左佳妮,孫文聰,馮明星,胡兆農(nóng),吳文君
(西北農(nóng)林科技大學(xué) 農(nóng)藥研究所,陜西 楊凌 712100)
杠柳新苷T作用東方粘蟲(chóng)幼蟲(chóng)中腸細(xì)胞的免疫定位研究
左佳妮,孫文聰,馮明星,胡兆農(nóng),吳文君
(西北農(nóng)林科技大學(xué) 農(nóng)藥研究所,陜西 楊凌 712100)
【目的】 明確杠柳新苷T作用后在東方粘蟲(chóng)幼蟲(chóng)中腸腸壁細(xì)胞中的分布,探討其殺蟲(chóng)作用機(jī)制?!痉椒ā?鑒于杠柳新苷T對(duì)東方粘蟲(chóng)幼蟲(chóng)具有明顯的胃毒活性,而對(duì)小地老虎幼蟲(chóng)無(wú)殺蟲(chóng)活性,采用膠體金免疫電鏡技術(shù),比較觀察了杠柳新苷T處理的東方粘蟲(chóng)幼蟲(chóng)和小地老虎幼蟲(chóng)中腸腸壁細(xì)胞的變化。【結(jié)果】 東方粘蟲(chóng)幼蟲(chóng)經(jīng)杠柳新苷T處理后,膠體金顆粒首先出現(xiàn)在微絨毛上,且密度隨著處理時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸增大,最終破壞微絨毛;同時(shí),膠體金顆粒在細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞器膜上也有出現(xiàn),并損傷細(xì)胞器。小地老虎幼蟲(chóng)經(jīng)杠柳新苷T處理后,中腸腸壁細(xì)胞及細(xì)胞器均沒(méi)有明顯變化,其上也沒(méi)有發(fā)現(xiàn)膠體金顆粒的存在。【結(jié)論】 杠柳新苷T對(duì)東方粘蟲(chóng)幼蟲(chóng)和小地老虎幼蟲(chóng)的選擇性與其在2種試蟲(chóng)中腸腸壁細(xì)胞上的特異性結(jié)合存在顯著差異有關(guān),杠柳新苷T作用東方粘蟲(chóng)幼蟲(chóng)后的初始結(jié)合部位可能是其中腸腸壁細(xì)胞,推測(cè)杠柳新苷T的靶蛋白可能存在于中腸腸壁細(xì)胞膜及細(xì)胞器膜上。
杠柳新苷T;東方粘蟲(chóng);小地老虎;中腸腸壁細(xì)胞;免疫定位
近年來(lái),化學(xué)農(nóng)藥大量使用導(dǎo)致的農(nóng)藥毒害和生態(tài)環(huán)境持續(xù)破壞已經(jīng)引起全世界關(guān)注[1],因此創(chuàng)制安全高效的“生物合理農(nóng)藥”(biorational pesticides)或“環(huán)境相容性農(nóng)藥”(environment compatible pesticides),是符合科學(xué)發(fā)展觀的必由之路[2]。天然產(chǎn)物往往由于其結(jié)構(gòu)新穎、活性獨(dú)特以及對(duì)環(huán)境安全等一系列優(yōu)點(diǎn),成為當(dāng)今世界新農(nóng)藥創(chuàng)制的重要途徑,具有廣泛的應(yīng)用前景[3],如市面上已經(jīng)存在的印楝素、殺蟲(chóng)劑Bt、核型多角體病毒(NPV)及抗菌素等[4]。
國(guó)內(nèi)外已系統(tǒng)研究了杠柳(PeriplocasepiumBunge)的化學(xué)成分及其藥理學(xué)特性[5]。但在農(nóng)用活性方面國(guó)內(nèi)僅有杠柳相關(guān)粗提物活性的報(bào)道,如杠柳根皮的粗提液對(duì)小菜蛾幼蟲(chóng)的活性主要表現(xiàn)為胃毒和拒食,而對(duì)菜青蟲(chóng)幼蟲(chóng)僅表現(xiàn)為拒食活性[6-7];杠柳根皮的正丁醇粗提液對(duì)粘蟲(chóng)幼蟲(chóng)及麥二叉蚜具有毒殺作用[8]。
西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)藥研究所近10多年來(lái)對(duì)杠柳根皮的殺蟲(chóng)活性成分及其致毒機(jī)理進(jìn)行了比較系統(tǒng)的研究,分離得到一系列具有殺蟲(chóng)活性的杠柳新苷類(lèi)化合物[9-10];該類(lèi)化合物對(duì)小菜蛾、粘蟲(chóng)和菜青蟲(chóng)的幼蟲(chóng)均表現(xiàn)為較強(qiáng)的胃毒作用,但對(duì)小地老虎無(wú)任何活性[11-12]。之后以對(duì)該類(lèi)化合物不敏感的小地老虎幼蟲(chóng)作為對(duì)照,研究了杠柳毒素對(duì)敏感的東方粘蟲(chóng)幼蟲(chóng)中腸腸壁細(xì)胞的影響,推測(cè)昆蟲(chóng)中腸可能是其作用部位[13],推斷該類(lèi)化合物可能為一類(lèi)新型的“昆蟲(chóng)消化毒劑”。據(jù)此,以高殺蟲(chóng)活性的化合物杠柳新苷T為抗原制備了其多克隆抗體[14]。
本研究利用膠體金免疫定位技術(shù),以杠柳毒素T處理的小地老虎幼蟲(chóng)中腸腸壁細(xì)胞為對(duì)照,對(duì)杠柳毒素T在東方粘蟲(chóng)幼蟲(chóng)中腸腸壁細(xì)胞內(nèi)的分布進(jìn)行免疫定位,旨在為進(jìn)一步闡明杠柳毒素T對(duì)東方粘蟲(chóng)幼蟲(chóng)的作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。
1.1 試驗(yàn)動(dòng)物
小地老虎(Agrotisypsilon)、東方粘蟲(chóng)(Mythimnaseparata)均由本實(shí)驗(yàn)室養(yǎng)蟲(chóng)室提供,室內(nèi)人工飼養(yǎng)多代,挑選6齡粘蟲(chóng)饑餓24 h后供試。
1.2 供試藥劑及主要儀器
杠柳新苷T(純度大于95%),由本實(shí)驗(yàn)室提供,用丙酮將其配成10 mg/mL供試。
LKBU型超薄切片機(jī)及JEM-22000EX 透射電子顯微鏡。
1.3 處理方法
以載毒葉碟法飼喂試蟲(chóng):在小麥葉片(0.5 cm×0.5 cm)上涂布1 μL 10 mg/mL供試藥劑,待溶劑揮發(fā)干后,將試蟲(chóng)與葉片一起放入培養(yǎng)皿中,處理后5,8,10 h取樣,對(duì)照組試蟲(chóng)以涂布1 μL丙酮的小麥葉片進(jìn)行相同處理。
1.4 抗 體
一抗:鼠抗杠柳新苷T的多克隆抗體,由西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)藥研究所提供[14],其稀釋倍數(shù)為1∶10。
二抗:15 nm膠體金標(biāo)記羊抗鼠IgG,購(gòu)自TED PELLA公司,其稀釋倍數(shù)為1∶20。
1.5 樣品制備及染色方法
(1)將對(duì)照及處理5,8,10 h后的試蟲(chóng),冰浴中迅速解剖中腸,用生理鹽水清洗除掉殘?jiān)?2)前固定用40 mL/L戊二醛,沉底后清洗用2.5%戊二醛;洗凈鋨酸,避光固定30~40 min,此步試驗(yàn)在4 ℃下進(jìn)行;(3)清除殘留固定液:0.1 mol/L的磷酸鹽緩沖液(PBS)沖3次,5 min/次;(4)清除殘留PBS,1%的鋨酸固定40~50 min;(5)清除固定液:0.1 mol/L PBS沖3次,10 min/次;(6)梯度脫水:體積分?jǐn)?shù)30%,50%,70%,80%,90%(2次)及100%(3次)丙酮,10 min/次;(7)脫水后,用1∶1的滲透液(純Epon812環(huán)氧樹(shù)脂包埋劑與100%丙酮)滲透2 h;接著2∶1的滲透液(純包埋劑與100% 丙酮)滲透2 h;最后在純包埋劑中輕微搖動(dòng)過(guò)夜;(8)滲透后,將其定向包埋在包埋模具中,在37 ℃、45 ℃和60 ℃的溫箱中分別聚合16 h、24 h和48 h;(9)用超薄切片機(jī)切片,并放于鎳網(wǎng)上;(10)將鎳網(wǎng)切片進(jìn)行1 h封閉(1%明膠及1%BSA);(11)將其孵育在第一抗體上(1∶10,一抗稀釋液稀釋),在室溫下孵育2 h;(12)3次BSA洗滌,2次PBS洗滌(10 min/次);(13)孵育1 h:切片與稀釋的膠體金標(biāo)記的羊抗鼠二抗(用PBS 1∶20稀釋);(14)3次二抗稀釋液清洗,10 min/次;(15)2次雙蒸水清洗,10 min/次,晾干;(16)染色8 min(醋酸雙氧鈾);(17)染色5 min(檸檬酸鉛);(18)用透射電鏡觀察并拍照。 對(duì)照組處理方法:第11步用1% BSA替換一抗與鎳網(wǎng)切片進(jìn)行孵育;其他步驟同處理組。對(duì)照組和處理組在相同批次下進(jìn)行。
2.1 杠柳新苷T作用東方粘蟲(chóng)的免疫定位
杠柳新苷T處理東方粘蟲(chóng)5 h后,在微絨毛上分布著極少量的膠體金顆粒,中腸細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞質(zhì)密度下降和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張;處理后8 h,微絨毛上膠體金顆粒的數(shù)量增多,細(xì)胞內(nèi)部也可看到少量膠體金顆粒的分布,中腸腸壁細(xì)胞可見(jiàn)到線(xiàn)粒體腫脹,個(gè)別線(xiàn)粒體的內(nèi)脊和雙層膜變得模糊;處理后10 h,大量的膠體金顆粒出現(xiàn)在細(xì)胞的微絨毛上及細(xì)胞內(nèi)部,大部分細(xì)胞器也受到嚴(yán)重?fù)p傷。從處理時(shí)間來(lái)看,隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng),膠體金顆粒出現(xiàn)得越來(lái)越多,范圍也越來(lái)越廣,并且大部分存在于粘蟲(chóng)中腸腸壁細(xì)胞膜上。而對(duì)照組粘蟲(chóng)幼蟲(chóng)的中腸細(xì)胞膜系統(tǒng)上及細(xì)胞內(nèi)部均沒(méi)有發(fā)現(xiàn)膠體金顆粒,中腸細(xì)胞也沒(méi)有明顯的病變(圖1)。
圖1 杠柳新苷T對(duì)東方粘蟲(chóng)中腸腸壁細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響A.對(duì)照微絨毛(10 000×);B.處理5 h微絨毛(40 000×);C.處理8 h微絨毛(40 000×);D.處理10 h微絨毛(40 000×);E.對(duì)照線(xiàn)粒體(80 000×); F.處理5 h線(xiàn)粒體(40 000×);G.處理8 h線(xiàn)粒體(40 000×);H.處理10 h線(xiàn)粒體(40 000×);I.對(duì)照內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(40 000×);J.處理5 h內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(40 000×);K.處理8 h內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(40 000×);L.處理10 h內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(40 000×);MV.微絨毛;M.線(xiàn)粒體;ER.內(nèi)質(zhì)網(wǎng);CG.膠體金顆粒
2.2 杠柳新苷T作用小地老虎的免疫定位
經(jīng)杠柳新苷T處理5,8,10 h后,小地老虎幼蟲(chóng)的中腸細(xì)胞處理組和對(duì)照組均沒(méi)有發(fā)現(xiàn)膠體金顆粒的存在,中腸腸壁細(xì)胞及細(xì)胞器均無(wú)明顯病變(圖2)。結(jié)果說(shuō)明,小地老虎幼蟲(chóng)中腸腸壁細(xì)胞上沒(méi)有結(jié)合杠柳新苷T。
圖2 杠柳新苷T對(duì)東方小地老虎中腸腸壁細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響 A.對(duì)照微絨毛(10 000×);B.處理5 h微絨毛(40 000×);C.處理8 h微絨毛(40 000×);D.處理10 h微絨毛(40 000×);E.對(duì)照線(xiàn)粒體(80 000×);F.處理5 h線(xiàn)粒體(40 000×);G.處理8 h線(xiàn)粒體(40 000×);H.處理10 h線(xiàn)粒體(40 000×);I.對(duì)照內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(40 000×);J.處理5 h內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(40 000×);K.處理8 h內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(40 000×);L.處理10 h內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(40 000×);MV.微絨毛;M.線(xiàn)粒體;ER.內(nèi)質(zhì)網(wǎng);CG.膠體金顆粒
免疫膠體金技術(shù)(IGG)具有靈敏度高和分辨力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)[15]。本研究首先利用杠柳毒素T的多克隆抗體及其蛋白容易標(biāo)記的特性對(duì)杠柳新苷T進(jìn)行了間接性的標(biāo)記,同時(shí),采用IGG方法與杠柳毒素T進(jìn)行了體內(nèi)結(jié)合,結(jié)果表明杠柳新苷T主要在粘蟲(chóng)幼蟲(chóng)中腸腸壁細(xì)胞膜系統(tǒng)(細(xì)胞膜和細(xì)胞器膜)上有結(jié)合;另外,對(duì)細(xì)胞的結(jié)構(gòu)本身也造成了相當(dāng)大的損傷。此前杠柳毒素NW對(duì)粘蟲(chóng)中腸作用的超微結(jié)構(gòu)和熒光定位研究表明,杠柳毒素NW對(duì)粘蟲(chóng)中腸細(xì)胞膜及其細(xì)胞器膜的破壞是其主要的致毒機(jī)制,并推斷昆蟲(chóng)中腸腸壁細(xì)胞膜可能是杠柳毒素NW的結(jié)合位點(diǎn)[13]。本研究在初步證實(shí)上述推測(cè)的可靠性以外,還進(jìn)一步明確了杠柳毒素能夠與東方粘蟲(chóng)中腸腸壁細(xì)胞的細(xì)胞膜及細(xì)胞器膜結(jié)合,這些膜系統(tǒng)上可能存在其結(jié)合的特異性蛋白。
免疫電鏡組織定位技術(shù)在研究中最常用的方法有2種,一是采用不同大小的膠體金顆粒作標(biāo)記的包埋后雙重標(biāo)記法;另一種是包埋前免疫電鏡染色法與包埋后膠體金標(biāo)記法相結(jié)合的雙重標(biāo)記法[16-17]。本研究借鑒了苦皮藤素V免疫電鏡組織定位中采用的方法[18],結(jié)果表明杠柳新苷T在細(xì)胞內(nèi)部也可以結(jié)合,分析可能原因?yàn)椋皇歉芰舅豑與粘蟲(chóng)中腸細(xì)胞膜上的結(jié)合蛋白可以特異結(jié)合,通過(guò)特殊的離子通道進(jìn)入到細(xì)胞的內(nèi)部;二是杠柳新苷T與粘蟲(chóng)中腸細(xì)胞膜上的結(jié)合蛋白結(jié)合后,直接導(dǎo)致中腸細(xì)胞膜破裂,打破了中腸內(nèi)外的離子平衡。但是,具體的作用機(jī)制目前還不清楚。
“消化毒劑”的概念自1997年提出[19]后,已經(jīng)有不少關(guān)于消化毒劑的報(bào)道,消化毒劑的致毒機(jī)理最可能是,其對(duì)試蟲(chóng)中腸細(xì)胞膜和內(nèi)膜系統(tǒng)具有破壞作用。采用免疫電鏡組織定位技術(shù)發(fā)現(xiàn),苦皮藤素V在中毒粘蟲(chóng)的中腸上皮細(xì)胞上有結(jié)合[18],動(dòng)物源殺蟲(chóng)活性物質(zhì)斑蝥素對(duì)粘蟲(chóng)消化系統(tǒng)起作用主要是導(dǎo)致了粘蟲(chóng)中腸細(xì)胞膜和內(nèi)膜系統(tǒng)的破壞[20]。本研究結(jié)果表明,杠柳毒素的作用位點(diǎn)位于試蟲(chóng)中腸細(xì)胞膜及其內(nèi)膜系統(tǒng)上。盡管這些研究表明,消化毒劑的作用位點(diǎn)位于試蟲(chóng)中腸細(xì)胞膜及其內(nèi)膜系統(tǒng)上,但是它們與中腸細(xì)胞膜特異性結(jié)合以及其與膜的結(jié)合位點(diǎn)仍不清楚,因此,對(duì)于杠柳毒素T在膜上的結(jié)合位點(diǎn)或者其在試蟲(chóng)中腸上的作用靶標(biāo)仍待進(jìn)一步研究。
杠柳新苷T對(duì)東方粘蟲(chóng)幼蟲(chóng)和小地老虎幼蟲(chóng)的選擇性與其在2種試蟲(chóng)中腸腸壁細(xì)胞上的特異性結(jié)合存在顯著差異有關(guān),杠柳新苷T作用東方粘蟲(chóng)幼蟲(chóng)后的初始結(jié)合部位可能是其中腸腸壁細(xì)胞,推測(cè)杠柳新苷T的靶蛋白可能存在于中腸腸壁細(xì)胞膜及細(xì)胞器膜上。
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Immunolocalization of periplocoside T fromPeriplocasepiumBunge in larvae midgut of oriental amyworm,MythimnaseparataWalker (Lepidoptera:Noctuidae)
ZUO Jia-ni,SUN Wen-cong,FENG Ming-xing,HU Zhao-nong,WU Wen-jun
(PesticideResearchInstitute,NorthwestA&FUniversity,Yangling,Shaanxi712100,China)
【Objective】 The objective of this research was to figure out the distribution of periplocoside T (PST) in midgut cell ofMythimnaseparatalarvae after treatment by PST and explore its action mechanism.【Method】 Since PST has stomach toxicity toM.separatalarvae while has no activity toAgrotisypsilonlarvae,the changes of midgut wall cells of these two insects after treatment with PST were observed comparatively using immune-electron microscopy (TEM).【Result】 After treatment with PST,gold particles appeared on the microvilli layer of the midgut ofM.separatalarvae firstly.The density of gold particles gradually increased and destructed microvilli layer severely at last.Meantime,gold particles also appeared on the intracellular organelles membrane and the organelles were also destructed.For the control ofA.ypsilonlarvae,there was no effect and no gold particle appeared.【Conclusion】 The selectivity of PST to these insects was related to the significant difference of its special binding with these two insects.The midgut intestinal wall cells may be the original binding site of PST.It was speculated that the target protein of PST may exist on cell membranes and organelles membranes.
periplocoside T (PST);Mythimnaseparata;Agrotisypsilon;midgut cells;immuno-localization
時(shí)間:2015-10-13 08:46
10.13207/j.cnki.jnwafu.2015.11.017
2014-03-28
國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31171868);國(guó)家公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專(zhuān)項(xiàng)(200903052)
左佳妮(1990-),女,甘肅慶陽(yáng)人,碩士,主要從事昆蟲(chóng)毒理學(xué)研究。E-mail:zoey@nwsuaf.edu.cn
胡兆農(nóng)(1970-),男,甘肅臨夏人,教授,博士生導(dǎo)師,主要從事天然產(chǎn)物農(nóng)藥和昆蟲(chóng)毒理學(xué)研究。 E-mail:huzhaonong@nwsuaf.edu.cn
S432.2
A
1671-9387(2015)11-0118-05
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