張文亮，饒雪梅，羅蘭芳

(海南省農(nóng)墾那大醫(yī)院兒科，海南儋州 571700)

·經(jīng)驗(yàn)交流·

匹多莫德對小兒支原體肺炎Foxp3的影響及臨床治療作用研究

張文亮，饒雪梅，羅蘭芳

(海南省農(nóng)墾那大醫(yī)院兒科，海南儋州 571700)

目的 觀察匹多莫德對肺炎支原體肺炎(MPP)患兒Foxp3基因表達(dá)的影響，并探討其相關(guān)的臨床意義。方法收集該院兒科2012年11月至2013年12月治療的MPP患兒78例為研究對象，分為常規(guī)治療組(對照組)和匹多莫德治療組(觀察組)，每組39例，另取該院體檢的健康兒童40例作為健康對照組。Foxp3基因表達(dá)使用熒光定量PCR檢測，調(diào)節(jié)性 T 細(xì)胞(Treg)使用流式細(xì)胞儀檢測。結(jié)果治療前觀察組和對照組Foxp3基因表達(dá)和Treg細(xì)胞比例差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但均顯著低于健康對照組(P<0.01)。治療后觀察組和對照組Foxp3基因表達(dá)和Treg細(xì)胞比例均出現(xiàn)顯著升高(P<0.05)，但治療后觀察組升高的幅度顯著高于對照組(P<0.05)。對照組的住院時(shí)間、抗菌藥物使用時(shí)間、6個(gè)月內(nèi)病情反復(fù)次數(shù)分別為(7.74±2.14 )d、(7.74±2.14 )d和(2.04±0.76)次，顯著高于觀察組的(4.32±1.58)d、(4.46±1.62 )d和(0.82±0.24)次(P<0.05)。觀察組和對照組的臨床治療有效率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論匹多莫德可以顯著升高Foxp3表達(dá)并提高Treg細(xì)胞比例，糾正患兒的免疫平衡紊亂，有助于MPP患兒的恢復(fù)并減少其復(fù)發(fā)，臨床使用安全。

肺炎支原體肺炎；Foxp3基因；調(diào)節(jié)性 T 細(xì)胞；匹多莫德

肺炎支原體(MP)是秋冬季常見的一種兒童下呼吸道感染病原體[1]，其引起的肺炎支原體肺炎(MPP)占兒童呼吸道感染性疾病的20%～30%[2]。MP感染不僅損害呼吸道，還可以引發(fā)肺外并發(fā)癥且并發(fā)多臟器功能損害，如肝臟、腎臟、心臟等重要臟器損害，因此積極有效的治療MPP始終是醫(yī)務(wù)工作者研究的熱點(diǎn)[3]。免疫功能紊亂在MPP病變中的作用正受到學(xué)者們的關(guān)注，以此為靶點(diǎn)的治療也逐漸在臨床上開展，并取得了一定的療效[4]。匹多莫德(pidotimod)是一種人工合成的免疫刺激劑[5]，本研究觀察了匹多莫德對MPP患兒Foxp3基因表達(dá)的影響，并探討了其相關(guān)的臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集本科2012年11月至2013年12月治療的MPP患兒78例，其中男38例，女40例，MPP診斷參照胡亞美等[6]主編的《諸福棠實(shí)用兒科學(xué)》(第7版)。排除標(biāo)準(zhǔn)：心、肝、腎等臟器嚴(yán)重病變，并發(fā)其他急、慢性感染性疾病，曾使用激素或者其他免疫調(diào)節(jié)劑者。78例MPP患兒分為常規(guī)治療組(對照組)和匹多莫德治療組(觀察組)，每組39例。對照組男19例，女20例，年齡3～9歲，平均(5.4±2.5)歲；觀察組男19例，女20例，年齡3～8歲，平均(5.2±2.1)歲，兩組患者在性別、年齡等臨床資料方面差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。另取本院體檢中心的健康兒童40例作為健康對照組，其中男20例，女20例，年齡4～10歲，平均(5.8±2.7)歲。健康對照組(n=40)和MPP患兒組(n=78)在性別、年齡臨床資料方面差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 治療方法 對照組給予退熱、止咳、化痰等常規(guī)治療。靜脈滴注阿奇霉素(利君制藥股份公司，國藥準(zhǔn)字H20000377)，10 mg·kg-1·d-1，5 d為1療程。治療1～3個(gè)療程。觀察組在對照組基礎(chǔ)上加用匹多莫德(浙江仙琚制藥股份有限公司，國藥準(zhǔn)字第H20030325)，前2周，400 mg/次，每日2次;后6周，400 mg/次，每日1次，共8周。比較兩組的住院時(shí)間、抗菌藥物使用時(shí)間和臨床療效，所有患兒隨訪6個(gè)月，記錄病變反復(fù)次數(shù)。

1.2.2 療效評價(jià) 參照馬紅秋等[5]的方法，痊愈：臨床癥狀完全消失；顯效：臨床癥狀明顯緩解；無效：臨床癥狀無明顯改善甚至惡化。有效率(%)=(痊愈+顯效)/總例數(shù)×100%。

1.2.3 Foxp3基因表達(dá)的熒光定量PCR檢測 取健康對照、MPP患兒治療前和治療后靜脈血1 mL，使用RNA提取和反轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國基因公司產(chǎn)品)，反轉(zhuǎn)錄出cDNA第一鏈。熒光定量檢測試劑盒(大連寶生物公司產(chǎn)品)檢測Foxp3基因的表達(dá)。Foxp3基因：上游引物5′-CGG TTA AGT ACT GTG GAA TTG-3′，下游引物5′-CCT TAA GTA CCA TGG TTG TGC-3′；反應(yīng)條件為94 ℃ 60 s；94 ℃ 30 s，61 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，30個(gè)循環(huán)?！鰿t值=目的基因Ct值-內(nèi)參基因Ct值，F(xiàn)oxp3基因的表達(dá)量采用2-△Ct評估。

1.2.4 調(diào)節(jié)性 T 細(xì)胞(Treg)的流式細(xì)胞儀檢測 取健康對照、MPP患兒治療前和治療后靜脈血5 mL，裂解紅細(xì)胞，PBS緩沖液洗滌2次，最后0.4 mL PBS緩沖液懸浮細(xì)胞，加入FITC-CD4和APC-CD25(購自美國Millipore公司)抗體各10 μL，避光染色30 min，美國B-D 公司FACS Calibur流式細(xì)胞儀檢測FITC-CD4和APC-CD25雙陽性的Treg細(xì)胞。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)，兩樣本均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn),以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 匹多莫德對MPP患兒Foxp3和Treg細(xì)胞的影響 治療前觀察組和對照組Foxp3基因表達(dá)和Treg細(xì)胞比例差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但均顯著低于健康對照組(P<0.01)。治療后兩組Foxp3基因表達(dá)和Treg細(xì)胞比例均出現(xiàn)顯著升高(P<0.05)，但治療后觀察組升高的幅度顯著高于對照組(P<0.05)。見圖1、表1。

圖1 Treg細(xì)胞的流式細(xì)胞儀檢測

2.2 匹多莫德對MPP患兒臨床指標(biāo)的影響 對照組的住院時(shí)間、抗菌藥物使用時(shí)間、6個(gè)月內(nèi)病情反復(fù)次數(shù)分別為(7.74±2.14)d、(7.74±2.14)d和(2.04±0.76)次，顯著高于觀察組的(4.32±1.58)d、(4.46±1.62)d和(0.82±0.24)次(P<0.05)。

2.3 觀察組和治療組臨床療效和不良反應(yīng)的分析 兩組患兒經(jīng)積極治療后均獲得痊愈，臨床治療有效率為100%，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。用藥期間觀察組未觀察到匹多莫德相關(guān)的不良反應(yīng)發(fā)生。

表1 3組Foxp3表達(dá)和Treg細(xì)胞比例的比較

3 討 論

MP感染而引起的MPP好發(fā)于兒童，該病原菌致病機(jī)制復(fù)雜[6-7]，除了病原菌毒素的直接侵害外，還與免疫功能紊亂有關(guān)，特別是 T 細(xì)胞亞群功能紊亂[8]。Treg是新發(fā)現(xiàn)的一種CD4+T 細(xì)胞亞群成員，對于機(jī)體免疫平衡的維持發(fā)揮重要的作用，如其主要效應(yīng)因子IL-10可以抑制致炎因子IL-6、TNF-α等的釋放[9]，F(xiàn)oxp3是調(diào)控CD4+T細(xì)胞向 Treg細(xì)胞分化的調(diào)控蛋白，是Treg 細(xì)胞發(fā)育的一個(gè)重要開關(guān)蛋白[10]，本研究的檢測顯示MPP患兒中Foxp3表達(dá)和Treg比例均顯著低于健康對照兒童，說明MPP患兒處于一種Treg 細(xì)胞分化抑制狀態(tài)，失去了對一些治病炎癥介質(zhì)的抑制作用。袁浩等[11]的研究也獲得了相似的結(jié)果。

MPP發(fā)病機(jī)制與免疫功能有關(guān)已得到廣泛認(rèn)同，目前臨床上對MPP的治療傾向于除了抗支原體治療外，還應(yīng)積極促進(jìn)患兒免疫功能及免疫平衡的恢復(fù)[12]。匹多莫德化學(xué)結(jié)構(gòu)為3-L-焦谷氨酸四氫噻唑啉羧酸，作為機(jī)體免疫增強(qiáng)劑，其可以調(diào)節(jié)CD4/CD8細(xì)胞的比例失調(diào)，改善機(jī)體的免疫狀態(tài)。本研究顯示使用匹多莫德后MPP患兒Foxp3表達(dá)和Treg比例可以得到顯著升高，觀察組對Foxp3表達(dá)和Treg比例的改善作用顯著優(yōu)于對照組。說明加用匹多莫德對MPP患兒T 細(xì)胞亞群功能紊亂的糾正起到了積極的作用。臨床療效分析顯示兩組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但觀察組的住院時(shí)間、抗菌藥物使用時(shí)間、病情反復(fù)次數(shù)均顯著短于對照組，說明使用匹多莫德后有利于MPP患兒的恢復(fù)并且可以有效阻止病情的反復(fù)發(fā)作。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床研究都已經(jīng)證實(shí)匹多莫德的急性及慢性毒性作用都非常低[4]，本研究也沒有觀察到匹多莫德相關(guān)的不良反應(yīng)，說明匹多莫德是一種安全的治療方法。

綜上所述，本研究顯示MPP患兒中Foxp3表達(dá)和Treg細(xì)胞比例均顯著低于健康兒童，匹多莫德可以顯著升高Foxp3表達(dá)并提高Treg細(xì)胞比例，糾正患兒的免疫平衡紊亂，有助于MPP患兒的恢復(fù)并減少其復(fù)發(fā)，臨床使用安全，為MPP 提供了一種新的治療思路。

[1]Meyer Sauteur PM,Van Rossum AM,Vink C.Mycoplasma pneumoniae in children:carriage,pathogenesis,and antibiotic resistance[J].Curr Opin Infect Dis,2014,27(3):220-227.

[2]Zhao H,Li S,Cao L,et al.Surveillance of mycoplasma pneumoniae infection among children in Beijing from 2007 to 2012[J].Chin Med J(Engl),2014,127(7):1244-1248.

[3]賓庚偉．小兒肺炎支原體肺炎研究進(jìn)展[J]．內(nèi)科，2014，9(1)：82-84,90．

[4]王冠，李開為．匹多莫德對支原體肺炎患兒免疫及炎性因子的影響[J]．臨床肺科雜志，2014，19(5)：823-825．

[5]馬紅秋，李黎，徐雍，等．肺炎支原體肺炎患兒免疫功能變化及匹多莫德對其治療作用[J]．實(shí)用兒科臨床雜志，2010，25(22)：1703-1704．

[6]胡亞美，江載芳．諸福棠實(shí)用兒科學(xué)[M]．7版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2002：1204-1205．

[7]Jiang W,Qian L,Liang H,et al.Relationships between the varied ciliated respiratory epithelium abnormalities and severity of Mycoplasma pneumoniae pneumonia[J].Scand J Infect Dis,2014,46(7):486-492.

[8]Neill DR,Fernandes VE,Wisby L,et al.T regulatory cells control susceptibility to invasive pneumococcal pneumonia in mice[J].PLoS Pathog,2012,8(4):e1002660.

[9]Ji NF,Xie YC,Zhang MS,et al.Ligustrazine corrects Th1/Th2 and Treg/Th17 imbalance in a mouse asthma model[J].Int Immunopharmacol,2014,21(1):76-81.

[10]Arvey A,Van Der Veeken J,Samstein RM,et al.Inflammation-induced repression of chromatin bound by the transcription factor Foxp3 in regulatory T cells[J].Nat Immunol,2014,15(6):580-587.

[11]袁浩，周毅峰，曹友德，等．CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞及其相關(guān)蛋白Foxp3在小兒支原體肺炎患者中的表達(dá)[J]．廣東醫(yī)學(xué)，2013，34(24)：3786-3789．

[12]Kurata S,Osaki T,Yonezawa H,et al.Role of IL-17A and IL-10 in the antigen induced inflammation model by Mycoplasma pneumoniae [J].BMC Microbiol,2014,14(1):156.

10.3969/j.issn.1671-8348.2015.25.040

張文亮(1978-)，本科，主治醫(yī)師，主要從事小兒肺炎呼吸系統(tǒng)疾病研究。

R725.6

B

1671-8348(2015)25-3572-03

2015-03-08

2015-05-28)