王宏霞，王國(guó)祥，蔡子平

（1.甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院中藥材研究所，甘肅蘭州 730070；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，甘肅蘭州 730070；3.甘肅省中藥材種質(zhì)改良與質(zhì)量控制工程實(shí)驗(yàn)室，甘肅蘭州 730070）

培養(yǎng)基對(duì)當(dāng)歸愈傷組織的誘導(dǎo)及分化影響研究

王宏霞1，3，王國(guó)祥1，2，3，蔡子平1，3

（1.甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院中藥材研究所，甘肅蘭州 730070；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，甘肅蘭州 730070；3.甘肅省中藥材種質(zhì)改良與質(zhì)量控制工程實(shí)驗(yàn)室，甘肅蘭州 730070）

以當(dāng)歸種子為材料，研究激素組合、培養(yǎng)基對(duì)當(dāng)歸愈傷組織的誘導(dǎo)及植株再生的影響。結(jié)果表明：適宜當(dāng)歸愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng)基為H+0.5 mg/L 2，4-D，出愈率達(dá)到97.92%。繼代增殖最佳培養(yǎng)基為H+0.5 mg/L 2，4-D+1.0 mg/L IAA。誘導(dǎo)叢生芽的最佳培養(yǎng)基為1/2MS+0.5 mg/L 6-BA+1.0 mg/L NAA+0.5 mg/L ZT，最高誘導(dǎo)率為90.3%。適合無(wú)根苗生根的培養(yǎng)基為1/2MS+0.5 mg/L IAA，生根率達(dá)35.5%。

當(dāng)歸；組織培養(yǎng)；再生體系；培養(yǎng)基

當(dāng)歸［Angelica sinensis（Oliv.）Diels］為傘形科多年生草本植物，藥用植物，藥用部位肉質(zhì)直根具有補(bǔ)血、和血、調(diào)經(jīng)止痛等作用［1～2］，主產(chǎn)于甘肅省東南部，是甘肅的特色中藥材。

雖然當(dāng)歸的組織培養(yǎng)研究已開(kāi)展多年［3～4］，但有關(guān)當(dāng)歸組織培養(yǎng)器官發(fā)生的文獻(xiàn)報(bào)道較少［5～8］。進(jìn)行當(dāng)歸無(wú)菌苗培養(yǎng)和愈傷組織誘導(dǎo)研究，優(yōu)化培養(yǎng)條件，提高誘導(dǎo)增殖率，利用離體快繁的方式來(lái)獲得性狀穩(wěn)定的種苗，有助于替代傳統(tǒng)的育苗方式，解決早期抽苔，保護(hù)當(dāng)歸種植區(qū)的植被和生態(tài)環(huán)境，并為當(dāng)歸種苗工廠化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

培養(yǎng)材料為甘肅岷縣茶埠鄉(xiāng)當(dāng)年采集的新鮮種子。

1.2 方法

1.2.1 外植體建立以當(dāng)年產(chǎn)新鮮種子為材料，按組培要求接種于1/2 MS培養(yǎng)基中進(jìn)行無(wú)菌苗的培養(yǎng)。真葉抽出生長(zhǎng)7 d后，在無(wú)菌條件下將葉柄切成0.5～1.0 cm的小塊，接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基。

1.2.2 誘導(dǎo)培養(yǎng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基以H培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，分別添加0.25、0.50、1.00、2.00 mg/L 2，4-D，觀察記載愈傷組織生長(zhǎng)、形態(tài)變化情況，20 d后統(tǒng)計(jì)誘導(dǎo)率。

1.2.3 繼代培養(yǎng)誘導(dǎo)培養(yǎng)15 d后，將初誘導(dǎo)出的愈傷組織切成小塊，轉(zhuǎn)接到以H為基本培養(yǎng)基，分別添加0.5、1.0、2.0 mg/L 2，4-D和0、0.5、1.0 mg/L IAA的繼代培養(yǎng)基中培養(yǎng)。每處理16瓶，每瓶3塊。每天觀察統(tǒng)計(jì)生長(zhǎng)情況，20 d后統(tǒng)計(jì)出愈率。

1.2.4 分化培養(yǎng)挑選質(zhì)量好的愈傷組織，經(jīng)過(guò)2～3次繼代培養(yǎng)后，接種到以MS和1/2MS為基本培養(yǎng)基，并添加了0.5、1.0 mg/L 6-BA和1.0、1.5 mg/L IAA及0、0.5 mg/L ZT的分化培養(yǎng)基上進(jìn)行分化培養(yǎng)。每天觀察統(tǒng)計(jì)生長(zhǎng)情況，30 d后統(tǒng)計(jì)分化率。

1.2.5 生根培養(yǎng)將分化出的綠芽轉(zhuǎn)接到用MS和1/2MS作為基本培養(yǎng)基，添加0、0.5 mg/L KT和0.5 mg/L IAA兩種激素的生根培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，觀察統(tǒng)計(jì)生長(zhǎng)情況，20 d后統(tǒng)計(jì)生根率。

1.3 培養(yǎng)條件

培養(yǎng)室溫度為（25±2）℃，光照強(qiáng)度為1 500～1 800 Lx，光照12 h/d。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析方法

對(duì)有關(guān)的試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用DPS和Excel軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 誘導(dǎo)培養(yǎng)基對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響

從表1可以看出，各種誘導(dǎo)培養(yǎng)基均能較好的誘導(dǎo)出愈傷組織。隨著2，4-D濃度的增大，愈傷組織的誘導(dǎo)率先升高后下降，且愈傷組織褐化逐漸嚴(yán)重，2.00 mg/L時(shí)褐化程度最大。2，4-D濃度為0.25 mg/L和0.50 mg/L時(shí)，誘導(dǎo)出的愈傷組織顏色鮮亮，呈黃白色、疏松團(tuán)塊狀，生長(zhǎng)旺盛，以0.50 mg/L誘導(dǎo)率最高。可見(jiàn)，H+0.50 mg/L 2，4-D培養(yǎng)基為當(dāng)歸適宜誘導(dǎo)培養(yǎng)基。

表1 不同誘導(dǎo)培養(yǎng)基愈傷組織的誘導(dǎo)率

2.2 繼代培養(yǎng)基對(duì)愈傷組織出愈率的影響

觀察發(fā)現(xiàn)，當(dāng)歸愈傷組織多呈疏松團(tuán)塊狀，淡黃白色。由表2可以看出，在H培養(yǎng)基中僅添加2，4-D時(shí)，愈傷組織均無(wú)增殖現(xiàn)象，且隨著2，4-D濃度的增加出愈率逐漸降低。2，4-D濃度在0.50 mg/L時(shí)出愈率最高，為97.92%；2，4-D濃度為2.00 mg/L時(shí)誘導(dǎo)出的愈傷組織極容易褐化。2，4-D和IAA同時(shí)使用，低濃度的2，4-D配合較高濃度的IAA可產(chǎn)生大量的顆粒狀愈傷組織，而高濃度的2，4-D對(duì)愈傷組織的增殖有抑制作用。以H+0.50 mg/L 2，4-D誘導(dǎo)愈傷組織效果最好，出愈率達(dá)90%以上。以H+0.50 mg/L 2，4-D+1.00 mg/L IAA增殖效果最好。

2.3 分化培養(yǎng)基對(duì)愈傷組織分化培養(yǎng)的影響

質(zhì)量好的愈傷組織，經(jīng)過(guò)2～3次繼代培養(yǎng)后，接種到分化培養(yǎng)基上。7 d后部分分化出結(jié)構(gòu)較致密而光滑、顏色多為黃綠色的突起，15 d后可以看見(jiàn)綠色的芽點(diǎn)，30 d左右有叢生芽生成。由表3看出，不同種類基本培養(yǎng)基和不同濃度的激素組合成的分化培養(yǎng)基，對(duì)叢生芽的誘導(dǎo)有很大影響，在6-BA和NAA濃度一定的情況下，以1/2MS為基本培養(yǎng)基的叢生芽誘導(dǎo)率明顯高于MS。以MS為基本培養(yǎng)基時(shí)，芽分化率明顯降低，并且芽顏色偏白，脆弱，生長(zhǎng)緩慢，玻璃化程度高。在同等6-BA和NAA條件下，當(dāng)添加ZT時(shí)，愈傷組織分化成苗的幾率明顯增加，且分化的叢生芽色呈黃綠色，生長(zhǎng)健壯。綜合分析，1/2 MS+0.5mg/L 6-BA +1.0 mg/L NAA+0.5 mg/L ZT為誘導(dǎo)叢生芽的最佳分化培養(yǎng)基。

表2 不同繼代培養(yǎng)基的愈傷組織出愈率

表3 不同分化培養(yǎng)基的愈傷組織分化率

表4 不同生根培養(yǎng)基對(duì)生根率的影響

2.4 生根培養(yǎng)基對(duì)生根率的影響

由表4可以看出，叢生芽在不同培養(yǎng)基上生根情況不同，單獨(dú)使用IAA均能長(zhǎng)出簇狀根，配合使用KT時(shí)，叢生芽增殖明顯，但未見(jiàn)有生根現(xiàn)象，說(shuō)明KT對(duì)當(dāng)歸根的誘導(dǎo)無(wú)促進(jìn)作用，對(duì)叢生芽的增殖有明顯的促進(jìn)作用。綜合分析，適合當(dāng)歸無(wú)根苗生根的培養(yǎng)基為1/2 MS+0.5 mg/L IAA。

3 小結(jié)與討論

1）試驗(yàn)結(jié)果表明，適宜當(dāng)歸誘導(dǎo)愈傷組織培養(yǎng)基為H+0.5 mg/L 2，4-D，出愈率達(dá)到97.92%。繼代增殖最佳培養(yǎng)基為H+0.5 mg/L 2，4-D+1.0 mg/L IAA。誘導(dǎo)叢生芽的最佳培養(yǎng)基為1/2 MS+0.5 mg/L 6-BA+1.0 mg/L NAA+0.5 mg/L ZT，最高誘導(dǎo)率為90.3%。適合無(wú)根苗生根的培養(yǎng)基為1/2MS+0.5 mg/L IAA，生根率達(dá)35.5%。

2）植物細(xì)胞脫分化是一個(gè)復(fù)雜的生理生化過(guò)程，植物激素在其中發(fā)揮著重要作用，不同種類、不同質(zhì)量濃度的植物激素組合對(duì)愈傷組織的誘導(dǎo)和繼代培養(yǎng)影響不同［9］。在植物材料的組織培養(yǎng)中，愈傷組織的分化是最為關(guān)鍵的一步，其主要受外植體本身、培養(yǎng)基等因素的調(diào)控［10］。在相關(guān)組織培養(yǎng)的報(bào)道中，對(duì)愈傷組織的誘導(dǎo)多選用2，4-D質(zhì)量濃度為1～5 mg/L［11］。在本試驗(yàn)中，高濃度的2，4-D對(duì)當(dāng)歸愈傷組織的生長(zhǎng)及其形態(tài)有不利影響，單獨(dú)使用2，4-D 0.5mg/L可獲得較高的愈傷率，這與張俊蓮、曲同寶等的結(jié)論一致［12～13］。

［1］國(guó)家藥典編委會(huì).中華人民共和國(guó)藥典（2010版一部）［M］.中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，124-125.

［2］孔令武，孫海峰.現(xiàn)代實(shí)用中藥栽培養(yǎng)殖技術(shù)［M］.人民衛(wèi)生出版社，2000：202-205.

［3］魚(yú)亞瓊，邱黛玉，藺海明，等.外源激素和種苗大小對(duì)當(dāng)歸成藥期生理變化的影響［J］.湖南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011（9）：41-44.

［4］張世瑜，鄭國(guó)昌.當(dāng)歸愈傷組織誘導(dǎo)和植株再生［J］.植物學(xué)報(bào)，1982，24（6）：512-518.

［5］張順培，賈敬芬，李浩日，等.當(dāng)歸原生質(zhì)體的分離培養(yǎng)和愈傷組織的形成［J］.科學(xué)通報(bào)，1985（18）：1 423-1 425.

［6］張世瑜，鄭國(guó)昌.當(dāng)歸胚性愈傷組織的誘導(dǎo)及胚狀體發(fā)生的組織細(xì)胞學(xué)研究田［J］.植物學(xué)報(bào)，1986，28（3）：241-244.

［7］張俊蓮，米受恩，欒文舉.當(dāng)歸愈傷組織產(chǎn)生的影響因素分析［J］.甘肅農(nóng)業(yè)科技，1995（11）：8-10.

［8］武延安，劉效瑞，曹占鳳，等.日光溫室冬季育苗抑制當(dāng)歸早期抽薹的效應(yīng)研究［J］.中國(guó)中藥雜志，2005，35（3）：283-284.

［9］劉穎，魏景芳，李冬杰.甘草愈傷組織培養(yǎng)中激素優(yōu)化組合的研究［J］.中草藥，2006，37（6）：931-933.

［10］顏昌敬.植物組織培養(yǎng)手冊(cè)［M］.上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1990：201-206.

［11］潘瑞熾.植物組織培養(yǎng)［J］.廣州：廣東高等教育出版社，2001.

［12］張俊蓮.當(dāng)歸愈傷組織的再分化及植株再生［J］.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1995，12（3）：293-297.

［13］曲同寶，王丕武，關(guān)淑艷，等.羊草組織培養(yǎng)及再生系統(tǒng)的建立［J］.草業(yè)學(xué)報(bào)，2004，13（5）：91-94.

（本文責(zé)編：陳珩）

Study on the Effect of Medium on Induction and Differentiation of Callus of Angelica sinensis

WANG Hong-xia1，3，WANG Guo-xiang1，2，3，CAI Zi-ping1，3
（1. Institute of Chinese Herbal Medicines，Gansu Academy of Agricultural Sciences，Lanzhou Gansu 730070，China；2. College of Agronomy，Gansu Agricultuarl Univercity，Lanzhou Gansu 730070，China；3. Gansu Engineering Laboratory for Genetic Improvement and Quality Control of Chinese Herbal Medicine，Lanzhou Gansu 730070，China）

The seeds of Angelica sinensis are used to study the influence of different hormone combinations and media on callus induction and plant regeneration.The result shows that the optimal madium for callus induction is H+0.5 mg/L 2，4-D，and on it，the callus forming rate could reach to 97.92%；the optimal medium for induction of adventitious buds is 1/2 MS+0.5 mg/L 6-BA+ 1.0 mg/L NAA+0.5 mg/L ZT，and the highest induction rate is 90.3%；1/2 MS+0.5 mg/L IAA is the best for rooting，and the rooting rate could reach to 35.5%.

Angelica sinensis；Tissue culture；Regeneration system；Medium

S567.23；Q813.1

A

1001-1463（2015）01-0031-03

10.3969/j.issn.1001-1463.2015.01.012

2014-10-30

甘肅省農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新專項(xiàng)（2011GAAS06-8、2012GAAS05-1、2013GAAS03-2、2013GAAS03-2）；甘肅省農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究與應(yīng)用開(kāi)發(fā)項(xiàng)目（GNSW-2011-06）

王宏霞（1980—），女，甘肅秦安人，助理研究員，從事甘肅省道地中藥材規(guī)范化栽培及良種選育工作。聯(lián)系電話：（0）13619327620；（0931）7613319。E-mail：313535864@qq.com