種理化檢測方法，檢測程序復(fù)雜，費用相對較高，需購買色譜儀等檢測設(shè)備，不適合小型檢驗室 使 用[2-5]。 酶 聯(lián) 免 疫 法 （enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）是一種結(jié)合了酶化學(xué)反應(yīng)的敏感性和抗原抗體免疫反應(yīng)的特異性相結(jié)合的方法[8-9]，但操作繁瑣，耗時長，檢測靈敏度不高，有時容易出現(xiàn)假陽性結(jié)果[6-7]。

SPR技術(shù)利用了金屬薄膜光學(xué)耦合產(chǎn)生的物理光學(xué)現(xiàn)象，是一種具有高靈敏度的光學(xué)分析手段[10-15]。在傳感芯片表面固定一層生物分子識別膜，然后將待測樣品流過芯片表面，若樣品中有能夠與芯片表面的生物分子識別膜相互作用的分子，會引起金膜表面折射率變化，最終導(dǎo)致SPR角變化，通過檢測SPR角度變化，獲得被分析物的濃度、親和力、動力學(xué)常數(shù)和特異性等信息，SPR檢測器追蹤溶液中分子與芯片表面分子的結(jié)合、解離整個過程的變化，目前已廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)、食品安全、環(huán)境檢測、生物醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域[14，16]。作者基于表面等離子體共振原理建立針對磺胺二甲氧嘧啶的高靈敏檢測。和傳統(tǒng)方法相比[17-18]，SPR技術(shù)無需標(biāo)記步驟、所需樣品量極少、檢測過程簡單，可以實現(xiàn)磺胺二甲氧嘧啶的實時、快速、無損傷檢測。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

磺胺二甲氧嘧啶抗體：質(zhì)量濃度1 mg/mL，作者所在實驗室自制，半抑制率（IC50）為0.8 ng/mL，LOD為0.31 ng/mL；磺胺二甲氧嘧啶：純度大于90%，干粉，購自Sigma（上海）貿(mào)易有限公司；碳二亞胺（EDC）、N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀及其他分析試劑：購自阿拉丁試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

梅特勒-托利多分析電子天平：上海儀器有限公司產(chǎn)品；Milli-Q Integral Cabinet 3型超純水制備儀：美國Millipore公司產(chǎn)品；XW-80A旋渦混合器：上海精科實業(yè)有限公司產(chǎn)品；可調(diào)移液器：美國Eppendorf公司產(chǎn)品。

1.3 芯片表面修飾磺胺二甲氧嘧啶抗體

首先將磺胺二甲氧嘧啶抗體溶解在10 mmol/L pH 5.0的乙酸鈉溶液中，控制其終濃度為0.05 mg/ mL。其次向傳感器內(nèi)通入pH為7.4 PBS緩沖溶液（包括137 mmol/L氯化鈉，2.7 mmol/L氯化鉀，4.3 mmol/L磷酸氫二鈉，1.4 mmol/L磷酸二氫鉀和1/ 1 000甲醇），控制流量為10 μL/min，觀察基線，待其穩(wěn)定后加入相同體積的4.2 mg/mL EDC和5.0 mg/mL NHS溶液，反應(yīng)5～10 min，活化羧基纖維素，從而形成有活性的NHS-纖維素層。第三，通入PBS緩沖溶液進行沖洗，待基線穩(wěn)定后加入已配制好的磺胺二甲氧嘧啶抗體溶液，抗體上的羧基和纖維素上的氨基形成共價鍵偶聯(lián)。隨后，通入1 mol/L的乙醇胺溶液以封閉為參與反應(yīng)的NHS-纖維素位點。

1.4 基于SPR技術(shù)的磺胺二甲氧嘧啶檢測

將磺胺二甲氧嘧啶溶液按照二倍濃度進行梯度稀釋，分散在pH 7.4 PBS緩沖液中，濃度變化包括5、2.5、1.25、0.63、0.32 ng/mL。將不同濃度的磺胺二甲氧嘧啶溶液依次通入SPR儀，優(yōu)化流入流速和反應(yīng)結(jié)合時間，觀察SPR信號隨時間的變化趨勢。反應(yīng)結(jié)束，用pH 7.4的PBST緩沖液 （包括6.7 mmol/L的磷酸氫二鈉、1.25 mmol/L的磷酸二氫鉀、150 mmol/L的氯化鈉和0.005%的Tween-20）進行洗脫，以去除結(jié)合上的磺胺二甲氧嘧啶，便于下一個樣品的測試。

2 結(jié)果與分析

2.1 實驗原理

實驗主要原理如圖1所示，基片的表面鍍有一層金膜，構(gòu)成傳感芯片的核心部分。在金膜表面修飾一種生物分子如磺胺二甲氧嘧啶抗體，當(dāng)待測溶液流過芯片表面時，待測分子與芯片表面的磺胺二甲氧嘧啶抗體發(fā)生結(jié)合，導(dǎo)致金膜表面介質(zhì)折射率的改變，得到不同角度的反射光的光強，其中使反射光完全消失的入射角即為共振角，金膜表面自由電子受入射光激發(fā)而產(chǎn)生電子震蕩，入射光的能量被轉(zhuǎn)移，形成表面等離子體。記錄角度和反射光強之間變化曲線圖，曲線圖中對應(yīng)波谷處為該曲線的共振角，對應(yīng)的角度即為共振信號，記錄時間和共振信號間的變化曲線即為SPR傳感曲線，分析不同濃度待測溶液下體系共振信號的變化達到對目標(biāo)物的檢測。

圖1 基于SPR技術(shù)的SDM檢測原理圖Fig.1 Schematic illustration of SPR-based SDM detection

2.2 SPR芯片再生測試

在進行實際樣品測定中，由于要接觸不同濃度的待測樣品，SPR芯片在反復(fù)吸附、洗滌等多個循環(huán)過程后使得表面偶聯(lián)分子失去活性或脫落，因此傳感芯片的完整性和重復(fù)性是完成待測樣品高靈敏檢測的關(guān)鍵。其中金屬膜的化學(xué)穩(wěn)定性是一個需要考慮的重要因素，和其他金屬膜相比如銀膜或銅膜相比，金膜的穩(wěn)定性最好，不易被空氣氧化且不易與其他物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)，具有化學(xué)惰性，適合長期使用。如圖2所示，結(jié)合不同質(zhì)量濃度的磺胺二甲氧嘧啶（0.32、0.63、1.25、2.50、5.0 ng/mL）后的 SPR芯片，經(jīng)過多次洗滌和再生之后，測得的響應(yīng)信號較弱，且彼此間并沒有太大的差別，不存在非特異性吸附和交叉感染，SPR可以實時觀測到分子結(jié)合、薄膜形成等表面現(xiàn)象，并能給出高靈敏度、高選擇性同時最小的非特異結(jié)合的信號。再生后的芯片中金膜尚且完整，可重復(fù)利用。

2.3 基于SPR技術(shù)的磺胺二甲氧嘧啶檢測

將不同質(zhì)量濃度的磺胺二甲氧嘧啶溶液通入芯片表面，待測的磺胺二甲氧嘧啶會與修飾在SPR傳感芯片表面的磺胺二甲氧嘧啶抗體直接發(fā)生特異性親和識別反應(yīng)，待測分子和芯片表面的抗體結(jié)合引起金膜和溶液界面折射率的上升，從而導(dǎo)致共振角發(fā)生變化，共振角對應(yīng)的角度為共振信號，從而得到時間與對應(yīng)共振信號的傳感曲線。如圖3所示，當(dāng)待測溶液濃度大，結(jié)合產(chǎn)物多，引起傳感器的響應(yīng)大；當(dāng)待測溶液濃度小，結(jié)合產(chǎn)物少，引起傳感器的響應(yīng)小。因此，待測溶液濃度與傳感器響應(yīng)信號之間存在正比關(guān)系（圖4），當(dāng)在300 s時，響應(yīng)信號達到最大，建立樣品濃度和300 s處響應(yīng)信號間的標(biāo)準(zhǔn)曲線，顯示出較好的線性（R2為0.99），計算出針對磺胺二甲氧嘧啶的LOD為0.19 ng/mL?；赟PR技術(shù)的檢測方法比傳統(tǒng)ELISA方法具有更高的靈敏度，且穩(wěn)定性好，檢測時間短，操作簡單，可以作為ELISA的一種替代技術(shù)，應(yīng)用于待測樣品的測定。

圖2 SPR芯片的再生鑒定Fig.2 Renewable identification of SPR chips

圖3 不同質(zhì)量濃度SDM隨時間變化的SPR響應(yīng)信號Fig.3 Time-variant changes of SPR response signal f SDM with different concentrations

圖4 SDM濃度和SPR響應(yīng)信號的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.4 Standard curve represented the relationship between SDM concentration and SPR response signal

2.4 添加回收試驗

取已采用理化方法確認(rèn)為陰性的奶粉樣品1.0 g共4份，充分溶解于1 mL的超純水中，分別添加不同劑量的SDM，使其終質(zhì)量濃度為0.5、1.0、2.0和4.0 ng/mL。分別加入5 mL乙腈溶液，混合均勻后離心，取上清液真空抽干，分散在1 mL pH 7.4 PBS緩沖液中，加入1 mL正己烷去脂，離心去上層，重復(fù)3次，取下層水相用0.22 μm濾膜進行過濾。將不同含有不同濃度SDM的濾液依次通入SPR儀中，記錄不同SDM濃度下SPR響應(yīng)信號，分析檢測濃度并計算樣品回收率在94.0%～98.3%，結(jié)果見表1。

表1 奶粉樣品中SDM添加回收率Table 1 Recovery of SDM spiked in milk powder

3 結(jié)語

通過在SPR芯片表面修飾針對磺胺二甲氧嘧啶的抗體，鑒于待測抗原和抗體間的特異性親和原理，采用表面等離子共振技術(shù)實現(xiàn)了針對磺胺二甲氧嘧啶濃度的高靈敏檢測，其LOD達到0.19 ng/ mL，奶粉樣品添加回收率在94.0%～98.3%。和傳統(tǒng)ELISA方法相比，表面等離子共振技術(shù)操作簡單、樣品用量少、檢測時間快且靈敏度較高，可以沿向小型化、自動化、多樣化和高通量應(yīng)用目標(biāo)，推廣到食品安全和環(huán)境監(jiān)測應(yīng)用中。

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High Sensitive Detection of Sulfadimethoxine Based on SPR Technique

ZHAO Yuan， XU Liguang， WU Xiaoling， LIU Liqiang， XU Chuanlai*
（School of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

The overdose of sulfa drugs will cause allergic reactions and possibly carcinogenic. Among the all sulfa drugs used in food，sulfadimethoxine（SDM）takes up a large proportion.In this research，a new method based on surface plasmon resonance（SPR）was proposed for the rapid and high sensitive detection of SDM in milk powder.The detection was based on the changes of SPR angles，which was subsequently caused by the changes in the refractive index of gold film induced by the specific recognition of samples by the SDM antibody modified on the surface of SRP chips.A standard curve represented the relationship between SRP response signal and SDM concentration.The limit of detection（LOD）for SDM was as low as 0.19 ng/mL，and the milk powder recovery was in the range of 94.0%～98.3%.Compared with the traditional methods，SPR technique has highsensitivity，high accuracy and easy operation.SPR sensor chips can be repeatedly used for sampledetection in practical application with good integrity.

surface plasmon resonance，biosensor，resonance signal，sulfadimethoxine

TS 207.3

A

1673—1689（2015）07—0699—05

2014-08-25

國家重大科學(xué)儀器設(shè)備開發(fā)專項項目。

趙 媛（1986—），女，江蘇徐州人，工學(xué)博士，副教授，主要從事食品安全檢測研究。E-mail：zhaoyuan0731@126.com

*通信作者：胥傳來（1965—），男，江蘇鹽城人，工學(xué)博士，教授，博士研究生導(dǎo)師，主要從事食品安全研究。E-mail：xcl@jiangnan.edu.cn