張 敏，劉曉君,羅 成,陳開杰，孔令希，何海霞，周遠(yuǎn)大

(1.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院藥學(xué)部 400016;2.重慶市第九人民醫(yī)院藥劑科 400700;3.重慶市腫瘤醫(yī)院藥劑科 400030)

論著·基礎(chǔ)研究

痰熱清注射液對(duì)左氧氟沙星在小鼠肺組織分布的影響

張 敏1，劉曉君2#,羅 成1,陳開杰3△，孔令希1，何海霞1，周遠(yuǎn)大1

(1.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院藥學(xué)部 400016;2.重慶市第九人民醫(yī)院藥劑科 400700;3.重慶市腫瘤醫(yī)院藥劑科 400030)

目的 探討痰熱清注射液對(duì)左氧氟沙星在小鼠肺組織中分布的影響。方法將144只小鼠分為痰熱清注射液聯(lián)合左氧氟沙星實(shí)驗(yàn)組和左氧氟沙星對(duì)照組，兩組動(dòng)物分別于0.05、0.083、0.17、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 h和12.0 h采集肺組織，制為勻漿，高效液相色譜法檢測(cè)肺組織中左氧氟沙星藥物濃度，3P97程序計(jì)算藥動(dòng)學(xué)參數(shù)。結(jié)果實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組肺組織中藥-時(shí)曲線呈二室模型，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組肺組織中V/Ft1/2β、CL，AUCo-t分別為(1.37±0.30vs. 1.90±0.24)L、(5.21±1.96vs. 4.82±1.55)h、(0.81±0.12vs. 1.13±0.14)L/h和(117.69±22.89vs. 84.91±11.33)mg·h-1·kg-1，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。表明痰熱清注射液能提高左氧氟沙星在小鼠肺組織中的分布量和滯留時(shí)間。結(jié)論痰熱清注射液聯(lián)合左氧氟沙星可提高左氧氟沙星在小鼠肺組織中的藥物濃度并延長(zhǎng)滯留時(shí)間長(zhǎng)。

痰熱清注射液;左氧氟沙星;高效液相色譜;分布

呼吸道感染是常見病、多發(fā)病，嚴(yán)重危害人們的健康。近年來由于社會(huì)人口的老齡化，病原體變遷，抗菌藥物的耐藥率上升，臨床治愈有所下降，除應(yīng)用抗菌藥物外，還常常采用聯(lián)合使用相關(guān)中藥治療。有文獻(xiàn)報(bào)道，痰熱清注射液聯(lián)合左氧氟沙星注射液治療上、下呼吸道感染臨床效果顯著，能明顯改善臨床癥狀，治愈率顯著提高[1-4]。研究表明，痰熱清注射液對(duì)肺炎鏈球菌、嗜血流感桿菌、乙型溶血鏈球菌、金黃色葡萄球菌有抑制作用，并能降低內(nèi)毒素升高體溫的作用[1-5]。此外，有研究認(rèn)為痰熱清注射液可抑制炎癥滲出和肺間質(zhì)水腫，抑制或減輕炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，阻止急性肺泡細(xì)胞炎癥損傷，改善低氧狀態(tài)，同時(shí)可以降低內(nèi)毒素炎性細(xì)胞因子的表達(dá)水平，以達(dá)到抗菌消炎的目的[6-7]。以上研究均表明，痰熱清注射液及左氧氟沙星在肺部病變的臨床療效和產(chǎn)生作用的機(jī)制，為此，作者探討了痰熱清注射液對(duì)左氧氟沙星在小鼠肺組織內(nèi)分布的影響，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康合格昆明種小鼠144只，SPF級(jí)，體質(zhì)量18～21 g，雌雄各半，由重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物使用合格證號(hào)：SCXK(渝)2012-0002。

1.2 儀器與試劑 日本島津LC-20梯度高效液相色譜儀系統(tǒng)(泵系統(tǒng)，可調(diào)波長(zhǎng)紫外檢測(cè)器、自動(dòng)進(jìn)樣系統(tǒng)和Labsolution工作站)。痰熱清注射液，規(guī)格：20 mL/瓶，由上海凱寶藥業(yè)股份有限公司提供，批號(hào)1205209。乳酸左氧氟沙星注射液由浙江醫(yī)藥股份有限公司新昌制藥廠生產(chǎn)，批號(hào)140346。左氧氟沙星標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品(L-fox)，純度97.3%，批號(hào)130455-200604，中國(guó)藥品生物制品檢定出品。環(huán)丙沙星(CF，內(nèi)標(biāo)即IS)純度98.16%，批號(hào)060402，重慶藥友制藥有限公司提供。甲醇、二氯甲烷為色譜純；其他試劑為分析純；水為雙蒸水。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件 色譜柱為Amethyst C18-Ⅱ 5 μm粒徑，100×4.6 mm ID,預(yù)柱；固定進(jìn)樣環(huán)100 μL；流動(dòng)相：甲醇-0.008 mol/L 磷酸鹽緩沖液-0.5 mol/L 四丁基溴化銨為25∶75∶4，流速0.4 mL/min；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)290 nm；柱溫40 ℃。

1.3.2 血液和肺組織的收集 144只小鼠分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，每組72只，按實(shí)驗(yàn)時(shí)間分為0.05、0.083、0.17、0.5、1、2、4、8 h和12 h共9個(gè)小組，每組8只小鼠。實(shí)驗(yàn)前，實(shí)驗(yàn)組小鼠靜脈注射痰熱清注射液0.8 mL/kg(痰熱清注射液用5%葡萄糖注射液按1∶3稀釋后緩慢注射)，而對(duì)照組小鼠靜脈注射等容量生理鹽水,給藥后1 h，各組動(dòng)物均靜脈注射左氧氟沙星注射液73.3 mg/kg。給藥后分別于0.05、0.083、0.17、0.5、1、2、4、8 h和12 h處死相應(yīng)組小鼠，收集肺組織，并將肺組織稱重后制為勻漿，均置于-20 ℃低溫冰箱待測(cè)。

1.3.3 樣品處理 取肺組織勻漿0.5 mL+IS 10 μL(CF：33.616 μg/mL )+3 mL CH2Cl2，旋搖 1 min，3 000 r/min 離心 2 min，取 CH2Cl2存于5 mL 離心管中，置于40 ℃水浴中，氮?dú)獯蹈伞Ｓ?.1 mL流動(dòng)相復(fù)溶，自動(dòng)進(jìn)樣40 μL。

2 結(jié) 果

2.1 色譜行為 在本實(shí)驗(yàn)所采用的色譜條件下，血漿中左氧氟沙星的tR為5 min左右，CF的tR 為7 min左右，二者峰形良好，且不受血漿內(nèi)源性物質(zhì)的干擾。

2.2 方法學(xué)研究

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線、線性關(guān)系與最低定量濃度 在空白肺組織勻漿中分別添加左氧氟沙星使血藥濃度相當(dāng)于0.076 5、0.153、0.306、0.612、1.224、2.448、4.896和9.792 μg/mL，按“1.3.3”方法操作，將所得左氧氟沙星峰面積/CF峰面積比(Y)與L-fox濃度(X)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程Y=3.968 0X-0.097 58；在9.792～0.076 5 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，r=0.999 6(n=5)；最低定量濃度為 0.076 5 μg/mL(RSD=17.44%，n=5)。

2.2.2 精密度和重復(fù)性 取高、中、低 3 種質(zhì)控樣本(9.792、1.224、0.153 μg/mL)，每個(gè)濃度5份，考察批內(nèi)和批間變異。批內(nèi)誤差(每個(gè)濃度同日內(nèi)測(cè)定5次)、日內(nèi)變異性結(jié)果及批間誤差(每個(gè)濃度2周內(nèi)測(cè)定5次)日間變異性結(jié)果，見表1。

表1 精密度及重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

2.2.3 回收率 取高、中、低 3 種濃度的肺組織勻漿質(zhì)控樣本(9.792、1.224、0.153 μg/mL )，每個(gè)濃度5份，按規(guī)定方法評(píng)價(jià)本法的回收率。結(jié)果，高、中、低濃度的回收率分別為(99.16±3.24)%、(100.57±5.12)%和(104.02±5.88)%。

2.2.4 穩(wěn)定性考察 取高、中、低 3 種肺組織勻漿質(zhì)控樣本(9.792、1.224、0.153 μg/mL)，每個(gè)濃度3份，按“1.3.2”項(xiàng)方法操作并測(cè)定。室溫25 ℃左右，放置24 h測(cè)定5次；冷藏(4 ℃冰箱)，10 d內(nèi)測(cè)定5次；低溫(-20 ℃冰箱)，反復(fù)冷凍、融化,3周內(nèi)測(cè)定 5次。結(jié)果表明，在室溫、冷藏、反復(fù)凍融條件下，血漿中左氧氟沙星的穩(wěn)定性均良好，見表2。

表2 血漿中左氧氟沙星的穩(wěn)定性試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果(n=5)

2.3 藥-時(shí)曲線 實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組左氧氟沙星的平均血藥濃度-時(shí)間曲線見圖1。藥時(shí)數(shù)據(jù)經(jīng)3p97軟件自動(dòng)擬合，二組均數(shù)均符合二室模型。

圖1 2組平均肺組織藥物濃度-時(shí)間曲線(n=8)

2.4 藥動(dòng)學(xué)參數(shù) 2組受試小鼠肺組織藥物濃度-時(shí)間數(shù)據(jù)采用計(jì)算機(jī) 3p97 程序自動(dòng)擬合，結(jié)果表明左氧氟沙星的藥-時(shí)數(shù)據(jù)均符合二室藥動(dòng)學(xué)模型。有關(guān)藥動(dòng)學(xué)參數(shù)，見表3。

表3 2組主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)比較

續(xù)表3 2組主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)比較

*:P<0.05,**P<0.01,與對(duì)照組比較。

3 討 論

有關(guān)左氧氟沙星的檢測(cè)方法已有很多報(bào)道[8-10]，如HPLC-UV法、HPLC-熒光法及LC-MS/MS法等；因經(jīng)濟(jì)實(shí)惠實(shí)際采用最多的是HPLC-UV法。本文所建立的HPLC-UV法是作者長(zhǎng)期多次用于人血漿、尿液，動(dòng)物血漿、尿液、膽汁及組織中左氧氟沙星濃度測(cè)定的方法；本方法成熟、準(zhǔn)確、可靠，方法學(xué)研究指標(biāo)均能達(dá)到和滿足試驗(yàn)要求。

藥物吸收進(jìn)入血液循環(huán)后，向各器官組織轉(zhuǎn)運(yùn)分布，且在各器官組織中的濃度與其在該組織作用強(qiáng)度、速率、持續(xù)時(shí)間有密切的關(guān)系。左氧氟沙星是濃度依賴性抗菌藥物，其作用與其所在組織中的濃度與持續(xù)時(shí)間有密切關(guān)系，換言之，其臨床效果與組織濃度有關(guān)。臨床文獻(xiàn)表明，痰熱清注射液與左氧氟沙星聯(lián)合用于治療上、下呼吸道感染、老年肺炎等均取得明顯療效[1-4]，提示二者聯(lián)合用藥有協(xié)同作用。除文獻(xiàn)報(bào)道抗菌作用有相加外，作者認(rèn)為與痰熱清注射液提高左氧氟沙星在肺組織中濃度有密切關(guān)系。本研究選用小鼠行痰熱清注射液與左氧氟沙星聯(lián)用，結(jié)果實(shí)驗(yàn)組小鼠肺組織中左氧氟沙星濃度遠(yuǎn)高于單用左氧氟沙星在對(duì)照組小鼠肺組織中的濃度，AUC 0→t分別為(117.69±22.89)μg·h-1·mL-1與(84.91±11.33)μg·h-1·mL-1，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。目前根據(jù)抗菌藥物對(duì)細(xì)菌殺菌活性可分為時(shí)間依賴型，屬于此類抗菌藥物為β內(nèi)酰胺類、大環(huán)內(nèi)酯類；而濃度依賴型即藥物的殺菌活力在很大范圍內(nèi)隨藥物濃度的增高增加，屬于此類者有氨基糖甙類、氟喹諾酮類和甲硝唑等。本研究中，左氧氟沙星注射液與痰熱清注射液聯(lián)合使用致小鼠肺組織中左氧氟沙星無論AUC 0→t還是AUC 0→∞，均顯著高于對(duì)照組，提示其抗菌作用增強(qiáng)是極為相關(guān)的。此外，實(shí)驗(yàn)組小鼠肺組織中左氧氟沙星消除速度t 1/2β和Cl/F(s)均顯著低于對(duì)照組小鼠肺組織中左氧氟沙星的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)，進(jìn)一步表明，痰熱清注射液除提高左氧氟沙星在小鼠肺組織中濃度外，還可致代謝和清除減慢，延緩左氧氟沙星的抗菌時(shí)間，為提高療效提高一定的條件。

至于痰熱清注射液為何可使左氧氟沙星在肺組織中濃度提高，可能與組方有關(guān)。其組方為黃芩、熊膽粉、上羊角、金銀花和連翹五味中藥組成[11]，文獻(xiàn)報(bào)道，黃芩可通過阻斷平滑肌細(xì)胞膜上電壓依賴型鈣通道和受體操縱型鈣通道而抑制鈣離子內(nèi)流，松弛血管平滑肌，有益于左氧氟沙星分別到血管密集、血流豐富的肺組織中[12]。此外，黃芩尚可減少左氧氟沙星的排泄[13]。

有文獻(xiàn)報(bào)道，肺部常感染菌株為耐甲氧西林金葡菌、肺炎球菌、銅綠假單胞菌等，經(jīng)臨床分離對(duì)左氧氟沙星的敏感性MIC50分別為0.31、0.62、1.25 mg/L，而MIC90分別為0.62、1.25和2.50 mg/L[13]，本研究實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組中左氧氟沙星濃度如圖1所示，分別為15～10 mg/kg，持續(xù)5 h以上，完全符合濃度依賴型抗菌藥物特點(diǎn)。高濃度且持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，且實(shí)驗(yàn)組明顯高于對(duì)照組，故二者聯(lián)用療效明顯增強(qiáng)。

綜上所述，本研究從藥動(dòng)學(xué)方面進(jìn)一步闡明痰熱清注射液對(duì)左氧氟沙星在小鼠組織中分布的影響，增強(qiáng)了臨床療效，為臨床二者聯(lián)用找到依據(jù)，有利于臨床醫(yī)生的推廣使用。

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Effect of Tanreqing Injection on distribution of levofloxacin in lung of mice

ZhangMin1，LiuXiaojun2#，LuoCheng1，ChenKaijie3△，KongLingxi1，HeHaixia1,ZhouYuanda1

(1.DeparementofClinicalPharmacy,FirstAffiliatedHospital,ChongqingMedicalUniversity,Chongqing400016,China;2.DepartmentofPharmaceuticalPreparation,NinthPeople′sHospitalofChongqingCity,Chongqing400700,China;3.DepartmentofPharmacy，ChongqingMunicipalTumorHospital,Chongqing400030,China)

Objective To investigate the effects of Tanreging Injection on the distribution of levofloxacin in the lung tissue of mice.Methods 144 mice were randomily divided into the levofloxacin experimental group and the levofloxacin control group,72 cases in each group.The experimental group was injected by Tanreqing Injection 0.8 mg/kg and the control group was injected by the same volume of normal saline.The mice in the two groups were sacrificed for collecting the lung tissues at the time points of 0.05,0.08,0.17,0.5,1.0,2.0,4.0,8.0,12 h and preparing the homogenate.The levofloxacin concentration in the lung tissue was determined by HPLC and the pharmacokinetic parameters were calculated by the 3P97 program.Results The concentration curves based on drug-time in the experimental group and the control group both fitted the two-compartments model.The main pharmacokinetic parameters in the lung tissue V/Ft1/2β,CL，AUCo-t were (1.37±0.30vs.1.90±0.24)L,(5.21±1.96vs.4.82±1.55) h,(0.81±0.12vs.1.13±0.14)L/h and (117.69±22.89vs.84.91±11.33) mg·h-1·kg-1respectively,the differences between the two groups were statistically significant (P<0.05).The results indicated that Tanreqing Injection increased the distribution amount of levofloxaction and residence time in the lung tissue of mice.Conclusion The combained of Tanreqing Injection and levofloxacin can increase the g concentration and residence time of levofloxacin in the lung tissue of mice.

Tanreqing Injection;levofloxacin;HPLC;distribution

張敏(1981-)，本科，藥師，主要從事藥學(xué)方面的研究。

:10.3969/j.issn.1671-8348.2015.15.004

R969.1

A

1671-8348(2015)15-2028-03

2014-11-26

2015-01-16)

#共同第一作者，劉曉君(1973-)，本科，主管藥師，主要從事臨床藥學(xué)方面的研究。

△通訊作者，E-mail:chenkaijie1010@126.com。