劉 丹，夏 雪，吳益梅，辜金花，田玉肖，孫 勃

（四川農(nóng)業(yè)大學園藝學院，四川雅安 625014）

植物染色體制片效果影響因素的解析

劉 丹，夏 雪，吳益梅，辜金花，田玉肖，孫 勃*

（四川農(nóng)業(yè)大學園藝學院，四川雅安 625014）

高質(zhì)量的染色體制片是后續(xù)研究工作的基礎，在實際操作中要獲得理想的制片并不容易。本文綜述取材時間與根尖長度、預處理、解離、染液的選擇和制片方法等5項壓片法中影響植物染色體制片效果的主要因素，其中預處理為關鍵環(huán)節(jié)。

植物；染色體；制片；影響因素；壓片法

植物染色體制片技術是遺傳學經(jīng)典實驗之一，也是從事細胞學研究的一項基本實驗技能。該項技術是進行染色體計數(shù)、核型分析和原位雜交等研究的基礎，廣泛地應用于植物倍性鑒定、植物分類與親緣關系研究，在植物遺傳育種中具有重要作用［1］。高質(zhì)量的染色體制片是保證核型分析和原位雜交等后續(xù)工作順利進行的首要條件［2］。一張好的制片，首先應具有較多的分裂相，特別是中期分裂相；其次應具有較好的制片效果，具體表現(xiàn)為染色體分散性好，收縮適中，形態(tài)良好，著絲粒清晰可見等。

常用的染色體制片方法包括壓片法和去壁低滲法［2］，與去壁低滲法相比，壓片法步驟較少，操作簡便，時間快速，節(jié)省材料，容易掌握，效果也較好，在植物特別是農(nóng)作物和園藝作物的染色體制片中被廣泛使用［3-7］；而去壁低滲法則多用于動物和染色體數(shù)目多而小的植物中。壓片法的基本步驟包括取材、預處理、固定、保存、解離、染色制片和鏡檢觀察。雖然壓片法制備染色體技術并不復雜，但在實際操作中要獲得理想的制片并不容易，主要原因是不同物種最優(yōu)的處理條件往往存在明顯差異。近年來關于各類植物染色體制片的報道已有很多（表1），但對影響制片效果因素的系統(tǒng)探討與分析卻鮮有報道。結(jié)合已有文獻和作者的研究結(jié)果，本文將著重解析壓片法中影響植物染色體制片效果的各項關鍵因素，以期為植物染色體制片提供參考。

1 取材時間與根尖長度

高等植物有絲分裂主要發(fā)生在根尖、莖尖生長點和幼葉等的分生組織，理論上所有發(fā)生有絲分裂的組織、愈傷組織和細胞懸浮液等均可用于染色體的制備，但實際操作中染色體制片常用根尖作為材料，通常只有根尖不易獲得時才會選取莖尖或幼葉等組織。其主要原因如下，根尖的分生組織有絲分裂旺盛且細胞壁薄，如葡萄根尖有絲分裂中期的細胞數(shù)目顯著高于卷須、莖尖和幼葉組織［8-16］；與莖尖等其他分生組織相比，根尖取材容易，操作和鑒定簡便；在實驗室內(nèi)可在可控環(huán)境條件下采用種子萌發(fā)的形式獲得大量的新鮮幼嫩根尖，不受生長季節(jié)和外界環(huán)境的影響和限制；對于一些稀少珍貴的材料，取用根尖對材料的傷害要遠遠小于取用莖尖等組織；另外，絕大多數(shù)的植物在剪取根尖后仍可繼續(xù)正常生長，并不斷萌發(fā)新根，因此不會影響后續(xù)研究［1］。

制片要獲得較多的分裂相，需要保證植物細胞處于旺盛的有絲分裂期，因此取材時間就顯得非常關鍵（表1）。一天中植物分裂旺盛期一般出現(xiàn)在8：00—11：00，但不同物種的細胞分裂期長短及分裂旺盛的時間點存在一定差異。如黃瓜取材時間在8：40—9：10，中期分裂相較多，制片成功率也較高［3］；而同為瓜類的甜瓜根尖則在8：00左右為最佳取樣時期［4］。筆者所在課題組對黃花芥藍的取材時間進行研究發(fā)現(xiàn)，9：00左右效果最好。同時需要注意的是，并不是所有物種都適合在上午取材，如天南星科植物白掌和觀音蓮12：00—14：00取材時分裂相細胞較多，而8：00—10：00分裂相細胞較少，這與大多數(shù)植物的常規(guī)取材時間有所不同［10］。另一方面，根尖長度對分裂相的多少也有明顯影響。研究表明，春石斛組培苗根尖長度為10 mm時中期分裂相較多［11］；青花菜的根尖長度在13～15 mm時，中期分裂相數(shù)量最多［5］；不結(jié)球白菜的根尖長度為10～20 mm時，獲得的分裂相比例最多［6］。因此，在進行植物制片條件優(yōu)化時，可參考這些時間點嘗試從8：00—11：00設置梯度以求最快找到最佳取材時間點，同時控制根尖長度為10～20 mm，以便獲取更多的中期分裂相，制出成功的染色體制片。

表1 不同植物染色體制片影響因素及最佳條件

2 預處理

預處理的主要目的就是通過阻斷、抑制和破壞紡錘絲的形成使細胞分裂停滯在中期，進而獲得更多的中期分裂相細胞；同時預處理還能改變細胞質(zhì)的黏度，促使染色體分散和收縮，以便于壓片和觀察。因此，預處理是染色體制片中的關鍵環(huán)節(jié)。常用的預處理方法有物理法、化學法和混合處理法［1］。

預處理對制片效果的影響主要表現(xiàn)在處理試劑和處理時間兩方面。常用的預處理試劑包括冰水、對二氯苯、8-羥基喹啉、秋水仙素、α-溴萘及混合試劑組合。有研究表明，對二氯苯處理染色體分散較好［14］；8-羥基喹啉處理能使染色體及縊痕和次縊痕清晰，顯示效果良好，適合染色體較大的植物［14］；秋水仙素處理能高效積累中期分裂相，通常效果較好［8］；α-溴萘適用于禾本科植物（如玉米）和水生植物材料［13］；但以上結(jié)論在不同植物中可能會有所不同［5］。當單一試劑效果不佳時，可考慮采用不同預處理劑的組合。如百里香染色體制片中以0.04%秋水仙素和0.002 mol·L-18-羥基喹啉等體積混合溶液預處理根尖2～3 h，累積的中期分裂相最多［8］；木薯根尖采用α-溴萘與飽和對二氯苯的混合液預處理效果最好［12］，均優(yōu)于單一試劑處理。處理時間方面，筆者所在課題組以黃花芥藍為材料進行了研究，結(jié)果表明，預處理時間不夠會導致染色體聚縮程度不到位，染色體拖尾，呈小蝌蚪狀且邊緣不整齊（圖1中A），這樣的染色體很難進行核型分析等后續(xù)研究；而預處理時間過長，則導致染色體聚縮過度呈現(xiàn)豆狀或點狀，形態(tài)不佳，且無法識別著絲粒位置（圖1中B），不利于后續(xù)分析，而條件合適的染色體無論聚縮程度還是形態(tài)均較理想（圖1中E），類似的結(jié)果在油菜、水稻和芝麻等植物上也被報道［17］。同時還應注意的是，不同預處理試劑對應的處理濃度和處理時間也不盡相同。如8-羥基喹啉的濃度多為0.002 mol·L-1，秋水仙素一般為0.01%～0.10%，而對二氯苯則為飽和狀態(tài)。處理時間方面，洋蔥以冰水處理，一般需處理2～3 d［18］，而在飽和對二氯苯溶液中的預處理只需3 h［15］?？傊煌参镞m用的預處理試劑和時間具有一定差異，需根據(jù)具體情況進行選取。

3 解離

解離的目的在于軟化和分解細胞壁，使細胞間易于分離；同時解離還可以清除部分細胞質(zhì)，使細胞質(zhì)背景近于透明化，便于染色體的觀察［1］。常用的解離方法包括酸解法和酶解法。酸解法步驟簡便，容易掌握，經(jīng)過酸解和壓片后，根尖分生組織多呈現(xiàn)單細胞狀態(tài)，但分裂細胞的染色體仍包裹在細胞壁中。因此，酸解法廣泛應用于染色體計數(shù)、核型分析和染色體畸變的觀察與分析。酶解法使用纖維素酶和果膠酶，經(jīng)過酶解和壓片后，分生細胞的原生質(zhì)體從細胞壁中脫離出來，使得染色體周圍不帶細胞質(zhì)或僅有少量細胞質(zhì)，從而得到細胞背景干凈、染色體分散較好的制片，該方法適合染色體數(shù)目多、形態(tài)小的植物［2］，如部分果樹染色體。因此，酸解法常用于染色體顯帶技術或姊妹染色單體交換研究［1］。

在實際操作中，酸解法通常采用1 mol·L-1的鹽酸在60℃下解離若干分鐘，解離時間的長短因物種不同而有所差別。解離時間過短，會導致細胞壁不夠軟化，細胞不容易分散，并且染色體和細胞質(zhì)均被明顯染色，不易區(qū)分；若解離時間過長，染色體和細胞質(zhì)的著色都變得困難，且分辨度模糊［8］，筆者對黃花芥藍解離時間優(yōu)化的結(jié)果也驗證了這些結(jié)論（圖1中C，D，E）。針對特定物種的制片條件進行優(yōu)化時，酸解法和酶解法還可結(jié)合使用。如燕麥屬牧草先用1 mol·L-1的鹽酸在60℃下酸解10 min，再用20 g·L-1的纖維素酶溶液在25℃下酶解處理20 min，染色體即分散良好且沒有細胞壁覆蓋，制片效果清晰可見［14］。

圖1 不同預處理時間和解離時間對芥藍染色體的影響

4 染液選擇

在光學顯微鏡下對染色體形態(tài)和結(jié)構(gòu)進行觀察時，須先對根尖材料進行染色，通常采用染色體染色效果好而細胞質(zhì)著色少的染液。可用于植物染色體制片的染液種類較多，如改良卡寶品紅、醋酸洋紅、醋酸地衣紅、鐵礬-蘇木精和孚爾根試劑等，不同染液的特點也不盡相同。通常改良卡寶品紅染液適合大多數(shù)植物的染色，且僅使染色體著色而細胞質(zhì)幾乎不著色，進而提高染色體與背景的對比度。而1%醋酸洋紅染液只作臨時鏡檢觀察。田秋元等［15］發(fā)現(xiàn)，采用醋酸洋紅對洋蔥根尖細胞染色制片時，細胞質(zhì)和染色體對比度小，且染色體模糊不清，不能用于核型分析，而用卡寶品紅染液染色的制片則效果良好。醋酸地衣紅易溶于乙醇，因此操作時需先將70%乙醇保存的材料充分洗凈后再浸入45%冰乙酸溶液中進行染色。經(jīng)過鐵礬-蘇木精染色后，染色體能染為深藍色，而且細胞壁和細胞質(zhì)也均能一定程度地著色，染色體在壓片后容易分散但較為堅硬，因此必須用45%冰乙酸溶液處理，以使細胞質(zhì)褪色，染色體變軟，這種染液染色深、反差大、分色清晰，利于制片標本的長期保存。孚爾根試劑僅對細胞核和染色體中的DNA顯色，且顏色均一清晰，細胞軟化效果好，但壓片時較長的染色體容易相互纏繞且不易分散。使用孚爾根試劑染色時需注意必須采用酸解法進行解離，且前處理要求較高，解離時間過長，會導致染色效果消退，消退程度與固定液種類有關，一般認為采用FAA固定液效果要優(yōu)于常用的卡諾固定液。因此，在具體操作中研究人員需根據(jù)試驗需求選取合適的染液［1］。

5 制片方法

常用的制片方法包括敲片法、壓片法、涂布法、玻棒搟片法、醋酸烘烤壓片法等［7，19］。制片中出現(xiàn)的常見問題有染色體不夠分散存在重疊；染色體不在同一平面；背景中有較多雜質(zhì)；染色不均勻；制片中出現(xiàn)較多氣泡等等。這些問題均可通過不斷練習制片方法來解決。其中，敲片法是最傳統(tǒng)的方法，適用性廣，一般不會在操作過程中產(chǎn)生氣泡，但操作時間較長；在酒精燈上烘烤可以加深染色，但烘烤過程中溫度過高會產(chǎn)生很多雜質(zhì)，因此烤片時要注意受熱均勻且時間不宜過長；同時，幾種方法可疊加使用。在操作中還需注意，無論采用哪種制片方法，都不要使蓋玻片被搓動，以便使材料分散壓平，便于觀察。在平時的實驗操作中需要反復練習，這樣才能較好地掌握制片技術，獲得理想的效果。

綜上可知，影響制片優(yōu)劣的主要因素中預處理是關鍵環(huán)節(jié)。染色體制片的目標就是獲得高質(zhì)量的制片，為后續(xù)的核型分析和原位雜交等研究提供先決條件。不同植物染色體制片的各項關鍵因素最佳參數(shù)各異，因此，在正式開始研究前，需針對以上各因素進行染色體制片的條件優(yōu)化試驗，從而獲得針對目標植物最優(yōu)且穩(wěn)定的制片條件，以便后續(xù)研究可以正常有序地開展。同時，染色體制片中還存在耗時過長和部分預處理試劑毒性較大的問題，如何縮短實驗時間及篩選無毒或低毒的預處理試劑也是未來制片技術發(fā)展的重要方向。

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（責任編輯：張瑞麟）

S 184

：A

：0528-9017（2015）10-1654-04

文獻著錄格式：劉丹，夏雪，吳益梅，等.植物染色體制片效果影響因素的解析［J］.浙江農(nóng)業(yè)科學，2015，56（10）：1654-1657.

10.16178/j.issn.0528-9017.20151044

2015-05-10

四川省教育廳重點項目（14ZA0016）；四川省省級大學生創(chuàng)新訓練計劃項目（201410626036）；四川農(nóng)業(yè)大學本科質(zhì)量工程項目（04052109）

劉 丹（1996-），女，四川內(nèi)江人，本科生，從事蔬菜細胞遺傳學研究工作。E-mail：liudan618419@163.com。

孫 勃。E-mail：14099@sicau.edu.cn。