江 文，陸躍樂，范永仙，陳小龍

（浙江工業(yè)大學(xué)生物與環(huán)境工程學(xué)院發(fā)酵工程研究所，浙江杭州 310014）

不同順丁烯二酰亞胺類化合物的制備及對(duì)灰霉病的抑制效果

江 文，陸躍樂，范永仙，陳小龍*

（浙江工業(yè)大學(xué)生物與環(huán)境工程學(xué)院發(fā)酵工程研究所，浙江杭州 310014）

為解決灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）抗藥性難題，篩選出高效、低毒的順丁烯二酰亞胺類新型抗菌劑，本實(shí)驗(yàn)以3種常用的農(nóng)藥中間體對(duì)叔丁基芐胺、2，3-二氯-4-羥基苯胺和4-（4-甲基苯氧基）芐胺與7種不同順丁烯二酸酐為底物，采用乙酸法、DMF法和甲醇法制備了21種順丁烯二酰亞胺類化合物；所有化合物通過1H NMR和ESI-MS進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征。實(shí)驗(yàn)采用菌絲生長速率法初步研究了21種新型順丁烯二酰亞胺類化合物對(duì)B.cinerea菌絲生長的抑制效果。結(jié)果表明，5種化合物（Ⅰ-1，Ⅲ-1，Ⅲ-3，Ⅲ-4和Ⅲ-5）對(duì)B.cinerea菌絲生長抑制較強(qiáng)，已超過商用殺菌劑氯硝胺（EC50=15.89μg·m L-1），這為開發(fā)新型抗菌劑提供了研究基礎(chǔ)。

順丁烯二酰亞胺；灰霉病菌；抑制效果

目前，植物致病真菌是引起植物病害最重要的因素，約有70%的植物病害是因?yàn)檎婢鸬?，真菌能引起多種植物病害，對(duì)各國的農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)造成巨大損失［1］?；颐共∈怯苫移咸焰呔秩舅碌囊环N世界性植物病害，可對(duì)多種水果、谷類、蔬菜、豆類產(chǎn)生病害，尤其是葡萄、草莓、胡蘿卜、黃瓜等，導(dǎo)致農(nóng)作物減產(chǎn)，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失［2-3］。因此開發(fā)新型殺菌劑對(duì)灰霉病的防治與抗藥性治理具有重要意義。

順丁烯二酰亞胺類化合物的α，β不飽和二酰亞胺環(huán)狀結(jié)構(gòu)決定了它在化學(xué)工業(yè)中的重要作用，該類化合物在農(nóng)藥化學(xué)上對(duì)許多細(xì)菌、酵母、真菌等微生物具有良好的抑制作用［4］。然而該類化合物種類單一，部分毒性大，限制了其在農(nóng)業(yè)上的使用。4-叔丁基芐胺、4-（4-甲基苯氧基）芐胺和2，3-二氯-4-羥基苯胺分別是殺螨劑吡螨胺、殺蟲劑唑蟲酰胺和殺菌劑環(huán)酰菌胺的重要合成中間體［5-7］，同時(shí)它們都含有一個(gè)伯氨基，因此能夠與不同順丁烯二酸酐反應(yīng)制備順丁烯二酰亞胺類化合物。作者利用4-叔丁基芐胺、2，3-二氯-4-羥基苯胺、4-（4-甲基苯氧基）芐胺與不同順丁烯二酸酐合成了一系列順丁烯二酰亞胺類化合物，并通過體外試驗(yàn)檢測(cè)其對(duì)灰霉病菌的抑菌活性。這為篩選具有高抑菌活性的新型順丁烯二酰亞胺類化合物，以期為我國新型抗菌劑的開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

馬來酸酐、檸康酸酐、二氯馬來酸酐、二苯基馬來酸酐（阿拉丁（上海）試劑有限公司）；甲醇、乙酸、乙酸乙酯、石油醚（杭州華林化工儀器公司）。所有試劑均為分析純。核磁共振儀（瑞士Bruker公司）；液相色譜-離子阱質(zhì)譜儀（Thermo Fisher Scientific）；GXZ型智能光照培養(yǎng)箱（上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司）；SW-CJ-6超凈凈化工作臺(tái)（上海錦昱科學(xué)儀器有限公司）。

1.2 不同順丁烯二酰亞胺類化合物合成與分離

化合物Ⅰ-1～Ⅰ-6和Ⅱ-1～Ⅱ-6采用乙酸法（Path A）制備［8］。稱取不同酸酐0.001 5和0.001 mol· L-1各有機(jī)胺加入到裝有磁力攪拌子的三口燒瓶中，再加入15 mL冰醋酸溶解，加熱回流反應(yīng)2 h，反應(yīng)結(jié)束后，待反應(yīng)液冷卻至室溫，減壓蒸餾，除去溶劑，得到濃縮液，將濃縮液進(jìn)行薄層層析或硅膠柱層析分離（洗脫劑V石油醚∶V乙酸乙酯為8～16∶1），并收集目標(biāo)液，真空旋轉(zhuǎn)去溶劑，得到目標(biāo)產(chǎn)物（圖1）。

圖1 順丁烯二酰亞胺類化合物的合成

化合物Ⅲ-1～Ⅲ-4的制備。稱取不同酸酐0.001 5和0.001 mol·L-1各有機(jī)胺加入到裝有磁力攪拌子的三口燒瓶中，加入15 mL DMF，30～40℃下反應(yīng)約30 min，再滴加1 mmol P2O5，30μL濃硫酸與1 mL DMF混合溶液，75℃下攪拌反應(yīng)6 h。反應(yīng)結(jié)束后，利用乙酸乙酯和水分別萃取2次，再通過無水Na2SO4除水，得有機(jī)相經(jīng)真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑，得到濃縮液，將濃縮液進(jìn)行硅膠柱層析分離（洗脫劑V石油醚∶V乙酸乙酯∶V乙酸為2 m L∶1 mL∶20μL），并收集目標(biāo)液，真空旋轉(zhuǎn)去溶劑，得到目標(biāo)產(chǎn)物。

化合物Ⅰ-7，Ⅱ-7，Ⅲ-5，Ⅲ-6和Ⅲ-7采用甲醇鈉溶液制備［9］。稱取不同有機(jī)胺0.001 mol·L-1加入已裝有磁力攪拌子的圓底燒瓶中，加入5 m L的0.26 mol·L-1的甲醇鈉溶液，再加入0.001 5 mol·L-1不同酸酐化合物，25～35℃反應(yīng)1 h，加入150μL三乙胺，反應(yīng)20 min，最后升溫至45～70℃，反應(yīng)1～3 h；反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液冷卻至室溫，減壓蒸餾，除去溶劑，得到濃縮液，將濃縮液進(jìn)行薄層層析或硅膠柱層析分離（洗脫劑V石油醚∶V乙酸乙酯為8～16∶1），并收集目標(biāo)液，真空旋轉(zhuǎn)去溶劑，得到目標(biāo)產(chǎn)物。所有化合物通過1H NMR和ESI-MS進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征。

1.3 活性檢測(cè)

1.3.1 供試菌

灰葡萄孢（Botrytis cinerea）（中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心，編號(hào)ACCC30387）。

1.3.2 含藥培養(yǎng)基平板的制備

供試培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基。首先吸取同一藥物從低濃度到高濃度不同濃度各1 m L，加入直徑為9.0 cm的無菌培養(yǎng)皿中，其次加入加熱融化的PDA培養(yǎng)基9.0 m L，以“8”字形充分混勻，最后得到稀釋10倍的藥物濃度，最終配制成濃度分別為200，100，50，25，12.5，6.25，3.125，1.56，0.78，0.39μg·m L-1的含藥PDA培養(yǎng)基平板，每個(gè)梯度設(shè)2個(gè)平行，其中以加入1.0 m L 0.1%的吐溫80和9.0 m L已滅菌融化的PDA培養(yǎng)基為對(duì)照，以10.0 m L已滅菌融化的PDA培養(yǎng)基為空白。

1.3.3 抗菌活性測(cè)定方法

采用菌絲生長速率法［10］測(cè)定。用直徑6.0 mm的打孔器在固體PDA的邊緣取活化好的灰葡萄孢菌碟，將菌碟菌絲面朝下，分別接種至含藥PDA培養(yǎng)基平板和對(duì)照組培養(yǎng)基平板的正中央，于23℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待對(duì)照菌落直徑在50～80 mm時(shí)（灰葡萄孢一般需要72 h才能達(dá)到測(cè)量要求），采用十字交叉法測(cè)量菌落生長直徑，每個(gè)梯度可得4個(gè)數(shù)值，求其平均值得到較準(zhǔn)確的藥劑處理的菌落直徑和對(duì)照菌落直徑，求取抑制率。菌絲生長抑制率/%=100×［1-（藥劑處理的菌落直徑-6）/（對(duì)照的菌落直徑-6）］。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同順丁烯二酰亞胺類化合物的制備

已報(bào)道的關(guān)于順丁烯二酰亞胺類化合物的合成，主要采用兩步法合成，乙酸酐法和共沸法，用一步法（乙酸法）合成［11］。順丁烯二酰亞胺類化合物Ⅰ-1～Ⅰ-6和Ⅱ-1～Ⅱ-6即利用乙酸法合成，反應(yīng)時(shí)間較兩步法短，產(chǎn)率較高，達(dá)70%以上，是合成順丁烯二酰亞胺類化合物理想的方法。但乙酸（反應(yīng)溫度60～100℃）作為溶劑，產(chǎn)率可達(dá)55%～80%。因此溫度控制是影響反應(yīng)產(chǎn)率的一個(gè)重要方面，在達(dá)到乙酸沸點(diǎn)（117℃）后將溫度稍提高，回流攪拌反應(yīng)，產(chǎn)率得到提高。另一方面，因?yàn)橐宜岱蛛x較為困難，反應(yīng)結(jié)束后除去乙酸過程中產(chǎn)物會(huì)有部分損失，導(dǎo)致成本增加。同時(shí)對(duì)剩余的順丁烯二酰亞胺類化合物利用乙酸法均未達(dá)到理想結(jié)果，且有的產(chǎn)率極低。最主要的問題是副產(chǎn)物太多，導(dǎo)致無法較好的分離純化。主要原因可能是側(cè)鏈有雙甲基、苯基等存在，空間位阻較大，無法合成相應(yīng)的順丁烯二酰亞胺類化合物。合成的順丁烯二酰亞胺類化合物如圖2所示。

對(duì)于Ⅲ-1～Ⅲ-4的合成，首先嘗試的是乙酸法，反應(yīng)結(jié)束后發(fā)現(xiàn)有較多副產(chǎn)物產(chǎn)生。經(jīng)檢測(cè)，2，3-二氯-4-羥基苯胺上的氨基并未發(fā)生反應(yīng)，這是由于該胺的羥基活性較氨基強(qiáng)，故易與酸酐發(fā)生酯化反應(yīng)，卻很難與氨基發(fā)生酰胺化。因此采用以DMF作溶劑，再脫水閉環(huán)的兩步法合成相應(yīng)的順丁烯二酰亞胺類化合物，分離純化后產(chǎn)率達(dá)到80%左右。

甲醇法，即在甲醇鈉的甲醇溶液中，游離的順丁烯二酸酐與胺反應(yīng)。第一步生成酰胺酸，第二步是在三乙胺的作用下發(fā)生閉環(huán)脫水反應(yīng)，生成順丁烯二酰亞胺。為了操作簡便，在反應(yīng)過程中生成的副產(chǎn)物NaCl不需要分離，直接進(jìn)行操作。

圖2 合成的順丁烯二酰亞胺類化合物

2.2 不同順丁烯二酰亞胺類化合物對(duì)離體B. cinerea菌絲生長的抑制效果

EC50表示半抑制B.cinerea生長的有效濃度，可明顯反映各化合物抑菌濃度的差異，故選其作為主要比較參數(shù)（表1）。上述21種順丁烯二酰亞胺類化合物中，Ⅰ-1，Ⅲ-1，Ⅲ-3，Ⅲ-4和Ⅲ-5對(duì)離體B.cinerea生長抑制較強(qiáng)，已超過商用殺菌劑氯硝胺（EC50=15.89μg·m L-1）。其余大部分不同的順丁烯二酰亞胺類化合物對(duì)B.cinerea生長均具有一定的抑制作用。其中除Ⅰ-2，Ⅰ-6，Ⅰ-7，Ⅱ-3，Ⅱ-4，Ⅱ-5，Ⅱ-6和Ⅱ-7這8種順丁烯二酰亞胺類衍生物的EC50＞100μg·mL-1外，剩余的化合物對(duì)抑制B.cinerea菌絲生長都表現(xiàn)出較好的抑制效果。同時(shí)根據(jù)酰亞胺環(huán)上2，3位上基團(tuán)的變化，這類化合物會(huì)具有不同的抑菌效果［12］。經(jīng)研究得出，當(dāng)2，3位上沒有其他官能團(tuán)時(shí)，這類化合物對(duì)真菌等具有較強(qiáng)的抑菌作用，其中的原因有可能是因?yàn)轷啺肥怯蓀-π共軛雙鍵形成的環(huán)狀化合物，對(duì)電子的親和力較強(qiáng)，具有電子接受體的性質(zhì)，同時(shí)使酰亞胺環(huán)上的碳正離子易受到親核攻擊，但由于2，3位上基團(tuán)的改變，使酰亞胺環(huán)上的電子云發(fā)生改變，從而影響抑菌效果，這對(duì)今后篩選抑菌活性較高的順丁烯二酰亞胺類化合物具有一定的指導(dǎo)意義。

表1 新型順丁烯二酰亞胺類化合物對(duì)離體B.cinerea的抑制作用

3 小結(jié)與討論

本文用乙酸法合成順丁烯二酰亞胺類化合物對(duì)比于常用的兩步合成法，反應(yīng)時(shí)間短，產(chǎn)率高，是合成順丁烯二酰亞胺類化合物的理想方法。DMF法主要是使含羥基的胺與部分酸酐反應(yīng)，產(chǎn)率較高。甲醇法可使2，3位空間位阻較大的酸酐，尤其是二甲基順丁烯二酸酐與胺反應(yīng)，反應(yīng)時(shí)間短，分離簡單。

目前關(guān)于順丁烯二酰亞胺類化合物用作B. cinerea等植物致病真菌的殺菌劑方面的研究較少。其對(duì)體外B.cinerea菌絲生長的抑制效果表明，大多數(shù)順丁烯二酰亞胺類化合物對(duì)其具有很好的抑制效果，尤其是Ⅰ-1，Ⅲ-1，Ⅲ-3，Ⅲ-4和Ⅲ-5對(duì)離體B.cinerea生長抑制較強(qiáng)。因此，順丁烯二酰亞胺類化合物具有開發(fā)為新型殺菌劑農(nóng)藥的巨大潛力。

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（責(zé)任編輯：張瑞麟）

S 432

：A

：0528-9017（2015）10-1611-04

文獻(xiàn)著錄格式：江文，陸躍樂，范永仙，等.不同順丁烯二酰亞胺類化合物的制備及對(duì)灰霉病的抑制效果［J］.浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，56（10）：1611-1614.

10.16178/j.issn.0528-9017.20151029

2015-05-14

江 文（1990-），男，安徽桐城人，在讀碩士，研究方向?yàn)樯镛D(zhuǎn)化與生物催化。E-mail：jiang8796@126.com。

陳小龍。E-mail：jiang8796@126.com。