郭麗，張海軍，2，*，王明澤，車野，劉德泉，陳井生，劉德福，于吉東，吳耀坤

(1.黑龍江省農業(yè)科學院大慶分院，黑龍江大慶163316; 2.吉林省種子管理總站，長春130062; 3.吉林大學植物科學學院，長春130062)

大麻雄性基因連鎖AFLP分子標記的篩選及鑒定

郭麗1，張海軍1，2，3*，王明澤1，車野1，劉德泉3，陳井生1，劉德福1，于吉東1，吳耀坤1

(1.黑龍江省農業(yè)科學院大慶分院，黑龍江大慶163316; 2.吉林省種子管理總站，長春130062; 3.吉林大學植物科學學院，長春130062)

為建立一種大麻早期性別篩選及鑒定方法，利用AFLP標記技術，篩選了64對EcoRI-NNN/MseI-NNN引物組合，對11個不同大麻品種雌、雄植株的混合DNA池進行了性別連鎖特異性條帶的篩選。結果表明，6對引物組合表現(xiàn)出多態(tài)性，其中，EcoRI-ACA/MseICTG在雄性DNA池中擴增出1條特異條帶，經(jīng)各品種單株DNA驗證，該條帶只在雄性單株穩(wěn)定出現(xiàn)，回收、克隆、測序后獲得1條可用于大麻早期田間性別鑒定的734bp雄性特異條帶。

大麻;雄性;AFLP;分子標記

大麻(Cannabis sativaL.)是古老工藝加工型纖維作物，雌雄同株新品種選育是當前研究熱點［1］。大麻的性別分化受遺傳物質控制和環(huán)境因素雙重調控，即使培育出了雌雄同株大麻品種，性別也不穩(wěn)定，因此，亟待對大麻性別分化及分子遺傳機理進行深入研究［2］。國內外的研究學者已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了10多個雄性特異條帶［3-10］和3個雌性特異條帶［7］，并開發(fā)了若干個穩(wěn)定的SCAR標記［4，6，9］。利用AFLP技術進行大麻品種鑒定及遺傳多樣性分析是可行的，其中，AFLP標記已經(jīng)開始應用于大麻的司法鑒定檢測工作［11-13］。本研究利用AFLP標記技術探究大麻性別連鎖特異標記，旨在提高大麻的雌雄同株率。

1 材料與方法

1.1 供試植物材料

選用11個大麻品種:尤紗31、晉麻1號、云麻1～4號、皖大麻1～2號、慶麻001、慶麻003、肇州大麻。試驗材料2013年種植于大慶大麻試驗站紅旗泡試驗基地，隨機區(qū)組試驗設計，3次重復。

1.2 供試試劑及儀器

限制性內切酶、T4連接酶、Taq酶、接頭和引物等購自或合成于北京鼎國公司。MseI接頭: 5'-GACGATGAGTCCTGAG-3'，3'-TACTCAGGACTCAT-5';EcoRI接頭:5'-CTCGTAGACTGCGTACC-3'，3'-CATCTGACGCATGGTTAA-5'。MseI預擴引物:5'-GATGAGTCCTGAGTAA-3';EcoRI預擴引物:5'-GACTGCGTACCAATTC-3'。選擇性擴增引物:EcoRI-AAC、EcoRIAAG、EcoRI-ACA、EcoRI-ACT、EcoRI-ACC、EcoRI-ACG、EcoRI-AGC和EcoRI-AGG; MseI-CAA、MseI-CAC、MseI-CAG、MseI-CAT、MseI-CTA、MseI-CTC、MseI-CTG和MseI-CTT。FA-2004A型分析天平、低溫高速離心機、恒溫水浴鍋、核酸蛋白定量儀、電泳儀、PCR擴增儀、連接儀、垂直板電泳系統(tǒng)及凝膠成像系統(tǒng)等。

1.3 基因組DNA提取及DNA池的構建

待肉眼鑒定雌、雄植株后，雌雄株各隨機選取5株，每株取幼嫩葉片約500mg置于1.5 mL離心管，構成混合DNA池，液氮速凍后置于-20℃保存?zhèn)溆?。基因組DNA提取參照顧紅雅等［14］的SDS法，加以改良，在SDS裂解液中加入β-巰基乙醇(8μL/mL)和3%聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。試驗均采取3次生物學重復，提取的DNA置于TE緩沖液中，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后-20℃保存。

1.4 AFLP分析

參照Vos等［15］的方法，略作調整。分步法酶切體系:100ngDNA 5.0μL、10×TangoTm Buffer 4μL、100U/μL EcoRI 0.5μL，100U/μL MseI 0.5μL，ddH2O補齊20μL。37℃3h，65℃0.5h，80℃20min，冷凍2min，-20℃保存，取5.0μL檢測。連接體系:酶切產(chǎn)物20μL、MseI接頭2.0μL、EcoRI接頭2.0μL、T4連接酶1.0μL、10×T4連接酶Buffer 4.0μL，ddH2O補齊40μL。恒溫16℃置于連接儀中過夜。預擴增體系:連接產(chǎn)物稀釋10倍(5μL)、10×PCR緩沖液2.0μL、MseI引物1.0μL、EcoRI引物1.0μL、Taq酶0.25μL，ddH2O補齊20μL;PCR程序: 94℃2min，94℃20s，56℃30s，20個循環(huán)后60℃30min。選擇性擴增體系:預擴產(chǎn)物稀釋50倍(5.0μL)、10×PCR緩沖液2.0μL、dNTP 1.6μL、Taq酶0.25μL、MseI、EcoRI選擴引物各0.5μL，ddH2O補齊20μL。選擇性擴增用梯度PCR，條件:94℃2min;94℃30s，65℃1min，72℃1min，12個循環(huán)，每循環(huán)降0.7℃;94℃30s，56℃1min，72℃1min，23個循環(huán)，4℃保存。

1.5 AFLP擴增產(chǎn)物的聚丙烯酰胺凝膠電泳及銀染

聚丙烯酰胺凝膠電泳及銀染參照王英［16］的方法。選擇性擴增產(chǎn)物在6%的變性聚丙烯酰胺凝膠(丙烯酰胺28.5g，N-N-亞甲基雙丙烯酰胺1.5g，10×TBE 25mL，尿素210.2g，終體積500mL)中電泳分離，電泳緩沖液1×TBE，60W預電泳30min后，擴增產(chǎn)物加入等將擴增產(chǎn)物加入等體積的上樣緩沖液(98%甲酰胺，10mmoL/L EDTA，0.25%溴酚藍)，95℃變性5min后，立即轉移至冰浴中冷卻，每個樣品取8μL上樣，60W電泳2.5h。電泳結束后分開平板和凹板，進行PCR擴增產(chǎn)物銀染，自然干燥保存。

1.6 特異片段的回收、克隆及測序

用Omega公司回收試劑盒切膠回收特異條帶，以回收產(chǎn)物為模板，MseI-NNN/EcoRINNN為引物進行PCR再擴增，瓊脂糖凝膠電泳檢測。將擴增片段與特異條帶大小一致片段與pMD18-T載體連接，16℃連接儀中反應過夜，連接產(chǎn)物轉化大腸桿菌，將提取的重組質粒進行雙酶切鑒定，37℃下酶切反應4.0h，瓊脂糖凝膠電泳檢測是否含目的片段。將PCR鑒定呈陽性的單克隆質粒測序，NCBI比對。

2 結果與分析

2.1 提取的大麻基因組DNA瓊脂糖電泳結果

經(jīng)紫外分光光度計測定，提取基因組DNA的A260/A280值在1.643～1.975之間，都比較接近于1.8，說明DNA樣品純度較好，酚類、多糖、蛋白質及色素等雜質去除較干凈，適宜AFLP后續(xù)操作。2.2引物的篩選結果

64對選擇性引物對11個大麻品種雌、雄植株混合DNA池進行性別連鎖特異性條帶篩選，部分聚丙烯酰胺凝膠電泳結果如圖2，其中多態(tài)性組合6對:MseI-ACG/EcoRI-CTT、MseIAGC/EcoRI-CAC、MseI-ACA/EcoRI-CTG、MseI-ACC/EcoRI-CTG、MseI-ACT/EcoRI -CTA、MseI-AGC/EcoRI-CTA。雌雄單株DNA PCR驗證結果表明，MseI-ACA/EcoRICTG組合雄性連鎖，初步鑒定為雄性基因連鎖AFLP標記。

圖1 部分引物組合在雌、雄性DNA池中的擴增結果Fig.1PAGE electrophoresis of some pairs of AFLP markers in male and female DNA pools

圖2 引物組合MseI-ACA/EcoRI-CTG在11個大麻品種中的聚丙烯酰胺凝膠電泳擴增結果Fig.2 PAGE electrophoresis of MseI-ACA/EcoRI-CTG amplification in eleven individuals of Cannabis sativa L.

2.3 特異條帶的回收、克隆及測序結果

回收引物組合MseI-ACA/EcoRI-CTG的特異條帶，PCR擴增后瓊脂糖凝膠電泳檢測，獲得1條雄性特異條帶(如圖3)，與pMD18-T載體連接，將連接產(chǎn)物轉化大腸桿菌，提取重組質粒進行雙酶切鑒定，陽性克隆里含有目的片段。測序結果表明，所獲得的大麻雄性連鎖AFLP片段大小為734bp。

圖3 特異條帶再擴增的瓊脂糖凝膠電泳結果Fig.3 Agarose gel electrophoresis of reamplification product of male-linked AFLP marker

3 結論

本研究利用AFLP分子標記技術，篩選出6對多態(tài)性引物，EcoRI-ACA/MseI-CTG在雄性DNA池中擴增出1條734bp雄性特異條帶，經(jīng)各品種雌、雄單株驗證，該條帶只可在雄性單株中穩(wěn)定出現(xiàn)，該標記可用于大麻早期田間性別鑒定。

［1］陳美霞，祁建民，劉偉，等.麻類作物分子育種的研究現(xiàn)狀與展望［J］.福建農業(yè)學報，2002，27(7):780-786.

［2］Welsh J，McClelland M.Finger printing genomes using PCR with arbitrary primers［J］.Nucleic Acids Res，1990，18，7213 -7218.

［3］Sakamoto K，Shimomura K，Komeda Y，et al.A male-associated DNA sequence in a dioecious plantCannabis sativaL.［J］.Plant Cell Physiol，1995，36(8):1549-1554.

［4］Mandolino G，Carboni A，F(xiàn)orapani S，et al.Identification of DNA markers linked to the male sex in dioecious hemp(Cannabis sativaL.)［J］.Theor Appl Genet，1999，98(1):86-92.

［5］Mandolino G，Carboni A，Bagatta M，et al.Occurrence and frequency of putatively Y chromosome linked DNA markers inCannabis satlivaL.［J］.Euphytica，2002，126(2):211-218.

［6］陳其軍，韓玉珍，傅永福，等.大麻性別的RAPD和SCAR分子標記［J］.植物生理學報，2001，27(2):173-178.

［7］Flachowsky H，Schumann E，Weber W E，et al.Application of AFLP for the detection of sex-specific markers in hemp［J］.Plant Breed，2001，120(4):305-309.

［8］Peil A，F(xiàn)lachowsky H，Schumann E，et al.Sex-linked AFLP markers indicate a pseudoautosomal region in hemp(Cannabis sativaL.)［J］.Theor Appl Genet，2003，107(1):102-109.

［9］Moliterni V M C，Cattivelli L，Ranalli P，et al.The sexual differentiation ofCannabis sativaL.:A morphological and molecular study［J］.Euphytica，2004，140(1-2):95-106.

［10］呂佳淑，趙立寧，臧鞏固，等.大麻性別相關AFLP分子標記篩選［J］.湖南農業(yè)大學學報(自然科學版)，2010，36 (2):123-127.

［11］Shannon L，George D W.Genetic variation in hemp and marijuana(Cannabis sativaL.)according to amplified fragment length polymorphiams［J］.Journal of Forensic Sciences，2006，51(2):371-375.

［12］路帆，程寶文，李虹，等.AFLP技術鑒別罌粟、虞美人和大麻種屬差異的初步研究［J］.中國法醫(yī)學雜志，2008，23(3):157-160.

［13］郭佳，裴黎，彭建雄，等.利用AFLP檢測大麻遺傳多樣性［J］.中國法醫(yī)學，2008，24(5):330-332.

［14］顧紅雅，瞿禮嘉，明小天，等.植物基因與分子操作［M］.北京:北京大學出版社，1995，19.

［15］Vos P.，Hogers R.，Bleeker M.，et al.AFLP:a new technique for DNA fingerprinting［J］.Nucleic Acids Res，1995，23: 4407-4414.

［16］王英.大豆生育期結構性狀的遺傳分析及相關基因的分子標記［D］.北京:中國農業(yè)科學院，2008.

Screening and Identification of AFLP Markers Linked to Male Gene in Cannabis sativa L.

GUO Li1，ZHANG Hai-jun1，2，3*，WANG Ming-ze1，CHE Ye1，LIU De-quan3，CHEN Jing-sheng1，LIU De-fu1，YU Ji-dong1，WU Yao-kun1
(1.Daqing Branches of Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences，Daqing 163316，China; 2.Seed Management Station of Jilin Province，Changchun 130062，China; 3.College of Plant Science，Jilin University，Changchun 130062，China)

64 pairs of AFLP primer combinations of 8 pairs of EcoRI-NNN and MseI-NNN primers were used to find the polymorphisms between mixed DNA pools ofCannabis sativaL.varieties.Six pairs of sixty-four primer combinations showed polymorphism between male and female DNA pools.700bp specific fragments were amplified in the primer combination of EcoRI-ACA and MseI-CTG in male DNA pool.This marker was testified with individual DNA of 11 varieties，and the fragment could only be amplified in male plants.The male-specific fragment of 734bp was recovered，cloned and sequenced.

Cannabis sativaL.;male;AFLP(Amplified fragment length polymorphism);molecular marker

S563.3

A

1671-3532(2015)01-0005-04

2014-09-05

國家麻類產(chǎn)業(yè)技術體系項目(CARS-19-S04);黑龍江省農業(yè)科技創(chuàng)新工程重點(青年基金項目)(2012QN002)

郭麗(1981-)，女，助理研究員，從事亞麻、大麻等經(jīng)濟作物新品種選育工作。E-mail:guoli1981W@sina.com。

*通訊作者:張海軍(1986-)，男，農藝師，從事新品種選育和技術推廣工作。E-mail:zhanghaijun.234@163.com。