戚行江，任海英，梁森苗，鄭錫良，吳陽春

（浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所，浙江杭州 310021）

楊梅全基因組測序結(jié)果初報

戚行江，任海英，梁森苗，鄭錫良，吳陽春

（浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所，浙江杭州 310021）

楊梅（Myrica rubra Sieb.et Zucc.）是我國南方著名的特產(chǎn)珍果，為促進(jìn)楊梅分子育種及功能基因研究，對楊梅進(jìn)行了全基因組測序。采用Illum ina Hiseq 2500雙端測序策略，構(gòu)建了200 bp文庫，進(jìn)行雙端125 bp（PE 125）測序，得到約13.70 Gb的原始數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)評估得知楊梅基因組大小約為304.38 Mb，重復(fù)序列含量約為45.82%，雜合率約為0.58%，基因組的GC含量約37.99%。利用SOAPdenovo軟件進(jìn)行了拼接組裝。這一結(jié)果有助于開展楊梅后續(xù)的分子育種及基因功能研究。

楊梅；全基因組測序；基因組特征評估

楊梅（Myrica rubra Sieb.et Zucc.）是我國南方著名的特產(chǎn)珍果，果實(shí)色澤鮮艷，酸甜適口，風(fēng)味獨(dú)特，營養(yǎng)豐富，深受人們喜愛。浙江省楊梅種植歷史悠久，是世界上最早對楊梅進(jìn)行人工栽培的地區(qū)。2015年浙江省楊梅實(shí)際栽培面積近8.67萬hm2，產(chǎn)量近50萬t，栽培面積和產(chǎn)量均居全國第一，是浙江省僅次于柑橘的第二大果樹。目前，浙江省已成為中國乃至世界楊梅產(chǎn)業(yè)中心，楊梅產(chǎn)業(yè)在浙江省特色農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中有著特殊的地位和作用，現(xiàn)已成為浙江省“三農(nóng)”經(jīng)濟(jì)發(fā)展以及農(nóng)民脫貧致富的重要產(chǎn)業(yè)。

楊梅產(chǎn)業(yè)在浙江省還在不斷發(fā)展之中，但隨著面積的不斷發(fā)展與產(chǎn)量的持續(xù)上升，楊梅生產(chǎn)問題也在日益突現(xiàn)，在品種方面表現(xiàn)尤為明顯，四大良種東魁、荸薺種、丁岙楊梅、晚稻楊梅等，這些品種的育成均采用系統(tǒng)優(yōu)選獲得，雖然性狀上存在差異，但類型仍然較為相似，不同品種的熟期間隔不大，且均存在樹形高大、始果期遲、果實(shí)不耐貯藏、抗病性不足等問題。為了培育更優(yōu)良的品種，更新楊梅育種技術(shù)與育種手段成為產(chǎn)業(yè)的迫切需求，楊梅的雌雄種質(zhì)及不同品種在分子標(biāo)記上存在重要差異［1-2］，這為分子育種提供了重要信息，但是尚不能滿足更深入的產(chǎn)業(yè)需求。

隨著科學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，轉(zhuǎn)錄組測序、基因組全測序已經(jīng)成為研究動物［3-4］、植物［5-6］、病原生物［7］等的重要技術(shù)手段，這大大加速了人類對于研究目標(biāo)的認(rèn)知速度，有利于更好更快的利用分子技術(shù)改良物種。目前已經(jīng)對十幾種果樹進(jìn)行了全基因組測序，這大大促進(jìn)了果樹科學(xué)的發(fā)展［8］。為了更好地從分子水平深入了解楊梅的生長性能、品質(zhì)和抗病性等種質(zhì)特性，促進(jìn)楊梅分子育種及功能基因研究，本文對楊梅進(jìn)行了全基因組測序。

1 材料與方法

1.1 文庫的構(gòu)建及測序

楊梅嫩葉送北京百邁客生物科技有限公司進(jìn)行檢測。CTAB方法提取楊梅嫩葉基因組DNA，進(jìn)行小片段文庫建庫測序。用Qubit dsDNA HS Assay Kit（Life technologies）對基因組DNA進(jìn)行精確定量。

小文庫構(gòu)建。取500 ng基因組DNA用1×TE稀釋至50μL，用超聲法進(jìn)行機(jī)械打斷，用QIAquick PCR purification Kit（QIAGEN）對片段化DNA進(jìn)行純化；在T4 polynucleotide kinase、T4 DNA polymerase、Klenow Large Fragment和dNTP（New England Biolabs，NEB）的反應(yīng)體系催化下對片段化的DNA進(jìn)行修復(fù)，形成5'端帶有磷酸基團(tuán)的平末端序列，并用QIAquick PCR purification Kit（QIAGEN）進(jìn)行純化；在Klenow Fragment（exo-）（NEB）的催化下，在上述DNA的3'端添加連接反應(yīng)所需的A堿基，并用M inElute PCR purification Kit（QIAGEN）進(jìn)行純化；將不含barcode的Illumina paired-end adapters連接到待測DNA片段兩端，并用MinElute PCR purification Kit（QIAGEN）進(jìn)行純化；用2%的低分子量瓊脂糖（BioRad）凝膠電泳對純化連接產(chǎn)物進(jìn)行分離，切膠選擇300 bp（插入片段200 bp），用QIAquick Gel Extraction Kit（QIAGEN）對分離膠塊進(jìn)行純化；用帶有可以區(qū)分文庫的index引物對膠回收片段進(jìn)行擴(kuò)增富集，并對PCR產(chǎn)物再次進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳切膠純化，最終獲得可用于測序的文庫。用7500 DNA LabChip芯片在Agilent Technologies 2100生物分析儀上對所得文庫片段大小進(jìn)行質(zhì)檢，用qPCR定量方式對文庫進(jìn)行精確定量。根據(jù)qPCR定量結(jié)果對不同文庫進(jìn)行混樣，在Illumina HiSeq 2500測序儀上按照雙端125 bp進(jìn)行測序。

1.2 信息分析流程

雙端測序數(shù)據(jù)通過評估（GC分布統(tǒng)計、質(zhì)量值Q20、Q30評估）、過濾后得到高質(zhì)量的數(shù)據(jù)（clean reads），用于基因組特征評估。

1.3 基因組特征評估

利用基因組調(diào)研圖進(jìn)行基因組特征的評估，評估基因組大小、雜合情況及GC含量情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 測序結(jié)果統(tǒng)計

使用楊梅樣品的基因組DNA構(gòu)建200 bp的文庫，在Illumina Hiseq 2500測序平臺測序得到13.70 Gb原始數(shù)據(jù)，總測序深度約為45.01X，測序質(zhì)量值在20以上的堿基比例在93.25%以上，測序質(zhì)量值在30以上的堿基比例在88.32%以上。

2.2 基因組大小、重復(fù)序列比例和雜合率評估

利用200 bp文庫數(shù)據(jù)構(gòu)建Kmer長度為17的Kmer分布圖（圖1），進(jìn)行基因組大小、重復(fù)序列比率和雜合率的評估。由圖1可知，平均Kmer深度即主峰對應(yīng)的Kmer深度為37.56X。Kmer深度出現(xiàn)在主峰對應(yīng)深度2倍以上的序列為重復(fù)序列，即深度大于75.12X（主峰右側(cè)的小峰）的Kmer序列為重復(fù)序列。Kmer深度出現(xiàn)在主峰對應(yīng)深度18.78X處（主峰左側(cè)的小峰）的序列即為雜合序列。

根據(jù)Kmer深度信息，總Kmer數(shù)目/平均Kmer深度即為基因組大小，估計基因組大小約304.38 Mb。依據(jù)Kmer分布情況，估計重復(fù)序列含量約45.82%，沒有明顯雜合峰，評估出的雜合率約為0.58%，物種雜合率較低。因此該物種不屬于高雜合、高重復(fù)、大基因組等基因組結(jié)構(gòu)特征復(fù)雜的物種。

圖1 Kmer的分布

2.3 評估GC含量

基因組GC含量對基因組測序的隨機(jī)性有較大影響。過高GC含量（＞65%），過低GC含量（＜25%）會導(dǎo)致測序偏向性，嚴(yán)重影響基因組組裝效果。物種GC含量是評估后續(xù)基因組組裝難度重要指標(biāo)之一。通過對調(diào)研圖文庫測序數(shù)據(jù)分析，該物種基因組的GC含量約37.99%。

3 討論

楊梅全基因組大小約304.38 Mb，與其他已完成全基因組測序的果樹相比，比蘋果（基因組大小742 Mb）［9］、梨（基因組大小527 Mb）［10］、獼猴桃（基因組大小616.1 Mb）［5］、香蕉（基因組大小523 Mb）［11］、葡萄（基因組大小490 Mb）［12］、楊樹（基因組大小480 Mb）都小的多，但是與番木瓜（基因組大小370 Mb）［13］、桃樹（基因組大小265 Mb）［14］、甜橙（基因組大小367 Mb）［15］較接近。與其他已完成全基因組測序的作物和蔬菜相比，比大麥（全基因組大小5.1 Gb）、小麥（全基因組大小17 Gb）、大豆（全基因組大小1.1 Gb）、玉米（全基因組大小2.3 Gb）、馬鈴薯（全基因組大小844 Mb）、棉花（全基因組大小775 Mb）、高粱（全基因組大小730 Mb）、水稻（全基因組大小466 Mb）、番茄（全基因組大小760 Mb）、白菜（全基因組大小485 Mb）和西瓜（全基因組大小425 Mb）等小很多，與甜瓜（全基因組大小375 Mb）和黃瓜（全基因組大小350 Mb）等接近，但是比擬南芥（全基因組大小125 Mb）要大得多。

楊梅的基因重復(fù)序列（重復(fù)序列45.82%）與葡萄（重復(fù)序列41%）、番木瓜（重復(fù)序列43%）和香蕉（重復(fù)序列44%）相近，在41%～46%，比蘋果（重復(fù)序列67%）和梨（重復(fù)序列53.1%）低，比草莓（重復(fù)序列23%）、甜橙（重復(fù)序列20%）和桃（重復(fù)序列37.14%）要高［8］，這說明楊梅的基因組屬于中等復(fù)雜程度。

如何破解并利用全基因組測序得到的大量數(shù)據(jù)是研究者面臨的巨大挑戰(zhàn)。目前基于全基因組測序挖掘了很多與糖、揮發(fā)性物質(zhì)等相關(guān)的基因，并在開發(fā)SNP芯片、構(gòu)建高精度圖譜及QTL定位等方面都取得了重要進(jìn)展［8］。以后的科學(xué)研究重點(diǎn)將從表現(xiàn)型依賴型研究轉(zhuǎn)入基因型依賴型研究，從對單一基因的研究轉(zhuǎn)入對整個基因組的研究［8］。本文研究成果對于揭示楊梅生長特性的遺傳基礎(chǔ)提供重要的科學(xué)價值。

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（責(zé)任編輯：張 韻）

S 667.6

：A

：0528-9017（2015）10-1564-03

文獻(xiàn)著錄格式：戚行江，任海英，梁森苗，等.楊梅全基因組測序結(jié)果初報［J］.浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，56（10）：1564-1566.

10.16178/j.issn.0528-9017.20151011

2015-08-24

國家公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項經(jīng)費(fèi)（201203089）；浙江省果品農(nóng)業(yè)新品種選育重大科技專項（2012C12904-3）；浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院楊梅工程中心基金

戚行江（1963-），浙江諸暨人，研究員，碩士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)楣麡鋵W(xué)。E-mail：qixj@mail.zaas.ac.cn。