周會芳 張密霞 高 麗 莊朋偉 徐 倩 張艷軍

(1 天津中醫(yī)藥大學中西醫(yī)結合學院,天津,300193; 2 天津中醫(yī)藥大學中藥學院,天津,300193)

臍帶間充質干細胞移植對老年癡呆小鼠SAMP8學習記憶的影響

周會芳1張密霞2高 麗2莊朋偉2徐 倩1張艷軍2

(1 天津中醫(yī)藥大學中西醫(yī)結合學院,天津,300193; 2 天津中醫(yī)藥大學中藥學院,天津,300193)

目的:探討臍帶間充質干細胞(HUMSCs)移植對老年癡呆小鼠SAMP8學習記憶能力的影響。方法:培養(yǎng)人臍帶間充質干細胞,通過尾靜脈以高中低3個劑量(2.5×105/0.2 mL/20 g、5×105/0.2 mL/20 g、1×106/0.2 mL/20 g)分別向7月齡SAMP8老年癡呆小鼠移植HUMSCs,并設立移植生理鹽水組和R1小鼠正常對照組。HUMSCs移植45 d后,MORRIS水迷宮和跳臺實驗檢測其學習記憶能力。結果:與R1正常對照小鼠比較,SAMP8老年癡呆小鼠生理鹽水組學習記憶能力明顯降低;和移植生理鹽水組比較,細胞移植低劑量組水迷宮逃避潛伏期顯著縮短(P<0.05),穿越平臺次數(shù)顯著增加(P<0.05);跳臺潛伏期顯著延長(P<0.05),錯誤次數(shù)顯著減少(P<0.05),結論:低劑量的臍帶間充質干細胞移植能增強老年癡呆小鼠SAMP8的學習記憶能力。

臍帶間充質干細胞;移植;SAMP8;學習記憶

老年癡呆癥是發(fā)生在老年期及老年前期的一種原發(fā)性退行性腦病,它使老年人記憶、思維、分析判斷能力下降,嚴重影響老年人生活質量。治療老年癡呆的藥物和方法越來越多,實驗研究表明多種藥物或者運動等方法[1-3],都可以減緩老年癡呆癥的發(fā)病進程,但效果仍不是很理想。因此,我們試圖通過向老年癡呆成體移植有活力、分化能力強的細胞來阻止老年癡呆癥的發(fā)病進程。

人臍帶間充質干細胞(Human Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cells,HUMSCs)是具有多能性的一種干細胞,它具有高度自我更新和多向分化潛能的特點,越來越多的研究應用干細胞移植的方法來觀察其對老年癡呆小鼠的治療效果[4-5],成為干細胞領域的研究熱點。因此,本實驗擬向老年癡呆小鼠移植臍帶間充質干細胞觀察能否改善其學習記憶能力,為人類老年癡呆的治療提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 SAMP8老年癡呆小鼠,7月齡40只,對照組R1小鼠10只,由天津中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院提供,標準鼠飼料常規(guī)飼養(yǎng)。

1.1.2 細胞與試劑 人臍帶間充質干細胞:協(xié)和干細胞基因工程有限公司提供。DMEM/F12、EGF、bFGF、谷氨酰、EDTA(Sigma公司);特優(yōu)級胎牛血清(Bioind公司);青、鏈霉素(invitrogen公司);CO2恒溫培養(yǎng)箱(Forma 3110，Thermo);倒置相差顯微鏡(DC300F,Leica),MORRIS水迷宮(DMS-2型,中國醫(yī)學科學院藥物研究所);YLS-3TB跳臺記錄儀(濟南益延科技發(fā)展有限公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 臍帶間充質干細胞培養(yǎng) 購買臍帶間充質干細胞,以完全培養(yǎng)基培養(yǎng)進行培養(yǎng)(完全培養(yǎng)基為:DMEM/F12,含10%FBS、1%PS、1%LG、0.5%EGF、0.5%bFGF),每2～3 d換液,細胞長至80%融合后傳代,培養(yǎng)至穩(wěn)定生長的第3代。

1.2.2 實驗分組和細胞移植 實驗共分為5組,將40只SAMP8老年癡呆小鼠分為4組,每組10只,細胞移植高中低3個劑量組和移植生理鹽水組,正常對照組(R1小鼠10只)。將第3代HUMSCs接種于75 cm2培養(yǎng)瓶,待細胞長至70%融合,胰蛋白酶-EDTA消化,調整細胞至所需濃度,通過尾靜脈移植以2.5×105/0.2 mL/20 g、5×105/0.2 mL/20 g、1×106/0.2 mL/20 g 3個劑量分別對SAMP8進行移植,生理鹽水組和正常對照組都尾靜脈注射生理鹽水。

1.2.3 MORRIS水迷宮檢測 細胞移植后45 d,MORRIS水迷宮檢測小鼠學習記憶能力[6],包括小鼠在水中的逃避潛伏期、平均游泳速度、第四象限路程、首次穿越時間和穿越次數(shù),所有實驗小鼠均提前熟悉環(huán)境1 d、隱蔽平臺試驗連續(xù)進行5 d、空間探索試驗1 d,觀察小鼠的學習記憶能力。隱蔽平臺實驗:實驗開始前1 d讓小鼠在不含平臺的水池中自由游泳90 s,訓練的時候將動物面朝池壁輕輕放入水中,記錄小鼠從入水至爬上平臺的時間(即逃避潛伏期),如果90 s內小鼠爬上平臺,讓小鼠在平臺上停留15 s,如果90 s內找不到平臺,將其潛伏期記為90 s,并抓起小鼠放在平臺上休息15 s。正式的隱蔽平臺實驗連續(xù)進行5 d,每天上午下午各測試1次,記錄每只小鼠的逃避潛伏期?？臻g探索試驗:在5 d的隱蔽平臺實驗結24 h后,移走平臺,然后將小鼠從相同的象限輕輕放入水中,記錄小鼠在90 s內的平均游泳速度、在第四象限停留的時間和路程、第1次穿越平臺位置時間以及穿越平臺位置次數(shù)。

1.2.4 跳臺實驗 MORRIS水迷宮檢測結束后2 d,開始小鼠跳臺實驗。正式實驗前將小鼠放入跳臺儀實驗平臺內,適應環(huán)境5 min,然后將實驗小鼠輕放于跳臺上,并接通銅柵通電(50 V),從跳臺上跳下的小鼠四肢在接觸銅柵的時候會受到電擊,小鼠為了逃避電擊,會跳下跳臺返回安全區(qū)(若30 s內小鼠不跳下跳臺,則將其放下跳臺),反復學習5 min,并記錄此訓練的5 min內的觸電次數(shù)(錯誤次數(shù))。24 h后進行重復實驗,測試小鼠的記憶能力,將實驗小鼠輕放在跳臺上,記錄小鼠從放在跳臺上至第1次跳下跳臺的時間即潛伏期和5 min內的錯誤次數(shù),作為記憶保持的評價指標。

2 結果

2.1 HUMSCs的形態(tài) 體外培養(yǎng)的HUMSCs呈長梭形貼壁生長,胞核清晰位于細胞中央,細胞呈漩渦狀迅速生長。

2.2 臍帶間充質干細胞移植對SAMP8小鼠學習記憶能力的影響

2.2.1 水迷宮實驗結果 從逃避潛伏期來看,空白對照組明顯優(yōu)于移植生理鹽水組,均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。細胞移植各組數(shù)值分別處于生理鹽水組和對照組之間,從第3天開始,移植低劑量組明顯優(yōu)于其他濃度的細胞移植組,與移植生理鹽水組有統(tǒng)計學意義(P<0.05)且優(yōu)于移植生理鹽水組,結果見表1。

表1 HUMSCS移植對小鼠逃避潛伏期的影響

注:*與正常對照組比較,P<0.05,△與移植生理鹽水組比較,P<0.05。

表2 HUMSCS移植對小鼠空間探索實驗的影響

注:*與正常對照組比較,P<0.05,△與移植生理鹽水組比較,P<0.05。

空間探索測試結果顯示了小鼠對隱蔽平臺的記憶水平,對照組和尾靜脈生理鹽水組在穿越次數(shù)有統(tǒng)計學意義;和生理鹽水組比較,移植低劑量組組穿越原平臺位置次數(shù)增加,并有統(tǒng)計學意義;各組平均游泳速度、第四象限路程、首次穿越時間差異無統(tǒng)計學意義,總體結果差異不大,結果見表2。

2.2.2 跳臺實驗結果 跳臺實驗中,各組小鼠一次性回避反應功能學習過程中錯誤次數(shù)沒有差異,結果見表3。從潛伏期和錯誤次數(shù)來看,正常對照組明顯優(yōu)于移植生理鹽水組,且都具有統(tǒng)計學意義;和移植生理鹽水組比較,移植低劑量和高劑量組的潛伏期增加,移植低劑量組的錯誤次數(shù)減少,且有統(tǒng)計學意義,其余各組結果差異無統(tǒng)計學意義,具體結果見表4。

組別只數(shù)錯誤次數(shù)正常對照組100.90±0.74移植生理鹽水組71.60±1.14移植低劑量組91.11±1.27移植中劑量組61.83±0.75移植高劑量組91.33±1.22

注:各組間比較差異無統(tǒng)計學意義。

組別只數(shù)潛伏期錯誤次數(shù)正常對照組10204.80±124.210.40±0.52△移植生理鹽水組788.27±106.69*1.43±0.98*移植低劑量組9246.84±100.37△0.33±0.50△移植中劑量組6156.4±157.440.50±0.55移植高劑量組9271.70±84.90△0.67±1.41

注:*與正常對照組比較,P<0.05,△與移植生理鹽水組比較,P<0.05。

3 討論

具有多向分化潛能的臍帶間充質干細胞被移植到小鼠體內可能分化成為神經(jīng)干細胞,通過神經(jīng)修復、重建,發(fā)揮延緩老年癡呆的作用。基底前腦是老年癡呆腦皮質下神經(jīng)元丟失最嚴重的區(qū)域[7],該區(qū)域含有不同神經(jīng)元,包括膽堿能神經(jīng)元和GABA能神經(jīng)元,這個區(qū)域的神經(jīng)元通過隔-海馬通路(主要以乙酰膽堿和GABA為遞質)與海馬相聯(lián)系[8],神經(jīng)元的缺失造成了老年癡呆小鼠學習記憶障礙[9]。臍帶間充質干細胞移植分化成神經(jīng)干細胞,繼續(xù)分化成為神經(jīng)元,補充了老年癡呆小鼠基底前腦中神經(jīng)元的損失,阻礙了老年癡呆癥的病程發(fā)展。

在研究工作進行中,對老年癡呆癥的動物模型的選擇也有很多。研究表明[10],使用乙酰膽堿M受體阻斷劑也可以制造出老年癡呆動物模型,該模型可造成認知障礙,但缺陷在于缺乏老年癡呆的特殊病理特征,且阻斷是可逆的。APP轉基因小鼠模型是國際承認的主要AD動物模型之一[11],它的原理是將APP基因或基因片段整合插入小鼠的基因組中,通過APP蛋白在小鼠大腦中積累從而產生老年斑,造成小鼠老年性癡呆,但由于整合的基因突變位點及啟動子的不同,所以鼠系背景復雜,導致標準不盡相同,重復性低,最主要的還是該模型動物價格比較昂貴。有些實驗使用電損毀模型或外科損毀模型,電損傷Meynert基底核,致使動物的大腦皮層乙酰膽堿的含量大大減少,從而造成動物學習記憶障礙[12],但是由于這種手術損傷較大,目前已經(jīng)很少使用。以上這些方法都有其自身的缺陷,或模型不穩(wěn)定、或不能完全模擬老年癡呆癥的發(fā)病過程、或價格昂貴成功率不高,在實際操作中,都不易達到本實驗的要求。

快速老化小鼠(SAM)是日本京都大學Takeda等人通過對AKR/J系小鼠進行篩選得到的品系,可分為2個亞系,即P系和R系。P系稱為快速老化小鼠(SAMP),小鼠慢慢出現(xiàn)脫毛、皮膚粗糙、行為障礙及生存期短等衰老現(xiàn)象,并有明顯遺傳傾向;R系稱為抗快速老化小鼠(SAMR),有類似正常老鼠的衰老過程[13]。目前有12個亞系的SAM用于研究,其中SAMP8小鼠的老化現(xiàn)象主要以學習記憶功能呈增齡性衰退,中樞神經(jīng)系統(tǒng)如皮層、海馬等部位發(fā)生病理學改變?yōu)橹鱗14-15]。研究表明,SAMP8小鼠在飼養(yǎng)過程中腦內β淀粉樣肽(Aβ)慢慢的出現(xiàn)沉積[16],而且學習記憶功能相關的腦內神經(jīng)遞質也逐漸發(fā)生改變,如大腦皮層和海馬的乙酰膽堿、去甲腎上腺素的含量降低,阿片肽、γ-氨基丁酸的含量升高,5-羥色胺的含量先升高后降低等[17-18]。SAMP8小鼠腦內脂質過氧化物的水平比同齡SAMR1小鼠更高,同時伴有氧化-抗氧化系統(tǒng)紊亂,從而出現(xiàn)氧化應激損傷[16,19],更有明顯的線粒體功能紊亂現(xiàn)象[20]。所以我們選擇SAMP8小鼠。

本實驗所選擇的SAMP8小鼠在4月齡即出現(xiàn)明顯的老化征象[21],而且在其成熟期(4～6個月)過后發(fā)生快速老化,學習記憶能力也表現(xiàn)出增齡性減退,隨著衰老的發(fā)生,SAMP8模型小鼠表現(xiàn)出嚴重的學習記憶功能障礙。實驗中通過尾靜脈向7月齡SAMP8老年癡呆小鼠移植高中低3個劑量的HUMSCS,45 d利用MORRIS水迷宮和跳臺實驗檢測其學習記憶能力,并設立生理鹽水組和R1小鼠正常對照組,結果發(fā)現(xiàn)與R1正常對照小鼠比較,SAMP8老年癡呆小鼠生理鹽水組學習記憶能力明顯降低,細胞移植各組小鼠學習記憶能力介于生理鹽水組和正常對照組之間,其中尾靜脈細胞移植低劑量組與尾靜脈生理鹽水組比較,差異具有統(tǒng)計學意義,所以認為低劑量的HUMSCS移植對老年癡呆小鼠的學習記憶能力有改善作用。

以高中低3個劑量(2.5×105/0.2 mL/20 g、5×105/0.2 mL/20 g、1×106/0.2 mL/20 g)的HUMSCS分別向SAMP8老年癡呆小鼠移植后,細胞移植高劑量組的SAMP8小鼠的逃避潛伏期、不同象限的停留時間、跳臺實驗中的錯誤次數(shù)及最后小鼠體重等指標都不如移植低劑量的效果好,推測可能是由于細胞濃度過高,且直接移植到動脈造成動脈栓塞,導致SAMP8小鼠狀態(tài)不佳,其具體原因仍需要實驗作為依據(jù),后續(xù)實驗會繼續(xù)探究其原因。

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(2015-05-18收稿 責任編輯：王明)

Effects of HUMSCs on Learning Ability and Memory in Mice SAMP8 with Alzheimer's Disease

Zhou Huifang1, Zhang Mixia2, Gao Li2, Zhuang Pengwei2, Xu Qian1, Zhang Yanjun2

(1SchoolofIntegrativeMedicine,TianjinUniversityofTraditionalChineseMedicine,Tianjin300193,China; 2SchoolofTraditionalChineseMateriaMedica,TianjinUniversityofTraditionalChineseMedicine,Tianjin300193,China)

Objective: To explore the effects of human umbilical cord mesenchymal stem cells(HUMSCSs) on the learning ability and memory of mice SAMP8 with Alzheimer's disease. Methods: We cultivated human umbilical cord mesenchymal stem cells, provided three doses HUMSCs (2.5×105/0.2 mL/20 g, 5×105/0.2 mL/20 g, 1×106/0.2 mL/20 g) for the transplantation of seven months SAMP8 Alzheimer's mice by the tail vein, and set up the normal saline group and normal control group R1 mice for comparison. After 45 days, MORRIS water maze and jumping apparatus were used to test the ability of learning and memory of the subjects. Results: Compared with normal control mice R1, normal saline group of SAMP8 Alzheimer's mice performed significantly worse on the learning and memory tests. But there was significant improvement in Morris water maze test compared with the normal saline group, including shorter escape latency (P<0.05) more platform crossing frequencies (P<0.05), and in jumping apparatus including less jumping stand error number (P<0.05) and longer step down latency (P<0.05). Conclusion: Low dose of HUMSCs can enhance learning and memory ability of SAMP8 Alzheimer's mice.

HUMSCs; Transplantation; SAMP8; Learning and memory

天津市科技支撐計劃重大項目(編號:08ZCKFSF03200)

周會芳(1987.2—),女,碩士,助理實驗師,研究方向:中藥藥效評價,E-mail:zhouhuifanghhfm@163.com

張艷軍(1967.8—),男,博士,教授,研究方向:中藥藥理,E-mail:zyjsunye@163.com

R229;R394-3

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2015.09.024