郭麗，張海軍，2，*，王明澤，車野，劉德泉，陳井生，劉德福，于吉東，吳耀坤

(1.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院大慶分院，黑龍江大慶163316; 2.吉林省種子管理總站，長春130062; 3.吉林大學(xué)植物科學(xué)學(xué)院，長春130062)

大麻雄性基因連鎖AFLP分子標(biāo)記的篩選及鑒定

郭麗1，張海軍1，2，3*，王明澤1，車野1，劉德泉3，陳井生1，劉德福1，于吉東1，吳耀坤1

(1.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院大慶分院，黑龍江大慶163316; 2.吉林省種子管理總站，長春130062; 3.吉林大學(xué)植物科學(xué)學(xué)院，長春130062)

為建立一種大麻早期性別篩選及鑒定方法，利用AFLP標(biāo)記技術(shù)，篩選了64對(duì)EcoRI-NNN/MseI-NNN引物組合，對(duì)11個(gè)不同大麻品種雌、雄植株的混合DNA池進(jìn)行了性別連鎖特異性條帶的篩選。結(jié)果表明，6對(duì)引物組合表現(xiàn)出多態(tài)性，其中，EcoRI-ACA/MseICTG在雄性DNA池中擴(kuò)增出1條特異條帶，經(jīng)各品種單株DNA驗(yàn)證，該條帶只在雄性單株穩(wěn)定出現(xiàn)，回收、克隆、測(cè)序后獲得1條可用于大麻早期田間性別鑒定的734bp雄性特異條帶。

大麻;雄性;AFLP;分子標(biāo)記

大麻(Cannabis sativaL.)是古老工藝加工型纖維作物，雌雄同株新品種選育是當(dāng)前研究熱點(diǎn)［1］。大麻的性別分化受遺傳物質(zhì)控制和環(huán)境因素雙重調(diào)控，即使培育出了雌雄同株大麻品種，性別也不穩(wěn)定，因此，亟待對(duì)大麻性別分化及分子遺傳機(jī)理進(jìn)行深入研究［2］。國內(nèi)外的研究學(xué)者已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了10多個(gè)雄性特異條帶［3-10］和3個(gè)雌性特異條帶［7］，并開發(fā)了若干個(gè)穩(wěn)定的SCAR標(biāo)記［4，6，9］。利用AFLP技術(shù)進(jìn)行大麻品種鑒定及遺傳多樣性分析是可行的，其中，AFLP標(biāo)記已經(jīng)開始應(yīng)用于大麻的司法鑒定檢測(cè)工作［11-13］。本研究利用AFLP標(biāo)記技術(shù)探究大麻性別連鎖特異標(biāo)記，旨在提高大麻的雌雄同株率。

1 材料與方法

1.1 供試植物材料

選用11個(gè)大麻品種:尤紗31、晉麻1號(hào)、云麻1～4號(hào)、皖大麻1～2號(hào)、慶麻001、慶麻003、肇州大麻。試驗(yàn)材料2013年種植于大慶大麻試驗(yàn)站紅旗泡試驗(yàn)基地，隨機(jī)區(qū)組試驗(yàn)設(shè)計(jì)，3次重復(fù)。

1.2 供試試劑及儀器

限制性內(nèi)切酶、T4連接酶、Taq酶、接頭和引物等購自或合成于北京鼎國公司。MseI接頭: 5'-GACGATGAGTCCTGAG-3'，3'-TACTCAGGACTCAT-5';EcoRI接頭:5'-CTCGTAGACTGCGTACC-3'，3'-CATCTGACGCATGGTTAA-5'。MseI預(yù)擴(kuò)引物:5'-GATGAGTCCTGAGTAA-3';EcoRI預(yù)擴(kuò)引物:5'-GACTGCGTACCAATTC-3'。選擇性擴(kuò)增引物:EcoRI-AAC、EcoRIAAG、EcoRI-ACA、EcoRI-ACT、EcoRI-ACC、EcoRI-ACG、EcoRI-AGC和EcoRI-AGG; MseI-CAA、MseI-CAC、MseI-CAG、MseI-CAT、MseI-CTA、MseI-CTC、MseI-CTG和MseI-CTT。FA-2004A型分析天平、低溫高速離心機(jī)、恒溫水浴鍋、核酸蛋白定量儀、電泳儀、PCR擴(kuò)增儀、連接儀、垂直板電泳系統(tǒng)及凝膠成像系統(tǒng)等。

1.3 基因組DNA提取及DNA池的構(gòu)建

待肉眼鑒定雌、雄植株后，雌雄株各隨機(jī)選取5株，每株取幼嫩葉片約500mg置于1.5 mL離心管，構(gòu)成混合DNA池，液氮速凍后置于-20℃保存?zhèn)溆??；蚪MDNA提取參照顧紅雅等［14］的SDS法，加以改良，在SDS裂解液中加入β-巰基乙醇(8μL/mL)和3%聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。試驗(yàn)均采取3次生物學(xué)重復(fù)，提取的DNA置于TE緩沖液中，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后-20℃保存。

1.4 AFLP分析

參照Vos等［15］的方法，略作調(diào)整。分步法酶切體系:100ngDNA 5.0μL、10×TangoTm Buffer 4μL、100U/μL EcoRI 0.5μL，100U/μL MseI 0.5μL，ddH2O補(bǔ)齊20μL。37℃3h，65℃0.5h，80℃20min，冷凍2min，-20℃保存，取5.0μL檢測(cè)。連接體系:酶切產(chǎn)物20μL、MseI接頭2.0μL、EcoRI接頭2.0μL、T4連接酶1.0μL、10×T4連接酶Buffer 4.0μL，ddH2O補(bǔ)齊40μL。恒溫16℃置于連接儀中過夜。預(yù)擴(kuò)增體系:連接產(chǎn)物稀釋10倍(5μL)、10×PCR緩沖液2.0μL、MseI引物1.0μL、EcoRI引物1.0μL、Taq酶0.25μL，ddH2O補(bǔ)齊20μL;PCR程序: 94℃2min，94℃20s，56℃30s，20個(gè)循環(huán)后60℃30min。選擇性擴(kuò)增體系:預(yù)擴(kuò)產(chǎn)物稀釋50倍(5.0μL)、10×PCR緩沖液2.0μL、dNTP 1.6μL、Taq酶0.25μL、MseI、EcoRI選擴(kuò)引物各0.5μL，ddH2O補(bǔ)齊20μL。選擇性擴(kuò)增用梯度PCR，條件:94℃2min;94℃30s，65℃1min，72℃1min，12個(gè)循環(huán)，每循環(huán)降0.7℃;94℃30s，56℃1min，72℃1min，23個(gè)循環(huán)，4℃保存。

1.5 AFLP擴(kuò)增產(chǎn)物的聚丙烯酰胺凝膠電泳及銀染

聚丙烯酰胺凝膠電泳及銀染參照王英［16］的方法。選擇性擴(kuò)增產(chǎn)物在6%的變性聚丙烯酰胺凝膠(丙烯酰胺28.5g，N-N-亞甲基雙丙烯酰胺1.5g，10×TBE 25mL，尿素210.2g，終體積500mL)中電泳分離，電泳緩沖液1×TBE，60W預(yù)電泳30min后，擴(kuò)增產(chǎn)物加入等將擴(kuò)增產(chǎn)物加入等體積的上樣緩沖液(98%甲酰胺，10mmoL/L EDTA，0.25%溴酚藍(lán))，95℃變性5min后，立即轉(zhuǎn)移至冰浴中冷卻，每個(gè)樣品取8μL上樣，60W電泳2.5h。電泳結(jié)束后分開平板和凹板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增產(chǎn)物銀染，自然干燥保存。

1.6 特異片段的回收、克隆及測(cè)序

用Omega公司回收試劑盒切膠回收特異條帶，以回收產(chǎn)物為模板，MseI-NNN/EcoRINNN為引物進(jìn)行PCR再擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。將擴(kuò)增片段與特異條帶大小一致片段與pMD18-T載體連接，16℃連接儀中反應(yīng)過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌，將提取的重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定，37℃下酶切反應(yīng)4.0h，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)是否含目的片段。將PCR鑒定呈陽性的單克隆質(zhì)粒測(cè)序，NCBI比對(duì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取的大麻基因組DNA瓊脂糖電泳結(jié)果

經(jīng)紫外分光光度計(jì)測(cè)定，提取基因組DNA的A260/A280值在1.643～1.975之間，都比較接近于1.8，說明DNA樣品純度較好，酚類、多糖、蛋白質(zhì)及色素等雜質(zhì)去除較干凈，適宜AFLP后續(xù)操作。2.2引物的篩選結(jié)果

64對(duì)選擇性引物對(duì)11個(gè)大麻品種雌、雄植株混合DNA池進(jìn)行性別連鎖特異性條帶篩選，部分聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果如圖2，其中多態(tài)性組合6對(duì):MseI-ACG/EcoRI-CTT、MseIAGC/EcoRI-CAC、MseI-ACA/EcoRI-CTG、MseI-ACC/EcoRI-CTG、MseI-ACT/EcoRI -CTA、MseI-AGC/EcoRI-CTA。雌雄單株DNA PCR驗(yàn)證結(jié)果表明，MseI-ACA/EcoRICTG組合雄性連鎖，初步鑒定為雄性基因連鎖AFLP標(biāo)記。

圖1 部分引物組合在雌、雄性DNA池中的擴(kuò)增結(jié)果Fig.1PAGE electrophoresis of some pairs of AFLP markers in male and female DNA pools

圖2 引物組合MseI-ACA/EcoRI-CTG在11個(gè)大麻品種中的聚丙烯酰胺凝膠電泳擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 PAGE electrophoresis of MseI-ACA/EcoRI-CTG amplification in eleven individuals of Cannabis sativa L.

2.3 特異條帶的回收、克隆及測(cè)序結(jié)果

回收引物組合MseI-ACA/EcoRI-CTG的特異條帶，PCR擴(kuò)增后瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，獲得1條雄性特異條帶(如圖3)，與pMD18-T載體連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌，提取重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定，陽性克隆里含有目的片段。測(cè)序結(jié)果表明，所獲得的大麻雄性連鎖AFLP片段大小為734bp。

圖3 特異條帶再擴(kuò)增的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果Fig.3 Agarose gel electrophoresis of reamplification product of male-linked AFLP marker

3 結(jié)論

本研究利用AFLP分子標(biāo)記技術(shù)，篩選出6對(duì)多態(tài)性引物，EcoRI-ACA/MseI-CTG在雄性DNA池中擴(kuò)增出1條734bp雄性特異條帶，經(jīng)各品種雌、雄單株驗(yàn)證，該條帶只可在雄性單株中穩(wěn)定出現(xiàn)，該標(biāo)記可用于大麻早期田間性別鑒定。

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Screening and Identification of AFLP Markers Linked to Male Gene in Cannabis sativa L.

GUO Li1，ZHANG Hai-jun1，2，3*，WANG Ming-ze1，CHE Ye1，LIU De-quan3，CHEN Jing-sheng1，LIU De-fu1，YU Ji-dong1，WU Yao-kun1
(1.Daqing Branches of Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences，Daqing 163316，China; 2.Seed Management Station of Jilin Province，Changchun 130062，China; 3.College of Plant Science，Jilin University，Changchun 130062，China)

64 pairs of AFLP primer combinations of 8 pairs of EcoRI-NNN and MseI-NNN primers were used to find the polymorphisms between mixed DNA pools ofCannabis sativaL.varieties.Six pairs of sixty-four primer combinations showed polymorphism between male and female DNA pools.700bp specific fragments were amplified in the primer combination of EcoRI-ACA and MseI-CTG in male DNA pool.This marker was testified with individual DNA of 11 varieties，and the fragment could only be amplified in male plants.The male-specific fragment of 734bp was recovered，cloned and sequenced.

Cannabis sativaL.;male;AFLP(Amplified fragment length polymorphism);molecular marker

S563.3

A

1671-3532(2015)01-0005-04

2014-09-05

國家麻類產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項(xiàng)目(CARS-19-S04);黑龍江省農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新工程重點(diǎn)(青年基金項(xiàng)目)(2012QN002)

郭麗(1981-)，女，助理研究員，從事亞麻、大麻等經(jīng)濟(jì)作物新品種選育工作。E-mail:guoli1981W@sina.com。

*通訊作者:張海軍(1986-)，男，農(nóng)藝師，從事新品種選育和技術(shù)推廣工作。E-mail:zhanghaijun.234@163.com。