魏琦琦,馮延芝 ,林 青,賈寶光 ,張 琳
(1.中南林業(yè)科技大學(xué)a.經(jīng)濟(jì)林育種與栽培國(guó)家林業(yè)局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;b.經(jīng)濟(jì)林培育與保護(hù)省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;c.經(jīng)濟(jì)林培育與利用湖南省2011協(xié)同創(chuàng)新中心,湖南 長(zhǎng)沙 410004;2.中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院 經(jīng)濟(jì)林研究開發(fā)中心,河南 鄭州 450003)
適于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的棗不同器官總RNA提取方法篩選
魏琦琦1a-c,馮延芝2,林 青1a-c,賈寶光1a-c,張 琳1a-c
(1.中南林業(yè)科技大學(xué)a.經(jīng)濟(jì)林育種與栽培國(guó)家林業(yè)局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;b.經(jīng)濟(jì)林培育與保護(hù)省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;c.經(jīng)濟(jì)林培育與利用湖南省2011協(xié)同創(chuàng)新中心,湖南 長(zhǎng)沙 410004;2.中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院 經(jīng)濟(jì)林研究開發(fā)中心,河南 鄭州 450003)
為獲得適用于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的棗花、結(jié)果枝和果實(shí)的總RNA提取方法,以中秋酥脆棗為材料,比較分析了Ambiogen和Autolab 2種總RNA提取試劑盒和基于Autolab試劑盒改良的CTAB法的總RNA的提取效果。結(jié)果表明:3種方法提取RNA的OD260/OD280差別不大,但用2種試劑盒提取的RNA有降解,其中Ambiogen試劑盒提取的花、結(jié)果枝和果實(shí)3個(gè)器官的RNA質(zhì)量濃度分別為126、284和222 ng/μL;Autolab試劑盒提取的RNA質(zhì)量濃度分別為307、402和266 ng/μL;基于Autolab試劑盒改良的CTAB法提取的RNA質(zhì)量濃度分別為401、417和296 ng/μL。與2種試劑盒相比,基于Autolab試劑盒改良的CTAB法提取出來(lái)的RNA完整性好、純度和濃度高,能夠滿足轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的要求。
中秋酥脆棗;轉(zhuǎn)錄組測(cè)序;RNA提?。籖NA完整性
轉(zhuǎn)錄組測(cè)序是近年興起的一種高通量測(cè)序技術(shù),其測(cè)序?qū)ο鬄樘囟?xì)胞在某一功能狀態(tài)下所能轉(zhuǎn)錄出來(lái)的所有RNA的總和,主要包括mRNA和非編碼RNA。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)(RNA-seq)具有成本低、定量準(zhǔn)確、可重復(fù)性高、檢測(cè)范圍廣和不受遺傳背景限制等優(yōu)點(diǎn),這在轉(zhuǎn)錄組學(xué)的應(yīng)用上具有革命性意義[1-3]。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序在cDNA文庫(kù)構(gòu)建時(shí)對(duì)RNA的濃度、純度和完整性等均有較高的要求[4]。
棗Ziziphus jujuba為鼠李科Rhamnaceae棗屬Ziziphus落葉灌木,是原產(chǎn)于我國(guó)的重要經(jīng)濟(jì)樹種和木本糧食作物[5]。棗樹栽培歷史悠久,具有重要的生態(tài)和經(jīng)濟(jì)價(jià)值,是當(dāng)前我國(guó)果樹和生態(tài)經(jīng)濟(jì)林產(chǎn)業(yè)重點(diǎn)發(fā)展的樹種之一[6-7]。近年來(lái),有關(guān)棗樹的研究多集中在棗的光合特性、果實(shí)性狀評(píng)價(jià)以及高效栽培技術(shù)等方面[8-12],關(guān)于其分子生物學(xué)方面的研究報(bào)道較少。
有關(guān)植物總RNA提取方法的報(bào)道較多,但不同物種或同一物種的不同品種,甚至同一品種的不同器官(組織)組成成分差別較大,同一方法未必具有通用性,因此需要根據(jù)具體的品種或器官(組織)探索適宜的RNA提取方法[13-15]。棗不同器官(組織)中組分不同,如棗花和棗果實(shí)中含有大量的多酚、多糖和醌類等次生代謝物質(zhì),并且富含RNase,RNA極易被分離降解,給棗RNA的分離純化帶來(lái)許多困難[16]。目前已有一些棗RNA提取方法的研究報(bào)道[17-19],但針對(duì)適用于棗不同器官轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的RNA提取方法尚未見報(bào)道?;诖耍狙芯恐惺褂昧?種方法對(duì)棗花、結(jié)果枝和果實(shí)進(jìn)行總RNA提取,比較了RNA的質(zhì)量,為用于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的棗不同器官總RNA提取方法的建立提供了科學(xué)依據(jù)。
試驗(yàn)品種為5年生的中秋酥脆棗,栽植于湖南衡陽(yáng)中南林業(yè)科技大學(xué)棗試驗(yàn)基地,分別采集棗花、結(jié)果枝和果實(shí),取樣品后迅速裝入滅菌的RNase-free離心管中,置于液氮中保存。
選取Ambiogen試劑盒法(方法1)、Autolab試劑盒法(方法2)、基于Autolab試劑盒改良的CTAB法(方法3)3種方法分別對(duì)棗花、結(jié)果枝和果實(shí)進(jìn)行總RNA的提取。方法1與方法2嚴(yán)格按該試劑盒操作說(shuō)明提取即可。方法3在使用該試劑盒的基礎(chǔ)上,進(jìn)行如下處理:(1)研磨好的樣品首先加入65 ℃預(yù)熱好的CTAB裂解緩沖液,在65 ℃水浴中溫浴10 min,在此期間渦旋振蕩5次;(2)加入 200 μL 的 KAc(5 mol/L)、600 μL 的氯仿/異戊醇(24∶1),渦旋振蕩5 min,然后冰浴10 min;(3)使用標(biāo)準(zhǔn)離心機(jī)13 000~14 000 r/min離心2 min,取450 μL上清液置于新的離心管中,加入450 μL該試劑盒中的RLT溶液,再次以同樣轉(zhuǎn)速離心2 min,以后步驟按試劑盒說(shuō)明操作即可。
用1%瓊脂糖凝膠電泳初步檢測(cè)RNA的質(zhì)量,然后用Agilent 2100檢測(cè)RNA的完整性、純度和濃度。
用NEBNext Poly(A) mRNA Magnetic Isolation Module(NEB, E7490) 富 集 mRNA。 以 mRNA為模板,用NEBNext mRNA Library Prep Master Mix Set for Illumina(NEB, E6110) 和 NEBNext Multiplex Oligos for Illumina(NEB, E7500) 構(gòu)建上機(jī)文庫(kù)。制備好的文庫(kù)用1.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)文庫(kù)插入片段的大小,然后用Library Quantification Kit-Illumina GA Universal(Kapa,KK4824)進(jìn)行QPCR定量。檢測(cè)合格的文庫(kù)在Illumina cbot上進(jìn)行簇的生成,最后用Illumina HiSeqTM 2000進(jìn)行測(cè)序。
轉(zhuǎn)錄組測(cè)序?qū)颖綬NA質(zhì)量有較高要求,一般要求RNA總量≥20 ng,質(zhì)量濃度≥400 ng/μL,OD260/OD280為 1.8 ~ 2.2,OD260/OD230> 1.8,RNA完整性值≥8,28S/18S>1.0。本試驗(yàn)中分別用3種方法提取棗花、結(jié)果枝和果實(shí)的總RNA,用1%瓊脂糖凝膠電泳初步檢測(cè)后,通過(guò)Agilent 2100進(jìn)行總RNA質(zhì)量分析,包括RNA完整性、濃度和純度等。
使用方法1提取棗花、結(jié)果枝和棗果實(shí)的RNA的完整性值分別為5.1、5.2和2.4;方法2提取的RNA的完整性值分別為7.1、6.3和5.9;通過(guò)方法3獲得RNA的完整性值分別為8.3、9.5和8.6,使用方法1提取的棗的3個(gè)器官RNA的28S/18S分別為0.0、2.7和0.1;方法2提取RNA的28S/18S分別為1.9、2.3和0.0;而方法3提取RNA的28S/18S分別為2.5、1.7和2.4(見表1)。從Agilent 2100檢測(cè)圖上也可看出方法1和方法2提取的RNA明顯有降解(見圖1和圖2),RNA完整性差,方法3提取的RNA完整性最好(見圖3)。
表 1 不同提取方法對(duì)中秋酥脆棗各器官總RNA提取結(jié)果比較Table 1 Comparison of the total RNAs extracted from different organs in Z. jujuba cv. ‘Zhongqiusucui’ with different methods
圖 1 Agilent 2100 RNA芯片對(duì)方法1提取中秋酥脆棗的總RNA電泳結(jié)果質(zhì)量Fig. 1 The electrophoresis result of total RNAs extracted from Z. jujuba cv. ‘Zhongqiusucui’ with method 1 and Agilent 2100 RNA chip
圖 2 Agilent 2100 RNA芯片對(duì)方法2提取中秋酥脆棗的總RNA電泳結(jié)果質(zhì)量Fig. 2 The electrophoresis result of total RNAs extracted from Z. jujuba cv. ‘Zhongqiusucui’ with method 2 and Agilent 2100 RNA chip
方法1提取的RNA質(zhì)量濃度分別為126、284和222 ng/μL;方法 2提取的 RNA質(zhì)量濃度分別為307、402和266 ng/μL;方法3提取的RNA質(zhì)量濃度分別為401、417和296 ng/μL,由此可看出方法3提取的RNA質(zhì)量濃度最高。
3種方法提取的RNA的OD260/OD280值沒(méi)有顯著差異,均在1.8~2.0,但方法3提取花、結(jié)果枝和果實(shí)RNA的OD260/OD280分別為1.93、1.98和1.83。使用方法1提取的RNA的OD260/OD230值分別為0.97、2.09和1.38,可見棗花和果實(shí)RNA的OD260/OD230值低于1.8;方法2提取RNA的OD260/OD230值分別為2.01、2.11和1.89;方法3提取RNA的OD260/OD230值分別為2.05、2.12和1.98。由此可見方法3提取的RNA的OD260/OD280值和OD260/OD230值高于2種試劑盒法,說(shuō)明方法3提取的RNA純度高,沒(méi)有被污染。
綜上所述,在3種提取棗花、結(jié)果枝和果實(shí)的總RNA方法中,方法3效果最好。即基于Autolab試劑盒改良的CTAB法獲得的總RNA濃度高、純度高、完整性好,滿足轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和cDNA文庫(kù)構(gòu)建的需求。
圖 3 Agilent 2100 RNA芯片對(duì)方法3提取中秋酥脆棗的總RNA電泳結(jié)果質(zhì)量Fig. 3 The electrophoresis result of total RNAs extracted from Z. jujuba cv. ‘Zhongqiusucui’ with method 3 and Agilent 2100 RNA chip
圖 4 分離純化后的mRNA瓊脂糖電泳圖Fig. 4 Agarose gel electrophoresis of puri fi ed mRNAs
mRNA質(zhì)量直接關(guān)系到文庫(kù)的質(zhì)量,在本研究中,分離純化后的mRNA經(jīng)電泳檢測(cè),其覆蓋范圍集中于250~2 000 bp之間(見圖4),表明純化的mRNA中應(yīng)該包含大量該時(shí)期表達(dá)的基因。經(jīng)核酸蛋白檢測(cè)儀檢測(cè),棗花mRNA的OD260/OD280為1.98,OD260/OD230為 2.01,質(zhì)量濃度為 310 ng/μL;棗結(jié)果枝mRNA的OD260/OD280和OD260/OD230分別是1.99和2.12,質(zhì)量濃度為325 ng/μL;棗果實(shí)mRNA的OD260/OD280和OD260/OD230分別是1.93和1.98,質(zhì)量濃度為287 ng/μL,說(shuō)明mRNA樣品中沒(méi)有蛋白質(zhì)、其它有機(jī)和無(wú)機(jī)離子的污染或被污染程度極低,能滿足轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和文庫(kù)構(gòu)建的需要。
將mRNA等量混合后,進(jìn)行cDNA文庫(kù)構(gòu)建,然后進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序,最終獲得34 587條Unigene。進(jìn)一步表明,方法3即基于Autolab試劑盒改良的CTAB法可以成功提取高質(zhì)量的RNA,能夠滿足栆花、結(jié)果枝、果實(shí)等器官轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。
目前,已有較多關(guān)于植物RNA提取方法的報(bào)道,但各RNA提取方法有其優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn),不同植物適用的提取方法也不同[20-23]。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序等分子生物學(xué)研究對(duì)RNA的質(zhì)量要求較高,因此找到一種適用于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的RNA提取方法尤為重要。但在棗組織中含有使RNA極易被降解的次生代謝物質(zhì)以及RNase,增加了提取高質(zhì)量RNA的難度,所以在試驗(yàn)過(guò)程中所有的儀器設(shè)備都要經(jīng)過(guò)嚴(yán)格處理,防止RNA被降解,從而選擇適宜的方法提取RNA,才能更好地進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和cDNA文庫(kù)建立等研究工作。
該研究中以中秋酥脆棗為材料,采用Ambiogen試劑盒、Autolab試劑盒和基于Autolab試劑盒改良的CTAB法分別提取棗花、結(jié)果枝和果實(shí)總RNA,并對(duì)其提取效果進(jìn)行了比較分析。其中Ambiogen試劑盒提取的RNA濃度和純度較低,而且棗花和棗果實(shí)的OD260/OD280值<1.8,棗果實(shí)的OD260/OD280值<1.8,棗花和棗果實(shí)的RNA 28S/18S值<1.0,其RIN值分別為5.1、5.2和2.4,可見其RNA有降解,完整性不好,故該方法提取的RNA沒(méi)有達(dá)到試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn);Autolab試劑盒提取的RNA濃度和純度雖達(dá)到要求,但其RNA的28S/18S值<1.0,RIN值<8,完整性略差,不能很好地滿足試驗(yàn)要求;基于Autolab試劑盒改良CTAB法提取的RNA質(zhì)量濃度分別為401、417和296 ng/μL,其OD260/OD280值為1.8~2.2、OD260/OD230值>1.8,RIN 值分別為 8.3、9.5和8.6,由此可見該方法提取的RNA各方面均達(dá)試驗(yàn)要求。因此基于Autolab試劑盒改良CTAB法提取的RNA不論是濃度、純度還是完整性均是最好的,Autolab試劑盒法次之,再次是Ambiogen試劑盒法。
獲得高質(zhì)量的總RNA是進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的前提,本研究結(jié)果表明:基于Autolab試劑盒改良CTAB法提取的棗花、棗結(jié)果枝和棗果實(shí)的RNA濃度高、純度和完整性最好,滿足轉(zhuǎn)錄組測(cè)序、cDNA文庫(kù)構(gòu)建及RT-PCR等需要高質(zhì)量RNA的試驗(yàn)需求,是提取棗總RNA的首選方法。
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Screening of total RNA extraction methods for RNA-sequences from different organs inZiziphus jujuba
WEI Qi-qi1a-c, FENG Yan-zhi2, LIN Qing1a-c, JIA Bao-guang1a-c, ZHANG Lin1a-c
(1. a. The Key Lab of Non-wood Forest Products of State Forestry Administration; b. The Key Lab of Cultivation and Protection for Non-Wood Forest Trees of Education Ministry; c. 2011 Cooperative Innovation Center of Cultivation and Utilization for Non-Wood Forest Trees of Hunan Province, Central South University of Forestry & Technology, Changsha 410004, Hunan, China; 2. The Center of Research and Development for Non-wood Forest Tree, Chinese Academy of Forestry, Zhengzhou 450003, Henan, China)
In order to obtain the methods for high-quality total RNA extraction from fl ower, fruit bearing branch and fruit inZiziphus jujuba, takingZ. jujubacv. ‘Zhongqiusucui’ as materials, and the RNA extraction effects were compared using two kinds of total RNA extraction kits (Ambiogen and Autolab) and modi fi ed CTAB method based on the Autolab RNA extraction kit. The results showed thatOD260/OD280values of the RNA extracted by using the three RNA extraction methods had no signi fi cant differences, but a part of RNAs obtained by the two RNA extraction kits were degraded. The RNA mass concentrations from fl ower, fruit bearing branch and fruit were 126, 284 and 222 ng/μL by using the RNA extraction kit of Ambiogen; the RNA mass concentrations were 307, 402 and 266 ng/μL by using the RNA extraction kit of Autolab; and the RNA mass concentrations were 401, 417 and 296 ng/μL by using the modi fi ed CTAB method based on the Autolab RNA extraction kit, respectively. The modi fi ed CTAB method could generate high-integrity, high-concentration and high-purity RNA that could meet the request of transcriptome sequencing, compared with the two extraction kits.
Ziziphus jujubacv. ‘Zhongqiusucui’; transcriptome sequencing; RNA extraction; RNA integrity
S665.1
A
1003—8981(2015)02—0063—05
2014-12-20
國(guó)家“十二五”農(nóng)村領(lǐng)域科技計(jì)劃課題(2013BAD14B03)。
魏琦琦,碩士研究生。
張 琳,副教授,博士。E-mail:triwoodtim918@126.com
魏琦琦,馮延芝,林 青,等.適于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的棗不同器官總RNA提取方法篩選[J].經(jīng)濟(jì)林研究,2015,33(2):63-67.
10.14067/j.cnki.1003-8981.2015.02.011
http: //qks.csuft.edu.cn
[本文編校:聞 麗]