季愛兵，嚴亮，彭文書，劉聰，龔婉瑩，王橋美

（普洱茶研究院，云南普洱 665000）

瘦素（Leptin）受體基因敲除小鼠繁育及子代小鼠基因型鑒定

季愛兵，嚴亮，彭文書，劉聰，龔婉瑩，王橋美

（普洱茶研究院，云南普洱 665000）

將瘦素（Leptin，LP）受體基因雜合型小鼠按4種方式進行配對，從子鼠鼠尾中提取基因組DNA，用PCR方法擴增LP受體基因片段，瓊脂糖凝膠電泳后觀察。結果表明，LP+/+、LP+/-、LP-/-各表型小鼠互交繁殖結果基本符合孟德爾遺傳規(guī)律，且雌、雄性LP-/-小鼠（即DB/DB小鼠）無繁殖能力。雌、雄性LP+/-小鼠交配能高效地繁殖LP-/-小鼠；PCR方法能夠精確地鑒定LP-/-小鼠。

瘦素（Leptin，LP）；DB/DB小鼠；基因型

瘦素（Leptin，LP）是一種由脂肪組織分泌的肽類激素，人們之前普遍認為它進入血液循環(huán)后會參與糖、脂肪及能量代謝的調節(jié)，促使機體減少攝食，增加能量釋放，抑制脂肪細胞的合成，進而使體重減輕［1～2］。LP受體基因可以通過旁分泌與自分泌方式作用于脂肪、胰腺等多種組織，還可通過各種內分泌機制作用下丘腦特異性受體；不但可以調節(jié)機體的性生殖功能，而且是攝食反饋通路中的傳入飽食信號，可直接作用于腦的攝食和飽食中樞，抑制食物攝取，減少能量攝入，增加能量消耗，調控體內的脂肪組織消長［3］，以保證機體不發(fā)生過度肥胖或消瘦［4～5］。同時還可直接或間接調節(jié)體內的胰島素水平與活性，從而在機體攝食、能量代謝、神經(jīng)內分泌調控及性生殖等方面均有著非常重要的作用［6～8］。LP受體基因敲除小鼠會表現(xiàn)為飲食無節(jié)制，長期暴飲暴食后導致肥胖并引發(fā)糖尿病，這種模型與Ⅱ型糖尿病癥狀吻合，且該小鼠終身高血糖，所以DB/DB（LP-/-）小鼠是用來研究糖尿病和肥胖癥等疾病的理想動物模型。我們從美國杰克遜實驗室（Jackson Laboratory）引入LP受體基因雜合型小鼠，在SPF級（無特定病原體動物）動物房中飼養(yǎng)、繁殖，鑒定出一批DB/DB純合子小鼠，為糖尿病和肥胖癥的研究提供了理想的動物模型。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗動物LP受體基因敲除雜合子（LP+/-）小鼠從美國Jackson Laboratory購買，雄鼠5只，雌鼠10只，品系為C57BL/KsJ。使該品系小鼠在特異性基因位點發(fā)生基因變異，從而得到基因背景為LP受體基因敲除雜合子（LP+/-）。

1.1.2 主要試劑KOD FX酶購自東洋紡生物科技有限公司；DNA marker DL 2000購自大連寶生物工程有限公司；PCR引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成；其他試劑NaOH、Tris、HCl均為分析純。

1.1.3 儀器與設備PCR儀（英國基因公司），凝膠成像儀（英國基因公司），電流儀（北京六一儀器廠），離心機（美國貝克曼庫爾特有限公司），微量移液器［大龍興創(chuàng)實驗儀器（北京）有限公司］，獨立通氣籠（IVC，蘇杭科技器材有限公司），超凈工作臺（蘇州凈化設備有限公司）。

1.2 小鼠的繁殖方式

1.2.1 配對情況將小鼠按下列4種方式2∶1配對：LP+/-雌性與LP+/-雄性，LP-/-雌性與LP+/-雄性，LP+/-雌性與LP-/-雄性，LP+/+雌性與LP+/-雄性，每組配對4對，均交配2個月。

1.2.2 飼養(yǎng)條件在動物實驗室的IVC中飼養(yǎng)，在超凈工作臺中操作，喂以SPF級飼料，保證試驗在SPF級條件下進行。室溫恒定為24 ℃，空氣濕度保持在45%～65%，白天給予12 h光照。

1.3 子代小鼠基因型的鑒定

1.3.1 小鼠DNA模板的提取剪1～3 mm鼠尾于PCR管中，將其剪碎后加入180 μL 50 mmol/L NaOH溶液，充分振蕩，用PCR儀95 ℃孵育10 min，再加入20 μL pH 8.0的Tris-HCl溶液，充分振蕩后，12 000 r/min離心5 min。上清即粗DNA模板。

1.3.2 PCR反應①引物。引物共有3對，小鼠通用引物序列為CTRL-R：5′-CAGAAATCGAGGAAGAAATG-3′，CTRL-F：5′-CAGAAATCGAG GAAGAAATG-3′，正常PCR條件下，得到549 bp；LP-基因特異性引物，DB-SCRN-R：5′-CTAATATGGAAGCTTTCACA-3′，DB-SCRN-F：5′-GTTTACTTTTGATGGAGGT-3′，在同樣條件下能得到394 bp；LP+基因特異性引物，序列為DB-SCRN-R：5 ′-CTAATATGGAAGCTTTCACA-3 ′，DB-SCRN-F-N：5′- GTTTACTTTTGATGGAGGG -3′，在同樣條件下能得到394 bp。②PCR體系。H2O 12 μL，2 mmol/L dNTP 10 μL，2×PCR buffer 25 μL，引物1 μL，DNA模板1 μL，KOD-FX酶1 μL。③PCR反應條件。預變性：94 ℃5 min；變性：94 ℃30 s；退火：60 ℃60 s；延伸：72 ℃50 s，40個循環(huán)；最后延伸：72 ℃10 min，4 ℃保存。

1.3.3 1%瓊脂糖凝膠電泳0.35 g瓊脂糖，1× TBE 35 mL，GoldviewⅠ2 μL，用5 μL產物與1 μL 5×loading buffer混合上樣，電泳電壓110 V，時間30 min。

2 結果與分析

8對親本均為雜合體的小鼠交配后，2個月得到45只小鼠。通過PCR基因鑒定，其中有9只DB/DB小鼠（LP-/-基因純合子），占總數(shù)的20%；50只為LP+/-基因雜合小鼠，占總數(shù)的56.7%；野生型（WT）C57小鼠有22只，占總數(shù)的23.3%。而親本中有任何一方為LP-/-基因純合子的小鼠組均表現(xiàn)出不育，這與DB/DB小鼠是不育的報道相一致［1］。8對親本中有野生型（WT）C57小鼠組中得到了60只小鼠，其中雜合體小鼠為33只，占總數(shù)的55%；野生型（WT）C57小鼠為27只，占總數(shù)的45%。PCR電泳結果見圖1。

圖1 PCR方法進行小鼠基因型鑒定的結果

由CTRL-R、CTRL-F和DB-SCRN-R、DB-SCRN-F 2對引物只擴增到549 bp條帶的基因型為野生型（WT）C57小鼠，因其引物未擴增到LP-基因；而由CTRL-R、CTRL-F和DB-SCRN-R、DB-SCRN-F-N 2對引物只擴增到549 bp條帶的基因型為LP-/-基因純合子（DB/DB）小鼠，因其引物未擴增到LP+基因。而當由上述2對引物分別2次擴增都得到549 bp條帶和394 bp條帶時，該小鼠基因型為LP+/-基因雜合小鼠。

3 討論

基因敲除技術是借助分子生物學、細胞生物學和動物胚胎學的方法，將小鼠體內的某種基因的功能缺失，用以揭示基因功能最直接的手段之一，因此成為現(xiàn)代生物技術的重要研究方法和內容［9～10］。為了更好地進行LP受體基因的功能和糖尿病藥物的研究，我們引進了LP受體基因敲除小鼠。由于使用LP+/-基因雜合小鼠，其子代中常出現(xiàn)LP+/-、LP+/+、LP-/-3種基因型，該研究是將這3種基因型小鼠分開，從結果看，大致還是符合孟德爾遺傳定律，親代中有LP-/-基因純合小鼠均不能受孕，而用野生型小鼠參與繁殖則得不到LP-/-基因純合（DB/DB）小鼠。因此只能通過LP+/-基因雜合小鼠進行交配，由于LP+/-和LP+/+在表現(xiàn)型上是一致的，而且小鼠的生長周期較短，如果不及時將子代小鼠的基因型區(qū)分開來，將造成資源的極大浪費，而且還不容易得到相應能用于試驗的小鼠。我們目前通過合理安排動物生產，能得到相應的DB/DB小鼠，以滿足實驗室的試驗需求。

要想得到用來做試驗的大量相近出生日期的DB/DB小鼠，只有通過擴大繁殖來實現(xiàn)。試驗結果也表明，LP+/-基因雜合小鼠交配繁殖得到的小鼠數(shù)量不多，有時1只雌鼠1次分娩才產下4～6只小鼠，而野生型小鼠交配時，1只雌鼠1次分娩能得到6只以上小鼠，對此還需要深入研究。帶有LP-基因對小鼠生育是否有影響尚不清楚，還需要進一步的研究?？傊?，掌握對小鼠基因型的鑒定能合理地利用有限的資源，來繁殖我們所需要的試驗小鼠。

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（本文責編：鄭丹丹）

Breeding of Leptin Receptor Gene Knockout Mice and Genotype Identification of Their Filial Generation

JI Ai-bing，YAN Liang，PENG Wen-shu，LIU Cong，GONG Wan-ying，WANG Qiao-mei
（Puer Institute of Pu-erh Tea，Pu'er Yunnan 665000，China）

The leptin receptor gene heterozygous mice were matedin four ways.Genomic DNA was isolated from tails and analyzed by PCR.The result showed that the ratio of the offspring genotypes fit the Mendel’s laws.The male and female LP-/-mice were infertile.It was efficient to breed leptin receptor gene knockout homozygote mice by inbreeding of the heterozygotes.PCR methods could be used to identify the genotype of the LP-/-mice precisely.

Leptin；DB/DB mouse；Genotype

Q953，R392

A

1001-1463（2015）01-0009-03

10.3969/j.issn.1001-1463.2015.01.004

2014-12-09

季愛兵（1980—），男，安徽無為人，助理研究員，碩士，主要從事普洱茶功效研究工作。聯(lián)系電話：（0879）2886111。E-mail：42883876@qq.com。