易 峰，何銳洪，袁文聲，林惠燕

(中山市中心血站，廣東中山 528400)

·經(jīng)驗(yàn)交流·

不同自身抗體吸收法的比較與分析

易 峰，何銳洪，袁文聲，林惠燕

(中山市中心血站，廣東中山 528400)

目的通過(guò)比較和分析不同的自身抗體吸收法，尋找一個(gè)合適、經(jīng)濟(jì)和有效的自身抗體吸收法，以更好地篩選和鑒定自身免疫性溶血性貧血(AIHA)患者血清中的同種抗體。方法取20例AIHA患者血清，分別采用木瓜蛋白酶自身紅細(xì)胞溫吸收法、聚乙二醇(PEG)自身紅細(xì)胞溫吸收法、木瓜蛋白酶同種紅細(xì)胞吸收法和PEG同種紅細(xì)胞吸收法對(duì)自身抗體進(jìn)行吸收，比較吸收時(shí)間、吸收次數(shù)、吸收后血清抗體鑒定結(jié)果。結(jié)果PEG同種紅細(xì)胞吸收法平均每例吸收1.8次，明顯低于木瓜蛋白酶同種紅細(xì)胞法的平均值4.1次(P<0.05)。兩種方法平均吸收時(shí)間分別為90.0 min和225.1 min，二者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。兩種吸收方法同種抗體的特異性、效價(jià)檢測(cè)結(jié)果一致，均為RH系統(tǒng)的同種抗體。結(jié)論P(yáng)EG法可以快速、經(jīng)濟(jì)和有效去除AIHA患者血清中的自身抗體，便于同種抗體鑒定。

貧血，溶血性，自身免疫性；吸收法；聚乙二醇；木瓜蛋白酶；自身抗體；同種抗體

自身免疫性溶血性貧血(autoimmune hemolytic anemia，AIHA)系體內(nèi)免疫功能調(diào)節(jié)紊亂，產(chǎn)生自身抗體和(或)補(bǔ)體吸附于紅細(xì)胞表面，通過(guò)抗原抗體反應(yīng)加速紅細(xì)胞破壞而引起的一種溶血性貧血。嚴(yán)重溶血和嚴(yán)重貧血的AIHA患者需要輸注血液，但由于多次輸血或是妊娠等原因，大約12%～40%AIHA患者血清中可測(cè)得同種抗體，這些同種抗體可導(dǎo)致溶血性輸血反應(yīng)，故在輸血前若能檢測(cè)出這些同種抗體的特異性，選擇更“兼容”的血細(xì)胞輸注，可減少溶血性輸血反應(yīng)的發(fā)生，而因自身抗體的存在會(huì)干擾同種抗體的篩選和鑒定，故AIHA患者的輸血前檢查首先要通過(guò)各種方法去除自身抗體，以排除其干擾，選擇合適的供者血液。目前常用的自身抗體吸收方法有自身紅細(xì)胞溫吸收法和同種紅細(xì)胞吸收法，而因聚乙二醇(PEG)或木瓜蛋白酶能增強(qiáng)紅細(xì)胞吸附自身抗體的能力，被廣泛應(yīng)用于自身抗體吸收試驗(yàn)[1-2]。本研究擬采用木瓜蛋白酶自身紅細(xì)胞溫吸收法、PEG自身紅細(xì)胞溫吸收法、木瓜蛋白酶同種紅細(xì)胞吸收法和PEG同種紅細(xì)胞吸收法對(duì)自身抗體進(jìn)行吸收，比較4種自身抗體吸收法的吸收時(shí)間、吸收次數(shù)、吸收后血清抗體鑒定結(jié)果，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2013年1月至2014年3月AIHA患者20例，其中男6例，女14例，年齡23～72歲。原發(fā)性患者12例，繼發(fā)性患者8例，均有輸血史或妊娠史，直抗、間抗試驗(yàn)陽(yáng)性(++～++++)，13例紅細(xì)胞表面結(jié)合的單一的免疫球蛋白G(IgG)類(lèi)型的自身抗體，其余7例紅細(xì)胞表面同時(shí)結(jié)合IgG和補(bǔ)體C3(C3c/C3d)。

1．2 儀器與方法

1.2.1 試劑與儀器 抗體篩選細(xì)胞購(gòu)自上海血液生物公司，譜細(xì)胞購(gòu)自上海血液生物公司，抗人球蛋白試劑購(gòu)自長(zhǎng)春博德生物技術(shù)公司，1%木瓜酶，PEG購(gòu)自珠海貝索公司。4200型平板離心機(jī)購(gòu)自日本KUBOTA公司，恒溫振搖式水浴箱購(gòu)自韓國(guó)。

1.2.2 檢測(cè)方法選取 對(duì)于同一份標(biāo)本選擇一種或者多種吸收方法取決于標(biāo)本量或者患者輸血史和貧血嚴(yán)重程度。采用木瓜蛋白酶同種紅細(xì)胞吸收技術(shù)的有2例，PEG同種紅細(xì)胞吸收技術(shù)3例，采用木瓜蛋白酶同種紅細(xì)胞吸收技術(shù)和PEG同種紅細(xì)胞吸收技術(shù)7例，采用木瓜蛋白酶自身紅細(xì)胞吸收技術(shù)和木瓜蛋白酶同種紅細(xì)胞吸收技術(shù)3例，采用PEG自身紅細(xì)胞吸收技術(shù)和PEG同種紅細(xì)胞吸收技術(shù)3例，采用木瓜蛋白酶自身紅細(xì)胞吸收技術(shù)和PEG自身紅細(xì)胞吸收技術(shù)2例。

1.2.3 PEG自身紅細(xì)胞/同種紅細(xì)胞PEG吸收法 PEG溶液的制備方法參照文獻(xiàn)[3]。把等量的患者血清、PEG溶液、未經(jīng)熱放散處理的自身紅細(xì)胞或同種紅細(xì)胞混合，在37 ℃孵育15 min,1 000×g離心5 min，吸取上清液進(jìn)行間抗試驗(yàn)，若陽(yáng)性，則繼續(xù)吸收，直至間抗試驗(yàn)陰性。

1.2.4 木瓜蛋白酶自身紅細(xì)胞/同種紅細(xì)胞吸收法 取輕度熱放散處理后的自身紅細(xì)胞或同種紅細(xì)胞適量，加入1%木瓜蛋白酶溶液處理后，洗滌3遍，加入等量患者血清，37 ℃孵育20 min，1 000×g離心5 min，吸取上清液進(jìn)行間抗試驗(yàn)，若陽(yáng)性，則繼續(xù)吸收，直至間抗試驗(yàn)陰性。

1.2.5 吸收上清液同種抗體鑒定 取自身抗體已徹底吸收干凈的上清液作同種抗體特異性鑒定，方法參照文獻(xiàn)[4]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS11.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)數(shù)資料用頻數(shù)表示，采用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 4種自身抗體吸收試驗(yàn)的比較 PEG同種紅細(xì)胞吸收法完全吸收自身抗體的吸收循環(huán)次數(shù)平均為1.8次，遠(yuǎn)低于木瓜蛋白酶同種紅細(xì)胞吸收法的4.1次(P<0.05)。所需要的平均時(shí)間，PEG同種紅細(xì)胞吸收法為90.0 min而木瓜蛋白酶同種紅細(xì)胞吸收法為225.1 min，比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 4種自身抗體吸收試驗(yàn)的比較

2.2 PEG法與木瓜蛋白酶法對(duì)同種抗體檢測(cè)影響的比較 20例標(biāo)本中7例同時(shí)采用了PEG同種紅細(xì)胞吸收技術(shù)和木瓜蛋白酶同種細(xì)胞吸收技術(shù)，其中3例被檢測(cè)出同種抗體(42.9%)，均為RH系統(tǒng)的同種抗體，單純自身抗體4例，同種抗體的特異性、效價(jià)檢測(cè)結(jié)果一致，見(jiàn)表2。

表2 PEG法與木瓜蛋白酶法對(duì)同種抗體檢測(cè)影響的比較

3 討 論

自身抗體是引起血型鑒定和交叉配血困難的常見(jiàn)因素，當(dāng)AIHA患者血清中同時(shí)存在自身抗體和同種抗體時(shí)，自身抗體常易遮蓋同種抗體的特異性，使同種抗體漏檢而導(dǎo)致嚴(yán)重的輸血反應(yīng)，及時(shí)排除自身抗體的干擾，鑒定出同種抗體，可保證臨床輸血安全，傳統(tǒng)自身抗體吸收(ZAPP)法不僅是耗功和耗時(shí)，而且可能延遲重癥患者的緊急輸血，PEG、低離子鹽(LISS) 木瓜蛋白酶可以增強(qiáng)抗原抗體反應(yīng)，已經(jīng)開(kāi)始逐漸取代ZAPP法[5-6]。

大部分AIHA患者超過(guò)40歲，且多為女性[7]，在本研究中，女性占70%(14/20)，年齡較大，所有患者間接球蛋白試驗(yàn)(IAT)試驗(yàn)呈較強(qiáng)陽(yáng)性(++～++++)。由于本研究對(duì)象大部分近期都曾接受過(guò)輸血，或者貧血癥狀較嚴(yán)重，因此限制了本研究，大部分標(biāo)本不能用自身細(xì)胞溫吸收法吸收患者血清中的自身抗體，只有8個(gè)近期沒(méi)有接受過(guò)輸血且病情比較穩(wěn)定的患者血清應(yīng)用了自身紅細(xì)胞溫吸收法吸收患者血清中的自身抗體，其中只有2名患者取得充足的自身紅細(xì)胞，并且同時(shí)進(jìn)行了PEG自身紅細(xì)胞溫吸收法和木瓜蛋白酶自身紅細(xì)胞溫吸收法。自身細(xì)胞溫吸收法較同種紅細(xì)胞吸收法更快地完成血清自身抗體的吸收，因?yàn)楹笳咝枰羞m當(dāng)表型的紅細(xì)胞，而要準(zhǔn)確獲得患者紅細(xì)胞的表型信息需要對(duì)患者紅細(xì)胞作放散試驗(yàn)，或者應(yīng)用分子技術(shù)檢測(cè)患者紅細(xì)胞表型信息。本研究所有患者的同種抗體均為Rh系統(tǒng)特異性，推薦輸注患者紅細(xì)胞Rh表現(xiàn)型的紅細(xì)胞。

PEG同種紅細(xì)胞吸收法完全吸收自身抗體的吸收循環(huán)次數(shù)平均為1.8次，遠(yuǎn)低于木瓜蛋白酶同種紅細(xì)胞吸收法的4.1次(P<0.05)。結(jié)果與相關(guān)研究相符[1-2]，完全將血清中自身抗體吸收所需要的平均時(shí)間，PEG同種紅細(xì)胞吸收法為90 min而木瓜蛋白酶同種紅細(xì)胞吸收法為225.1 min，本研究木瓜蛋白酶同種紅細(xì)胞吸收法所需時(shí)間較長(zhǎng)的確切原因暫時(shí)沒(méi)法解釋。要在統(tǒng)計(jì)學(xué)上得出PEG自身紅細(xì)胞吸收法和木瓜蛋白酶自身紅細(xì)胞吸收法的比較結(jié)論，需要做更多的樣本，但本研究提示前者所花的時(shí)間較少(平均88.0 min和122.5 min)。

有研究提示，PEG能誘導(dǎo)免疫球蛋白沉淀而減弱抗原抗體反應(yīng)強(qiáng)度，從而減低同種抗體的測(cè)定效價(jià)[8-11]，但在本研究中，所有同時(shí)進(jìn)行PEG吸收法和木瓜蛋白酶吸收法的血清，同種抗體特異性鑒定結(jié)果及效價(jià)均一致，但因?yàn)楸狙芯康臉?biāo)本量較少，不足以證明PEG對(duì)同種抗體鑒定結(jié)果無(wú)影響，可見(jiàn)PEG法主要是在時(shí)間上，方便性上有一定的優(yōu)勢(shì)，在其他方面同木瓜蛋白酶優(yōu)勢(shì)并不大。所以，對(duì)于AIHA患者需要緊急輸血時(shí)，推薦用PEG吸收法，而基于木瓜蛋白酶吸收法對(duì)檢測(cè)血清中同種抗體更敏感，對(duì)于高度懷疑存在同種抗體的患者，如接受過(guò)多次重復(fù)輸血的患者或孕婦，經(jīng)PEG吸收法吸收后同種抗體鑒定結(jié)果陰性，建議使用木瓜蛋白酶吸收法，自身抗體吸收法最好采用自身細(xì)胞進(jìn)行抗體的吸收，以避免同種抗體的漏檢。

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10.3969/j.issn.1671-8348.2015.28.035

易峰(1960-)，本科，副主任醫(yī)師，主要從事輸血方面的研究。

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1671-8348(2015)28-3996-03

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2015-05-16)