寧愷佳,敬永生

(1.三門峽市食品藥品檢測中心,河南三門峽472000;2.河南大學藥學院,河南開封475004)

RP-HPLC法測定王氏保赤丸中大黃素的含量

寧愷佳1,敬永生2*

(1.三門峽市食品藥品檢測中心,河南三門峽472000;2.河南大學藥學院,河南開封475004)

目的建立反相高效液相色譜法測定王氏保赤丸中大黃素的含量的方法。方法采用RP-HPLC法測定,以Diamonsil-C18柱(250 mm×4.6 mm,5μm)為色譜柱,以甲醇:0.2%磷酸(85:15)為流動相,流速:1.0 m L/ min,檢測波長:280 nm。結果大黃素在0.202～1.212μg范圍內線性關系良好,其線性方程為A=396 6.9m-1.252 2,r=0.999 9,平均回收率為97.5%,RSD=0.811%(n=9)。結論法測定王氏保赤丸中大黃素的含量線性關系好、精密度好、準確度高、穩(wěn)定性好,可用于王氏保赤丸中大黃素的質量控制和含量測定。

王氏保赤丸;大黃素;RP-HPLC;含量測定

王氏保赤丸由大黃、黃連、南天星、川貝等八味藥按處方制成[1],主要用于治療小兒消化不良和成人胃腸功能失調所致乳滯疳積、上腹飽脹、嘔吐腹瀉、食欲不振、便秘、脾胃虛弱、發(fā)育不良等癥,臨床上得到極為廣泛的應用。我們采用反相高效液相色譜法對該方主藥中的大黃素進行了含量測定,通過線性關系、精密度、準確度、重復性、穩(wěn)定性、回收率等一系列方法學驗證,證明該方法準確、靈敏、簡便,能夠對其中大黃素進行較好的分離,并能對其含量準確測定,可作為王氏保赤丸中大黃素的質量控制和質量檢測。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

Agilent高效液相色譜儀;UV―2600型紫外檢測器(日本島津);色譜柱Diamonsil-C18柱(250 mm ×4.6 mm,5μm);一次性進樣器(大連依利特科學儀器公司);AG135型電子天平(瑞士,梅特勒―托利多);HS10260D型超聲波清洗器(天津市恒奧科技發(fā)展公司);0.22μm有機微孔濾膜等。

1.2 試劑

大黃素對照品(中國藥品生物制品檢定所,批號: 200110);王氏保赤丸市售品為中國南通精華制藥股份公司(批準文號:Z32020645);甲醇(高效液相色譜專用);磷酸(分析純);純凈水(樂百氏公司)。

2 方法與結果

2.1 實驗溶液的制備

2.1.1 對照品溶液的制備 用電子天平精密稱取大黃素對照品10.10 mg,置于100 L容量瓶中,用流動相溶解并定容,搖勻即得101.0 mg/L的對照品溶液。

2.1.2 供試品溶液的制備 取王氏保赤丸2支,研細,精密稱重,置10 m L容量瓶中,加流動相適量,超聲提取60 min,冷卻至室溫,取上清液至10 m L容量瓶中,用流動相稀釋至刻度,靜置,用0.22μm有機系濾膜過濾,在超聲儀器中超聲30 min,即得供試品溶液。

2.2 實驗條件的選擇[2]

色譜條件:Diamonsil-C18柱(250 mm×4.6 mm, 5μm),柱號:E2019601(購自大連依利特公司),流動相:甲醇-0.2%磷酸(85∶15),流速:1.0 m L/min,檢測波長:280 nm,柱溫:室溫,進樣量:20μL。在該色譜條件下,得到大黃素對照品溶液的HPLC圖譜,見圖1。供試品溶液的HPLC圖譜,見圖2。

圖1 大黃素對照品溶液HPLC圖譜

2.3 方法學考察[3]

2.3.1 線性關系 用一次性進樣器精密吸取2.1.1項下的大黃素對照品溶液(101.0 mg/L),并通過0.22μm有機微孔濾膜過濾于已用大黃素對照品溶液潤洗過的樣品瓶中。自動進樣器依次進樣2.00、4.00、6.00、8.00、10.00、12.00μL(0.202～1.212μg),注入高效液相色譜儀,按2.2項下色譜條件進行測定,各進樣量重復進樣三次,分別記錄色譜圖和峰面積,取其三次峰面積平均值,按外標法以峰面積A對質量m進行線性回歸,得回歸方程為:A= 396 6.9m―1.252 2(r=0.999 9)。結果表明,大黃素在0.202～1.212μg范圍內線性關系良好。

圖2 大黃素供試品溶液HPLC圖譜

2.3.2 精密度試驗 用一次性進樣器吸取線性關系項下的大黃素對照品溶液(101.0 mg/L),用0.22μm有機微孔濾膜過濾于樣品瓶中。自動進樣器進樣,每次進樣10μL,重復進樣6次,分別記錄其峰面積,測得大黃素峰面積的精密度RSD為0.20%,結果表明,該方法精密度良好。

2.3.3 重復性試驗 取同一批王氏保赤丸(批號020645)樣品,按2.3.6含量測定項下方法配制的供試品溶液6份,用0.22μm有機微孔濾膜過濾于已用供試品溶液潤洗過的樣品瓶中。取每份溶液20μL進樣,記錄色譜圖和峰面積,測得大黃素峰面積的精密度RSD為1.12%,結果表明,該方法重復性良好。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗 用一次性進樣器吸取2.3.6含量測定項下王氏保赤丸供試品溶液,并用0.22μm有機微孔濾膜過濾于樣品瓶中,分別于0、2、4、6、8、10、12 h進樣,每次進樣量為20μL,連續(xù)考察12 h,記錄色譜圖和峰面積,計算RSD為0.15%。結果表明,王氏保赤丸供試品溶液在12 h內穩(wěn)定。

2.3.5 回收率試驗 取2.3.6含量測定項下已知含量的6份王氏保赤丸供試品溶液,每份溶液中精密吸取3 m L的供試品溶液,分別置于10 m L容量瓶中,在相同濃度下的供試品溶液中,按對照品的80%、100%、120%的比例加入2.1.1項下制備的對照品溶液。在混有供試品和對照品的10 m L容量瓶中加入適量流動相,超聲30 min,冷卻至室溫,用流動相稀釋至刻度,靜置,用一次性進樣器吸取并用0.22μm微孔濾膜濾過,置于進樣瓶中即得。按2.3.6項下所述“樣品的含量測定”的方法進行測定,每次進樣20μL,記錄色譜圖和峰面積,計算回收率,測得平均加樣回收率為97.5%,RSD=0.81%(n=6),結果顯示,用該法測定王氏保赤丸中大黃素含量準確度高。

2.3.6 樣品的含量測定 按2.1項下供試品溶液的配制方法制備6份大黃素供試品溶液,用一次性進樣器吸取供試品溶液,并用0.22μm有機微孔濾膜過濾于樣品瓶中,超聲30 min,按2.2項下色譜條件,每份進樣3次,每次進樣20μL,記錄色譜圖和峰面積,由峰面積根據回歸方程計算大黃素的含量0.093 9 (%)。結果見表1。

表1 含量測定試驗

3 討論

3.1 流動相的選擇

查閱文獻[4-5]得知,用RP-HPLC方法單獨測定大黃素的含量時,所采用的色譜條件中流動相大多數為甲醇―磷酸系統(tǒng)和乙腈―磷酸系統(tǒng)。其中甲醇―磷酸系統(tǒng)中磷酸溶液的濃度多為0.1%,實驗過程中,發(fā)現色譜峰拖尾比較嚴重。若流動相改用甲醇-0.2%磷酸,拖尾現象得到明顯改善,對稱因子達到0.99。通過多次實驗和調整,發(fā)現流動性配比在甲醇-0.2%磷酸(85∶15)時各峰的分離效果好、出峰時間理想,柱效得到提高。因此,選擇甲醇-0.2%磷酸(85∶15)為流動相。

3.2 測定波長的選擇

取2.1項下配制好的對照品溶液,用UV―2600型紫外檢測器(日本島津)檢測,在200～450 nm波長范圍內掃描,結果在221、280 nm波長處有最大吸收,故采用280 nm為測定波長。

3.3 提取方法的選擇

此次實驗采用超聲提取和索氏提取兩種方法。在索氏提取中,用流動相做提取劑,在索氏提取器中提取5 h,用高效液相色譜方法測定大黃素的含量,發(fā)現提取效果不好、費時費事,提取過程麻煩,該方法不理想。而超聲提取回收率和含量,均比索氏提取效果好,并且超聲提取簡便,節(jié)省、不浪費。因此,選用超聲提取法較為理想。

4 結論

本實驗采用反相高效液相色譜法測定王氏保赤丸中大黃素的含量,以甲醇-0.2%磷酸(85∶15)為流動相,流速為1.0 m L/min,檢測波長為280 nm,柱溫為室溫。線性關系考察得知,大黃素在0.202～1.212μg范圍內線性關系良好,其線性方程為A= 396 6.9m―1.252 2(r=0.999 9),平均回收率為97.5%,RSD=0.811%(n=9),且精密度好、準確度高、穩(wěn)定性及重復性均較好,可作為王氏保赤丸中大黃素含量測定的可靠方法。

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典[S].北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2010:22.

[2]寧愷佳.RP-HPLC法測定含感膠囊中對乙酸氨基酚的含量[J].河南大學學報(醫(yī)學版),2015,3(2):100―102.

[3]夏玉鳳,楊勤,王強.HPLC法測定王氏保赤丸中大黃素和鹽酸小檗堿的含量[J].中成藥,2004,26(3):198―201.

[4]周小江,劉塔斯.首烏藤中大黃素的含量測定[J].中華現代中西醫(yī)雜志,2005,3(1):30―34.

[5]梁偉.護肝寧片中大黃素含量測定的研究[J].中醫(yī)藥信息,2010,27(4):78―81.

[責任編輯 李麥產]

Determination of the Emodin in Wangshibaochi Pills by RP-HPLC

NING Kaijia1，JING Yongsheng2*
（1.SɑnmenxiɑFoodɑnd Drug Inspection Center，Sɑnmenxiɑ472000，Chinɑ；2.PhɑrmɑcoCogicɑl College of Henɑn University，Kɑifeng，Henɑn 475004，Chinɑ）

ObjectiveTo establish a method for the determination of the emodin in Wangshibaochi Pills by RPHPLC.MethodsDiamonsil-C18column（250 mm×4.6 mm，5μm），column number：E2019601.using methanol-0.2%Phosphoric acid（85：15）as mobile phase，the flow rate was 1.0 m L/min，and the detection wavelength was 280nm.ResultsThe concentration of the emodin was linearly related to its peak area in the rang of 0.202～1.212μg，the linear regression equation is A=396 6.9m-1.252 2，r=0.999 9.The average recovery was 97.5%，with RSD of 0.811%（n=9）.ConclusionThis method is linear、accurate、precise and stabile，It can be used for quality control and determination of content of Wangshibaochi pills.

wangshibaochi pills；emodin；RP-HPLC；content determination

R927.2

A

1672―7606(2015)04―0256―03

2015-08-23

寧愷佳(1982―),女,河南三門峽人,工程師,從事藥品及醫(yī)療器械志良監(jiān)測工作。

*通信作者:敬永生(1964―),男,河南駐馬店人,副教授,從事藥物分析化學教學與研究工作。