吳得紅，姚冬明，李 云，林 江，鄧兆群，楊 靜，陳星星，錢 震，馬吉春，錢 軍△

(1.江蘇大學附屬人民醫(yī)院血液科，江蘇鎮(zhèn)江 212002；2.江蘇大學附屬人民醫(yī)院檢驗科，江蘇鎮(zhèn)江 212002；3.江蘇大學附屬人民醫(yī)院中心實驗室，江蘇鎮(zhèn)江 212002；4.江蘇省昆山市第三人民醫(yī)院血液科 215300)

·論 著·

慢性髓系白血病中l(wèi)et-7a-3甲基化態(tài)勢及其臨床意義

吳得紅1,4，姚冬明2，李 云1，林 江3，鄧兆群3，楊 靜1，陳星星1，錢 震1，馬吉春3，錢 軍1△

(1.江蘇大學附屬人民醫(yī)院血液科，江蘇鎮(zhèn)江 212002；2.江蘇大學附屬人民醫(yī)院檢驗科，江蘇鎮(zhèn)江 212002；3.江蘇大學附屬人民醫(yī)院中心實驗室，江蘇鎮(zhèn)江 212002；4.江蘇省昆山市第三人民醫(yī)院血液科 215300)

目的 探討慢性髓系白血病(CML)患者中l(wèi)et-7a-3啟動子的甲基化態(tài)勢及其臨床意義。方法建立實時定量甲基化特異性PCR (RQ-MSP)分別檢測25例對照者及52例CML患者骨髓單個核細胞中l(wèi)et-7a-3啟動子未甲基化水平。結果52例CML患者未甲基化let-7a-3啟動子(59.6%)為陽性，而對照組僅1例(4%)陽性，兩組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。ROC曲線分析表明，let-7a-3啟動子未甲基化作為輔助診斷CML有較好的特異性。未甲基化let-7a-3啟動子水平與BCR/ABL融合基因轉錄水平呈顯著正相關(r=0.641，P=0.001)，但與患者的白細胞、血小板計數(shù)及血紅蛋白水平無明顯相關性(P>0.05)。在慢性期和加速期let-7a-3未甲基化水平顯著高于急變期。結論let-7a-3基因低甲基化水平隨疾病進展而降低。

慢性髓系白血?。籰et-7a-3；低甲基化；微小RNA

慢性髓系白血病(chronic myeloid leukemia,CML)是一種發(fā)生在多能造血干細胞的慢性骨髓增殖性腫瘤，以外周血中大量不成熟粒細胞及脾腫大為主要臨床特征。在受累的細胞系中，可發(fā)現(xiàn)Ph染色體和(或)BCR/ABL融合基因。按病情進展分為慢性期(CP)、加速期(AP)和急變期(BP/BC)。Ph染色體和(或)BCR-ABL融合基因是診斷CML的必要條件。然而CML的發(fā)生、發(fā)展也受其他多種因素的調節(jié)，如表觀遺傳學修飾等。先前有研究表明死亡相關蛋白激酶(DAPK)[1]、降鈣素(CT)[2-3]等抑癌基因的高甲基化，本課題組曾報道過螺旋酶抗原(HAGE)低甲基化可能和CML的發(fā)生、發(fā)展有關[4]。微小RNA(microRNA，miRNA)在CML的發(fā)病過程中與BCR/ABL融合基因一起也發(fā)揮著重要作用[5-7]。

大多數(shù)學者認為，let-7對人類的腫瘤發(fā)揮抑癌基因效應，其表達增加能夠抑制腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。但是大部分研究沒有將其成員區(qū)分開來。let-7a-3作為一種非編碼miRNA近年來備受關注，它是let-7家族中的一員，對正常細胞的增殖、分化和凋亡發(fā)揮重要作用，而這種生物學效應，也與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有關。作為表觀遺傳學調控基因表達的一種重要機制——甲基化修飾，也調控著let-7a-3的表達。有研究證實，let-7a-3在大部分人類正常組織中高度甲基化，而在肺腺癌中低甲基化[8]。對于let-7a-3在CML中的甲基化態(tài)勢及臨床意義目前尚不清楚。因此本研究旨在了解let-7a-3在CML中的甲基化狀況，并探討其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 52例CML患者均來自江蘇大學附屬人民醫(yī)院，其診斷和分期均參照《血液病診斷及療效標準》[9]，且每例患者都檢測到Ph染色體和(或)BCR/ABL融合基因。其中男29例，女23例；年齡15～83歲，平均 (46.3±17.3)歲。包括40例初診慢性期、5例加速期、7例急變期患者。25例對照組均為健康供髓者。本研究得到每位患者的知情同意，并獲得江蘇大學附屬人民醫(yī)院倫理委員會批準。

表1 let-7a-3 RQ-MSP引物序列

1.2 方法

1.2.1 骨髓單個核細胞(BMNC)分離和基因組DNA制備 抽取患者及對照組骨髓液10 mL，經(jīng)過肝素抗凝，通過Ficoll液(上海試劑二廠)離心分離BMNC，根據(jù)基因組DNA試劑盒(美國Gentra公司產(chǎn)品)操作說明，提取基因組DNA，經(jīng)紫外分光光度儀測定光密度值確定DNA水平和純度，置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 亞硫酸氫鈉修飾基因組DNA 對每例研究對象取1 μg DNA樣本，采用亞硫酸氫鈉修飾試劑盒(加拿大Chemicon公司)，嚴格按照操作說明進行基因組DNA修飾，修飾后的樣本DNA于-80 ℃保存，用于甲基化特異性PCR。

1.2.3 實時定量甲基化特異性PCR(PCR，RQ-MSP) 應用Methyl Primer Express v1.0軟件(美國 ABI 公司)設計甲基化(M)和未甲基化(U)RQ-MSP引物，選擇ALU基因作為檢測let-7a-3未甲基化的內(nèi)參基因，見表1。18 μL RQ-MSP 反應體系包含1×PCR緩沖液、MgCl24.0 mmol/L、引物0.4 μmol/L、1.0 U熱啟動Taq DNA聚合酶(日本TaKaRa公司)以及20 ng 修飾過的樣本DNA。反應條件：95 ℃ 5 min 預變性，然后 94 ℃變性 30 s、56 ℃(ALU為60 ℃)退火30 s、72 ℃延伸30 s，50個循環(huán)擴增后再72 ℃延伸 30 s，PCR熒光收集設為73 ℃ 30 s。熔解曲線程序為95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s。實驗中設立經(jīng)測序證實序列正確的M/U和ALU重組質粒作為陽性對照，無模板DNA的去離子水作為空白對照。用30 g/L瓊脂糖凝膠80 V電泳擴增產(chǎn)物，1 h后在Gene Genius 凝膠成像儀上顯像并拍照。

1.2.4 PCR產(chǎn)物克隆測序 將let-7a-3啟動子M、U以及ALU陽性的擴增產(chǎn)物經(jīng)生工生物(上海)有限公司克隆測序，驗證所得序列。

1.2.5 細胞遺傳學檢查 將采集的骨髓細胞采用24 h短期培養(yǎng)法制備染色體標本，然后進行R顯帶處理。按《人類細胞遺傳學國際命名體制(ISCN)》進行核型分析。

1.2.6 分析方法 計算未甲基化的let-7a-3啟動子標準化比率，依據(jù)公式：

Nunmethylation-let-7a-3= (Eunmethylation-let-7a-3)ΔCT unmethylation-let-7a-3 (control-sample)÷ (EALU)ΔCT ALU(control-sample)

(1)

E=10(-1 /slope)

(2)

1.3 統(tǒng)計學處理 應用 SPSS17.0 軟件進行統(tǒng)計學分析。用 Mann-Whitney U 檢驗分析對照組和CML組之間let-7a-3啟動子未甲基化水平的差異，分析let-7a-3未甲基化水平在不同性別、CML不同分期、不同核型之間的差異；用 Pearsons卡方檢驗或者Fishers 確切概率法分析不同組間let-7a-3未甲基化陽性/陰性概率差異；采用 Spearman 秩相關進行相關性分析。通過ROC曲線和曲線下面積(AUC)分析let-7a-3未甲基化水平對CML的診斷價值。所有分析設定P值為雙側分布，以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.2 let-7a-3未甲基化對CML的診斷價值 為了進一步驗證let-7a-3未甲基化水平能否作為CML診斷的一個指標，本研究進行了ROC曲線分析(圖3)，結果顯示，CML患者的AUC為0.749(95%CI：0.644～0.855)，以未甲基化水平為2.68%，診斷CML的靈敏度和特異性分別為58.5%和96.0%，雖靈敏度不好，但特異性較強。

A：未甲基化；B：甲基化；C：ALU。1：100 bp DNA Ladder；2：1例對照組標本；3～11：CML標本；12：陽性對照；13：空白對照。

圖1 let-7a-3的MSP產(chǎn)物電泳結果

A：let-7a-3啟動子甲基化產(chǎn)物測序圖，CpG中的CG未被硫化改變，仍為CG；B：let-7a-3未甲基化產(chǎn)物測序圖，CG中的C均被硫化改變?yōu)門，即為TG。

圖2 let-7a-3基因MSP產(chǎn)物測序圖

2.3 CML患者let-7a-3未甲基化與分期的關系 let-7a-3未甲基化頻率在不同性別、異常核型之間無明顯差異，但在CML不同分期之間存在組間差異(P=0.044)，見表2。進一步分析發(fā)現(xiàn)，慢性期和加速期患者未甲基化水平分別明顯高于急變期(P=0.012、0.041)，而急變期與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見圖4。

圖3 CML患者ROC曲線

a:P<0.05,與急變期比較；b:P>0.05，與對照組比較。

圖4 對照組與CML患者let-7a-3未甲基化水平比較

2.4 let-7a-3未甲基化與CML臨床參數(shù)的相關性 let-7a-3未甲基化水平與患者的年齡、BCR/ABL融合基因轉錄水平之間相關系數(shù)(r)分別為0.233(P=0.052)、0.641(P=0.001)，揭示主要在慢性期let-7a-3未甲基化水平與BCR/ABL融合基因轉錄水平呈顯著正相關。低甲基化陽性組中BCR/ABL融合基因轉錄水平明顯高于陰性組(P=0.007)，見表 2。let-7a-3未甲基化水平與患者的白細胞、血小板計數(shù)以及血紅蛋白水平無明顯相關性(P>0.05)。

表2 CML患者let-7a-3未甲基化與臨床參數(shù)的關系

續(xù)表2 CML患者let-7a-3未甲基化與臨床參數(shù)的關系

*：中位數(shù)(范圍)。

3 討 論

miRNA是一種僅包含19～25個核苷酸序列的非編碼蛋白質RNA，其作用是在轉錄后水平調節(jié)靶基因的表達[10]。已知一種miRNA最多能調控大約200種靶基因的功能。對正常細胞的增殖、分化及凋亡，miRNA發(fā)揮至關重要的作用。因此，如果miRNA的表達失調，將可能導致包括腫瘤在內(nèi)許多疾病的發(fā)生[11-12]。

miRNA let-7a-3屬于let-7家族成員之一，目前對其在腫瘤形成中的作用還存在著爭議。多數(shù)研究認為let-7通過抑制癌基因的表達而發(fā)揮抑癌作用，例如對RAS信號通路的調節(jié)[13]，以及下調c-MYC蛋白表達等[14]。然而Brueckner等[8]發(fā)現(xiàn)在健康人類胎盤、大腦、骨髓、結腸、皮膚以及肺組織中l(wèi)et-7a-3呈高度甲基化狀態(tài)，而肺腺癌細胞中l(wèi)et-7a-3呈低甲基化改變，肺腺癌細胞系經(jīng)去甲基化藥物處理后let-7a-3發(fā)生去甲基化而表達上調，且let-7a-3過表達可促進腫瘤細胞集落形成。Lu等[15]發(fā)現(xiàn)，在卵巢上皮細胞癌中，let-7a-3低甲基化患者預后較高甲基化患者差，從而揭示let-7a-3可能有促進腫瘤進展的功能，并且這種功能部分是通過調節(jié)胰島素樣生長因子(IGF)系統(tǒng)實現(xiàn)的。因此從另一方面揭示了let-7a-3的致癌特性。對于let-7a-3在髓系白血病中的作用，本實驗組曾經(jīng)報道過，獲得緩解的AML患者中，高表達的let-7a-3患者總體生存率(OS)以及無復發(fā)生存率(RFS)明顯低于低表達的let-7a-3患者[16]。

本實驗研究結果發(fā)現(xiàn)在CML患者BMNC中，let-7a-3啟動子也處于顯著低甲基化狀態(tài)，這與Brueckner等[8]在肺腺癌中的研究結果相一致，而且let-7a-3低甲基化水平與BCR/ABL轉錄水平呈顯著正相關。因此在CML中l(wèi)et-7a-3低甲基化水平是伴隨BCR/ABL融合基因轉錄水平增加的分子事件。眾所周知，BCR/ABL融合基因是診斷CML的重要依據(jù)，其擴增及轉錄水平有助于監(jiān)測病情以及判斷預后[17-18]。本研究通過ROC曲線分析發(fā)現(xiàn)，let-7a-3低甲基化改變對CML診斷的靈敏度和特異性分別為58.5%和96.0%，提示具有輔助診斷價值。但隨著CML疾病進展let-7a-3低甲基化水平進行性下降，與BCR/ABL轉錄本水平隨疾病進展而增高相反，提示let-7a-3低甲基化改變是BCR/ABL融合基因致CML發(fā)病過程中的一個早期事件，可能并不參與CML的疾病進展過程，而let-7a-3過甲基化的白血病細胞經(jīng)過藥物選擇得以生存、克隆性擴增并發(fā)生急性變。正如Du等[19]發(fā)現(xiàn)在胃腸腫瘤形成的早期過程中SOX17基因發(fā)生表達上調以保護性抑制腫瘤細胞的惡性轉化，但在腫瘤形成的晚期階段則發(fā)生表達下調而促進腫瘤進展。當然，這還有待于將來的進一步研究加以證實。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)let-7a-3低甲基化改變是CML慢性期的一個常見分子事件，可用于CML的分子輔助診斷，并且隨CML疾病進展let-7a-3低甲基化水平進行性下降。

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Methylation situation of let-7a-3 in chronic myeloid leukemia and its clinical significance*

WuDehong1,4,YaoDongming2,LiYun1，LinJiang3,DengZhaoqun3,YangJing1,ChenXingxing1,QianZhen1,MaJichun3,QianJun1△

(1.DepartmentofHematology,AffiliatedPeople′sHospitalofJiangsuUniversity,Zhenjiang,Jiangsu212002,China;2.DepartmentofClinicalLaboratory,AffiliatedPeople′sHospitalofJiangsuUniversity,Zhenjiang,Jiangsu212002,China;3.CentralLaboratory,AffiliatedPeople′sHospitalofJiangsuUniversity,Zhenjiang,Jiangsu212002,China;4.DepartmentofHematology,theThirdPeople′sHospitalofKunshan,Jiangsu215300,China)

Objective To investigate the methylation situation of let-7a-3 promoter in patients with chronic myeloid leukemia (CML) and its clinical significance.Methods The methylation level of let-7a-3 promoter in the bone marrow mononuclear cells of 52 CML patients and 25 controls was detected by using the real-time quantitative methylation-specific PCR (RQ-PCR).Results The non-hypomethylation of let-7a-3 promoter was positive in 31 cases(59.6%) of 52 CML patients,while only 1 case(4%,1/25) in the control group,the difference between the two groups were statistically significant (P<0.01).The ROC curve analysis showed that the non-hypomethylation of let-7a-3 has better specificity for the auxiliary diagnosis of CML.The significantly positive correlation was found between the non-methylation level of let-7a-3 promoter and the BCR/ABL transcription level (r=0.641,P=0.001).In contrast,there was no obvious correlation between the non-methylation level of let-7a-3 promoter and the WBC count,platelet count and hemoglobin levels(P>0.05).The non-hypomethylation level of let-7a-3 in chronic phase and accelerate phase was significantly higher than that in blastic crisis of CML.Conclusion The hypomethylation level of let-7a-3 promoter is decreased with disease progression.

chronic myeloid leukemia;let-7a-3;hypomethylation;microRNA

:10.3969/j.issn.1671-8348.2015.15.002

國家自然科學基金資助項目(81270630、81172592、SH2013042)；鎮(zhèn)江市社會發(fā)展項目(SH2010015、SH2011056)；江蘇省“333工程”科研項目資助計劃(BRA2011085、BRA2013136)；江蘇省科技廳臨床醫(yī)學科技專項資金項目(BL2012056)；鎮(zhèn)江市科技基礎設施建設項目(SS2012003)。

吳得紅(1982-)，碩士，主治醫(yī)師，主要從事惡性血液病的臨床及基礎研究。

△通訊作者，E-mail：qianjun0007@sina.com。

R733.72

A

1671-8348(2015)15-2020-04

2014-10-18

2015-02-25)