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        9順維A酸對人肺腺癌細胞A2增殖及凋亡影響的實驗研究

        2015-01-07 08:53:28游慶軍徐靜靜
        關(guān)鍵詞:維甲酸腺癌受體

        酆 淵, 茆 勇, 游慶軍, 徐靜靜*

        9順維A酸對人肺腺癌細胞A2增殖及凋亡影響的實驗研究

        酆 淵1, 茆 勇2, 游慶軍2, 徐靜靜*2

        (1.江南大學(xué) 食品學(xué)院,江蘇 無錫214122;2.江南大學(xué) 附屬醫(yī)院,江蘇 無錫214062)

        研究9順維A酸(9-cis RA)抑制肺腺癌細胞A2增殖及誘導(dǎo)凋亡的作用并初步探討其作用機制。體外培養(yǎng)A2細胞,隨機分為4組,實驗組加9-cis RA使其終濃度為1、5、10 μmol/L,對照組加入二甲亞砜使其終質(zhì)量分數(shù)為0.1%,采用MTT法檢測各組A2細胞增殖情況;使用流式細胞術(shù)(flow cytometry,F(xiàn)CM)分析藥物作用后各組細胞的凋亡率;用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RTPCR)檢測各組細胞bax、fas、bcl-2基因的變化。9順維A酸對人肺癌細胞株A2增殖均有明顯的抑制作用(P<0.01),實驗組中細胞凋亡發(fā)生率顯著增高(P<0.05),且隨著濃度的升高抑制作用和凋亡率也隨之提高。實驗組bax mRNA、fas mRNA表達顯著高于對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01);實驗組bcl-2 mRNA表達顯著低于對照組,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。結(jié)論9-cis RA具有明顯的抗肺腺癌細胞A2增殖的作用,其機制可能通過上調(diào)bax、fas基因和下調(diào)bcl-2基因表達、誘導(dǎo)細胞凋亡有關(guān)。

        9-順維A酸;肺癌;細胞增殖;細胞凋亡

        維A酸廣泛存在于魚肝油、動物肝臟、奶油、深色蔬菜以及橘色蔬菜水果之中。已證實維A酸類化合物能調(diào)控細胞生長、分化、凋亡等生命活動[1-2],最近的研究表明維甲酸類化合物通過與核維甲酸受體(RARs)及核維甲酸類X受體(RXRs)結(jié)合發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng),在已知的維甲酸類化合物中,9-順維甲酸(9-cis RA)唯一能與這兩類核受體結(jié)合,因為其生物學(xué)活性強于其他維甲酸類化合物而倍受矚目[3-4]。作者旨在觀察9-cis RA誘導(dǎo)肺癌細胞株凋亡與bax、fas和bcl-2基因表達的關(guān)系,為9-cis RA臨床治療肺癌提供新的實驗依據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1 材料

        9-cis RA,純度98%,購自美國Sigma公司;RPMI 1640培養(yǎng)液:購自中科院上海細胞所;胎牛血清:購自美國Sigma公司;M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒:購自美國Bio Basic公司;PCR MasterMix試劑:購自美國Fermentas公司;凝膠電泳用瓊脂糖:購自美國Bio Basic公司;PCR相關(guān)試劑及引物合成:購自上海生工生物技術(shù)有限公司;人肺腺癌細胞株A2:北京中日友好醫(yī)院提供。

        1.2 實驗方法

        A2細胞在37℃、體積分數(shù)5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng),培養(yǎng)液RPMI含體積分數(shù)10%滅活小牛血清及青、鏈霉素各100 U/mL,所有用于實驗的細胞均處于對數(shù)生長期。用含體積分數(shù)10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液配成1×105/mL細胞懸液,接種細胞于 96孔培養(yǎng)板中,每孔100 μL,置37℃、體積分數(shù)5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h后,加入9-cis RA,使實驗組9-cis RA終濃度依次為1、5、10 μmol/l,陰性對照組不含9-cis RA。每濃度設(shè)3個復(fù)孔,各組分別培養(yǎng) 48 h后,按MTT細胞增殖檢測試劑盒操作步驟進行操作。

        以上4組細胞分別培養(yǎng) 48 h后,用不含EDTA的質(zhì)量分數(shù)0.25%胰酶消化,然后分別按以下兩步驟操作:①用PBS洗滌細胞兩次(2 000 r/min離心,5min)收集細胞,加入500 μL的Binding Buffer懸浮細胞,加入5 μL的AnnexinⅤ-FITC混勻后,再加入5 μL的Propidium Iodide混勻,室溫、避光、反應(yīng)5~15 min后,在1 h內(nèi)用流式細胞儀定量分析細胞凋亡水平。實驗重復(fù)3次;② 按Trizol試劑說明書提取總 RNA,引物序列使用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計并在NCBI上進行BLAST對比,引物均由上海生工生物技術(shù)公司合成,通過逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測各組bax、fas、bcl-2 mRNA表達變化。

        1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

        應(yīng)用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進行分析,實驗結(jié)果以均數(shù)±標準差(x±s)表示,組間分析采用單向方差分析 (One-Way-ANOVA)多重比較進行檢驗,P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

        2 結(jié)果

        2.1 9-cis RA對A2細胞增殖的抑制作用

        9-cis RA對人肺癌細胞株A2增殖均有明顯的抑制作用(P<0.01),且隨著濃度的提高抑制率也隨之提高,結(jié)果見表1。

        2.2 9-cis RA對A2細胞作用48h后,對A2細胞凋亡率的影響

        不同濃度9-cis RA作用于肺癌細胞A2 48 h后,經(jīng)流式細胞分析儀檢測。結(jié)果顯示:對照組凋亡率為(6.28±0.23)%;9-cis RA(1 μmol/l)組凋亡率為(10.07±0.53)%;9-cis RA(5 μmol/l)組凋亡率為(10.63±0.14)%;9-cis RA(10 μmol/l)組凋亡率為(15.45±0.41)%。經(jīng)隨機區(qū)組設(shè)計的單因素ANOVA統(tǒng)計軟件分析結(jié)果顯示:與對照組的細胞凋亡率相比,不同濃度9-cis RA組均有所增加,且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);但9-cis RA(1 μmol/l)組與9-cis RA(5 μmol/l)組凋亡率差異不明顯(P>0.05)。

        表1 各組光密度值和細胞抑制率比較Table 1 Comparison of optical density values and cell inhibition rates in each group

        2.3 各組bax mRNA、fas mRNA、bcl-2 mRNA表達變化

        與對照組相比,實驗組 bax mRNA、fas mRNA表達顯著高于對照組,bcl-2 mRNA表達顯著低于對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),見表2。RTPCR檢測目的基因的變化結(jié)果見圖1~3。

        表2 各組作用A2細胞48 h后,目的基因和 β-actin mRNA灰度比Table 2 mRNA gray ratio of target genes to beta-actinin A2 cells after 48 h

        表2 各組作用A2細胞48 h后,目的基因和 β-actin mRNA灰度比Table 2 mRNA gray ratio of target genes to beta-actinin A2 cells after 48 h

        與對照組比較:*P<0.05。

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        圖1 RT-PCR檢測各組bax基因mRNA表達Fig.1 Expression of bax mRNA by RT-PCR

        圖2 RT-PCR檢測各組fas基因mRNA表達Fig.2 Expression of fas mRNA by RT-PCR

        圖3 RT-PCR檢測各組bcl-2基因mRNA表達Fig.3 Expression of bcl-2 mRNA by RT-PCR

        3 討論

        已知細胞內(nèi)的維甲酸受體有兩種形式:即核維甲酸受體(RARs)和核維甲酸類X受體(RXRs),9-cis RA進入細胞后可與這兩類受體結(jié)合。目前認為,RARs-RXRs復(fù)合體是9-cis RA發(fā)揮作用的真正受體形式,9-cis RA與受體復(fù)合物結(jié)合后,激活DNA上特異的維甲酸識別元件,進而影響轉(zhuǎn)錄機制,抑制相關(guān)原癌基因和(或)誘導(dǎo)抑癌基因表達,發(fā)揮其抑制腫瘤細胞增殖和誘導(dǎo)凋亡作用。國外研究發(fā)現(xiàn)9-cis RA在低濃度時作用較弱,而在較高濃度(>10-6mmol/L)對神經(jīng)母細胞瘤的增殖具有明顯抑制作用,并能誘導(dǎo)神經(jīng)母細胞瘤的凋亡[5]。作者研究發(fā)現(xiàn),實驗組中凋亡發(fā)生率顯著高于對照組,而且10 μmol/L 9-cisRA抑制肺癌細胞A2增殖和誘導(dǎo)凋亡作用顯著高于1 μmol/L組和5 μmol/L組,也呈現(xiàn)濃度依賴性,與國外的相關(guān)研究成果一致。

        研究證實9-cisRA誘導(dǎo)肺癌細胞凋亡的機制可能有:通過Rb基因表達增加和cyclinD1基因表達減少途徑誘導(dǎo)肺癌細胞凋亡;通過凋亡抑制基因bcl-2家族對腫瘤細胞的凋亡實施調(diào)控。游慶軍[6-7]等人研究認為9-cisRA可能引起抑癌基因Rb表達增加和原癌基因cyclinD1表達減少,結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子E2F,使癌細胞阻滯在G1期,阻止分化期中的細胞增殖,直接誘導(dǎo)肺癌細胞凋亡或通過影響P53、cmyc、E1A等基因的表達啟動細胞凋亡途徑。更多的研究顯示腫瘤細胞凋亡的調(diào)控可能與死亡受體信息轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中Fas/FasL基因的異常表達有關(guān)。研究表明9-cisRA通過上調(diào)肺癌細胞中fas基因的表達來實現(xiàn)對Fas/FasL信號系統(tǒng)的調(diào)控,同時通過降低bcl-2 mRNA和提高bax mRNA表達促進細胞凋亡。

        Fas屬于腫瘤壞死因子受體(也稱死亡受體)家族,是細胞膜上的糖基化穿膜蛋白,在細胞凋亡過程中發(fā)揮著傳遞細胞凋亡信號作用。細胞表面表達的Fas與FasL交聯(lián)后,形成能傳達信號的活性三聚體 (死亡結(jié)構(gòu)域DD),F(xiàn)as與死亡結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白(FADD)形成二聚體,將凋亡信號傳導(dǎo)至凋亡蛋白酶caspase-8,進而引起一系列酶聯(lián)反應(yīng),激發(fā)下游caspase-3、6、7,最終導(dǎo)致細胞凋亡[8]。作者用RTPCR檢測的結(jié)果顯示實驗組fas表達明顯高于對照組。Bcl-2屬膜蛋白,主要存在于線粒體內(nèi)膜、細胞膜內(nèi)表面、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜、溶酶體膜、核膜等處。Bcl-2具有恢復(fù)線粒體內(nèi)膜的跨膜電位和關(guān)閉線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔的作用,可使線粒體膜通透性降低,阻止凋亡啟動因子釋放,切斷細胞凋亡級聯(lián)反應(yīng)中關(guān)鍵環(huán)節(jié),如抑制促進凋亡的蛋白Bax的毒性作用、抑制caspase激活、維持細胞能鈣的穩(wěn)定等,具有很強的抗凋亡作用;Bax主要促進細胞凋亡。當Bcl-2過表達時,與Bax形成異二聚體抑制細胞凋亡;相反,Bax過表達時,Bax形成同源二聚體促進細胞凋亡。Bcl-2和Bax對細胞凋亡的調(diào)控不僅取決于自身表達水平高低,還與兩者的比例有關(guān),當Bcl-2/ Bax比例減少時,細胞趨于凋亡[9-10]。實驗結(jié)果顯示,實驗組bcl-2表達明顯低于對照組、bax表達明顯高于對照組,細胞凋亡增加。9順維甲酸誘導(dǎo)肺癌細胞A2凋亡可能與fas、bax表達增加,bcl-2表達減少有關(guān),是通過死亡受體途徑及線粒體途徑引起細胞凋亡,從而抑制細胞增殖。

        綜上所述,9順維甲酸具有抑制肺腺癌細胞增殖、促進肺癌細胞凋亡的作用,其機制可能是通過阻滯細胞周期、提高bax、fas基因的表達,降低bcl-2基因的表達實現(xiàn)的,為提高肺癌的治療效果提供一種新的途徑。

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        Effects of 9-Cis-Retinoic Acid on the Proliferation and Apoptosis of Human Lung Cancer Cell Line A2

        FENG Yuan1, MAO Yong2, YOU Qinjun2, XU Jingjing*2
        (1.School of Food Science and Technology,Jiangnan University,Wuxi 214122,China;2.Affiliated Hospital,Jiangnan University,Wuxi 214062,China)

        The study aimed to explore the mechanism of 9-cis-retinoic acid(9-cis RA)inhibiting proliferation and inducing apoptosis in human lung cancer cell line A2.Cultured A2 cells were randomly divided into four groups,the experimental group received 9-cis RA to a final concentration of 1,5 or 10 μmol/L,and the control group was added dimethyl sulfoxide to a final concentration of 0.1%.The MTT method was used for the determination of cell proliferation,flow cytometry(FCM)for the analysis of apoptosis,and reverse transcription-polymerase chain reaction(RT-PCR)for the expression changes of bax,fas and bcl-2 genes.Results showed that 9-cis RA significantly inhibited the cell proliferation(P<0.01)and the incidences of apoptosis in the experimental groups weresignificantly higher(P<0.05),which depended on the concentration of 9-cis RA.The mRNA expressions of bax and fas genes in the experimental groups were significantly higher(P<0.01)whereas the bcl-2mRNA expressionwas significantly lower than the control group(P<0.01). Therefore,9-cis RA significantly inhibitsthe proliferation of human lung cancer cell line A2,which may be related to the increased expressions of bax and fas genes and the decreased expression of bcl-2 gene,and then induced apoptosis.

        9-cis-retinoic acid,lung cancer,cell proliferation,apoptosis

        R 734.2

        A

        1673—1689(2015)07—0779—05

        2014-08-20

        無錫市醫(yī)院管理中心重大項目(YGZX1210)。

        *通信作者:徐靜靜(1983—),女,江蘇泰州人,助理研究員,主要從事抗腫瘤藥物機理研究。E-mail:wxsytsg@126.com

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