鄒曉華 ，陳明潔，方 瑯，張 揚(.解放軍第7 醫(yī)院藥劑科，浙江 杭州 3003;.浙江省中醫(yī)藥研究院中藥研究中心，浙江 杭州 30007)

感冒熱毒清合劑(南制字2011F19001)為解放軍第117 醫(yī)院(以下簡稱“我院”)結(jié)合長年的臨床實踐，并進行處方篩選，研制成的質(zhì)量穩(wěn)定、作用快、療效好、治療感冒的純中藥制劑，具有清熱解毒，抗菌消炎等功效，用于治療流行性感冒，上呼吸道感染，扁桃腺炎，咽喉炎等各種疾病。該合劑由金銀花、板藍根、連翹等組成。其中，金銀花有“中藥中的抗菌素”之稱，可清熱解毒、疏散風熱，多用于癰腫疔瘡，喉痹，丹毒，熱毒血痢，風熱感冒，溫病發(fā)熱［1］等證，而綠原酸為金銀花的主要成分之一。目前，感冒熱毒清合劑質(zhì)量標準中有性狀、鑒別、檢查等檢驗項目，但尚未建立組方中主要成分綠原酸的含量測定方法［2］。本研究選取金銀花中綠原酸為指標成分，為了更好地控制本品質(zhì)量，采用高效液相色譜法(high performance liquid chromatography，HPLC)對感冒熱毒清合劑中綠原酸的含量進行測定。

1 材料

1.1 儀器

高效液相色譜儀LC-20A 型(日本島津)、電子天平AE240(瑞士METTLER)、HH-S 數(shù)控恒水浴鍋(金華市文華科教實驗儀器廠)、KQ-400DB 型數(shù)控超聲清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 藥品與試劑

綠原酸對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號:110753-201314);感冒熱毒清合劑供試品(解放軍第117 醫(yī)院制劑室，批號:20140218、20131220、20140401、20140117、20131024);正丁醇為分析純(天津市永化化學試劑有限公司，批號:20120507)，氨水為分析純(浙江三鷹化學試劑有限公司，批號:20130901)。甲醇、乙腈均為色譜純(德國MERCK 公司，批號:20140114)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

綠原酸的色譜條件:色譜柱為SHISEIDO CAPCELL PAK MG-C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動相乙腈-0.4%磷酸(V ∶V =88 ∶12)，檢測波長327 nm，流速為1.0 ml/min，柱溫40 ℃，理論板數(shù)按綠原酸峰計算，應(yīng)不低于1 000。

2.2 溶液的配制

2.2.1 對照品溶液制備:精密稱取綠原酸對照品10.04 mg，加入至25 ml 棕色容量瓶中，用50%甲醇溶解并定容至刻度，即為綠原酸對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液制備:取感冒熱毒清合劑樣品25 ml，加入到50 ml 棕色容量瓶中，加甲醇至刻度，超聲提取30 min，冷卻后，用甲醇補足體積，作為綠原酸含量測定的供試品溶液。

2.2.3 陰性對照溶液制備:按處方組分比例及工藝制備要求，制成不含金銀花的陰性對照溶液適量，按供試品溶液制備方法制成陰性對照溶液。

2.3 專屬性考察

分別精密吸取對照品溶液、供試品溶液及陰性對照品溶液各20 μl 注入液相色譜儀，測定，結(jié)果陰性對照品溶液在綠原酸峰相應(yīng)的保留時間附近無干擾峰出現(xiàn)，見圖1。

圖1 綠原酸、感冒熱毒清合劑及陰性對照品HPLC 圖Fig 1 HPLC chromatogram of reference substance of chlorogenic acid，GMRDQ mistura and negative reference substance

2.4 線性關(guān)系考察

精密量取綠原酸對照品溶液，進行梯度稀釋，注入液相色譜儀各10 μl，記錄綠原酸峰面積。以綠原酸質(zhì)量濃度(X)為橫坐標，綠原酸峰面積(Y)為縱坐標，進行線性回歸，得回歸方程:Y=230 09X+516 45，r=0.999 5。結(jié)果表明，綠原酸對照品濃度在5.02 ～100.4 μg/ml 范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.5 精密度試驗

精密吸取綠原酸對照品溶液10 μl，重復進樣5 次，測定峰面積。結(jié)果顯示，平均峰面積的RSD=0.99%，表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗

取批號為20131220 的感冒熱毒清合劑，按照“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，分別于常溫條件放置0，4，8，12，24 h后，分別進樣20 μl，記錄綠原酸峰面積。結(jié)果顯示，RSD=1.45%，表明供試品溶液至少在24 h 內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.7 重現(xiàn)性試驗

照“2.2.2”項下方法，將同一批次，批號為20131220 樣品平行制備5 份供試品溶液，分別測定綠原酸的含量，結(jié)果顯示，RSD=1.30%，表明方法重現(xiàn)性良好。

2.8 加樣回收率試驗

取已知含量的感冒熱毒清合劑適量，共6 份，每份10 ml，分別精密加入高、中、低濃度的綠原酸對照品溶液，置25 ml 棕色容量瓶中，用甲醇補足體積。按“2.2.2”項下方法操作，測定并計算綠原酸的加樣回收率，結(jié)果見表1。

表1 綠原酸加樣回收率試驗結(jié)果Tab 1 Results of recovery test on chlorogenic acid

2.9 樣品含量測定

取感冒熱毒清合劑4 批樣品(批號:20140218、20131220、20140401、20140117、20131024)，按2.2.2項下供試品溶液制備方法制備供試品溶液，精密吸取20 μl，注入HPLC 儀中進行綠原酸含量測定，結(jié)果見表2。

表2 感冒熱毒清合劑樣品含量測定結(jié)果Tab 2 Determination results of contents of GMRDQ mistura samples

3 討論

感冒熱毒清合劑組方中主要成分為金銀花。研究結(jié)果顯示，金銀花提取物及其所含的化學成分具有多種藥理活性，包括抗炎、抗菌、抗病毒、抗氧化、保肝、抗腫瘤等。針對該制劑探求金銀花的質(zhì)量標準研究，建立一種有效的檢測方法，對嚴格把控制劑質(zhì)量具有重要意義［3］。

感冒熱毒清合劑成分復雜，在供綠原酸含量測定用的供試品溶液制備過程中，因綠原酸不穩(wěn)定性和見光分解的特性，采用甲醇為提取溶劑，并在棕色瓶中保存，提取效率高［4-5］。大量研究結(jié)果顯示［6-13］，金銀花藥材的質(zhì)量受到產(chǎn)地、氣候、生態(tài)環(huán)境、采收期和加工方法等因素的影響。不同批號的樣品由于原材料產(chǎn)地、采集時節(jié)不同，存放時間及條件不同，對合劑中的綠原酸含量有較大的影響。因此，該合劑的質(zhì)量控制應(yīng)嚴格從源頭抓起，即嚴格把握原藥材的質(zhì)量。另外，金銀花中的綠原酸是一種極不穩(wěn)定的成分，在提取、灌裝及保存過程中應(yīng)注意閉光，并使用深色容器。

課題組前期已對于感冒熱毒清合劑中的連翹苷和綠原酸進行定性鑒別，但尚未建立綠原酸的含量測定方法。本研究建立了金銀花中綠原酸指標成分的含量測定方法，該方法結(jié)果準確，重復性好，可作為醫(yī)院制劑-感冒熱毒清合劑的質(zhì)量評價方法［14-15］。

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