黃微

介紹一個與材料相關(guān)的研究型綜合化學實驗*
——殼聚糖的制備與表征

黃微

在中國科學技術(shù)大學夏季學期的研究型實驗課程“化學科研基礎(chǔ)訓練”中開設(shè)“殼聚糖的制備與表征”綜合實驗，以龍蝦殼為原料，通過除蛋白、脫鹽、脫色、脫乙酰等一系列反應，制備得到目標產(chǎn)物殼聚糖。運用紅外光譜、核磁共振儀、黏度法、滴定等對產(chǎn)品的結(jié)構(gòu)及性能進行表征。

龍蝦殼 殼聚糖 制備表征 研究型 綜合化學實驗

殼聚糖(chitosan)是由自然界廣泛存在的甲殼素(chitin)經(jīng)過脫乙酰作用得到的，化學名為聚葡萄糖胺(1-4)-2-氨基-β-D葡萄糖，是迄今為止發(fā)現(xiàn)的唯一天然堿性多糖[1]。該天然多糖具有優(yōu)異的血液相容性、生物官能性、安全性、可降解性等，已成功應用于醫(yī)藥、食品、化工、污水處理、金屬提取及回收、生物醫(yī)學工程等諸多領(lǐng)域，是目前應用最為廣泛的材料之一[2-6]。

關(guān)于殼聚糖的制備已有諸多文獻報道[7-8]，但將其作為一個完整的研究型化學實驗項目引入至本科實驗教學還較為少見。在中國科學技術(shù)大學夏季學期的研究型實驗課程“化學科研基礎(chǔ)訓練”中，我們將其作為實驗項目之一，為學生開設(shè)了“殼聚糖的制備與表征”綜合實驗。讓學生在教師指導下，進行殼聚糖相關(guān)文獻的檢索、方案設(shè)計、實驗實施、報告撰寫、結(jié)題答辯，較為完整地進行一次簡單的科研實踐過程。該實驗時長為3周，計40學時、1學分[9]。下面對該實驗的教學過程進行簡單介紹。

1 實驗目的

① 了解殼聚糖的性質(zhì)及應用。

② 學習利用龍蝦殼制備殼聚糖的原理及方法。

③ 學習利用紅外、核磁、烏氏黏度計等儀器表征物質(zhì)結(jié)構(gòu)的方法。

④ 學習文獻檢索以及科技論文的撰寫。

2 實驗原理

龍蝦殼中甲殼素含量為20%～30%，有機物(以蛋白質(zhì)為主)含量約30%，無機物(以碳酸鈣為主)含量約40%[10]。因此由蝦殼制備甲殼素的過程，實際就是將甲殼素與蛋白質(zhì)和無機鹽分離的過程。根據(jù)甲殼素不溶于稀堿及稀酸的特性，可采用堿浸、酸浸的方法依次破壞蝦殼中的蛋白質(zhì)和碳酸鹽。此外，蝦殼中含有的大量色素(蝦紅素)會影響產(chǎn)品的表觀和純度，可采用無水乙醇回流除去，再利用高錳酸鉀溶液將殘留色素氧化，隨后加入適量硫代硫酸鈉溶液以除去殘余高錳酸鉀，干燥得到甲殼素，再進一步通過脫乙酰反應制備得到殼聚糖。甲殼素與殼聚糖的結(jié)構(gòu)式如圖1所示。

圖1 甲殼素與殼聚糖的結(jié)構(gòu)式

3 試劑儀器

3.1 試劑

蝦殼取自合肥市龍蝦一條街的飲食拋棄物，剔去殘肉，洗凈晾干備用。

NaOH溶液(0.1 mol/L、2.5 mol/L、10 mol/L)，HCl溶液(0.1 mol/L、1 mol/L)，乙醇，1% KMnO4溶液，2% Na2S2O3溶液，3% HAc溶液，0.2 mol/L NaCl-0.1 mol/L HAc混合溶液，1% I-KI溶液。

3.2 儀器

行星式球磨粉碎機(南京新校園儀器廠，型號PM2L)，IKA磁力攪拌器(德國IKA公司，型號RCT-basic)，離心機(德國Sigma公司，型號3K18)，傅立葉紅外光譜儀(美國ThermoFisher公司，型號Nicolet 6700)，核磁共振波譜儀(瑞士Bruker公司，型號UitraShied 300M)，烏氏黏度計(上海申誼玻璃制品有限公司，毛細管直徑0.4～0.5 mm)。

4 實驗步驟

4.1 殼聚糖的制備

4.1.1 甲殼素的制備

① 粉碎蝦殼：將龍蝦殼洗凈、烘干，以球磨機粉碎，備用。

② 除蛋白、脂肪：稱取粉碎的蝦殼100 g，置于1000 mL燒杯中，加入2.5 mol/L NaOH溶液400 mL，室溫下攪拌12 h。

③ 除鹽：將蝦殼水洗至中性，稍瀝干，加入1 mol/L HCl溶液500 mL，室溫下攪拌6 h，再進行堿浸、水洗、酸浸、水洗，重復兩次，用清水洗至中性。

④ 脫色：將上述產(chǎn)品用乙醇回流2 h，過濾，收集固體，并用1% KMnO4溶液浸泡1 h，過濾清洗，再加入2% Na2S2O3溶液浸沒樣品，逐滴加入1 mol/L HCl溶液，攪拌至紫色褪去，得到甲殼素，過濾清洗，烘干。

4.1.2 殼聚糖的制備

殼聚糖為甲殼素脫除乙?；漠a(chǎn)品，具有溶液黏稠、易成膜等特點。甲殼素在脫除乙?；耐瑫r會引起相對分子質(zhì)量降低，因此在實驗中要根據(jù)實際需要調(diào)控反應條件，其制備過程如下：

在氮氣保護下，將5.0 g甲殼素加入到100 mL 10 mol/L的NaOH水溶液中，在100 ℃回流3 h，過濾，濾渣水洗至中性后，用3% HAc溶液攪拌溶解，過濾得上清液，再用NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至9，逐漸析出膠狀物，離心分離，產(chǎn)物干燥后即得到殼聚糖。

實驗流程如圖2所示。

圖2 由龍蝦殼制備殼聚糖的實驗流程圖

4.2 殼聚糖的表征

4.2.1 殼聚糖結(jié)構(gòu)表征

采用傅立葉紅外光譜儀以及核磁共振儀表征殼聚糖結(jié)構(gòu)。其中，紅外光譜測試采用KBr壓片法；核磁共振測試以TMS為內(nèi)標、DCl/D2O (V(DCl)∶V(D2O)=4%)為溶劑。

4.2.2 殼聚糖相對分子質(zhì)量測定

4.2.3 殼聚糖脫乙酰度測定

依據(jù)殼聚糖的游離氨基能吸附碘分子并呈現(xiàn)亮紫色的特性[12]，以碘作指示劑，采用酸堿滴定法測定殼聚糖脫乙酰度。

準確稱取0.3 g干燥至恒重的殼聚糖于250 mL錐形瓶中，加入30 mL 0.1 mol/L HCl標準溶液，室溫攪拌至完全溶解，加入10 mL蒸餾水稀釋，滴加2～3滴1% I-KI溶液。用0.1 mol/L NaOH標準溶液滴定至剛出現(xiàn)亮紫色顆粒狀沉淀，即為滴定終點，平行測定3次，按以下公式計算脫乙酰度(DD)[13]。

(1)

(2)

式中w(NH2)為—NH2的質(zhì)量分數(shù)；c1為標準鹽酸溶液濃度(單位為mol/L)；V1為加入的標準鹽酸溶液體積(單位為mL)；c2為標準氫氧化鈉溶液濃度(單位為mol/L)；V2為消耗的標準氫氧化鈉溶液體積(單位為mL)；G為樣品質(zhì)量(單位為g)；161為殼聚糖結(jié)構(gòu)單元對應的摩爾質(zhì)量(單位為g/mol)；9.94%為DD=100%的殼聚糖中的氨基含量。

5 結(jié)果與討論

5.1 殼聚糖結(jié)構(gòu)表征

圖3為在上述實驗條件下制備的甲殼素和殼聚糖的紅外譜圖。其中，甲殼素(圖3a)各主要峰歸屬如下：1654 cm-1出現(xiàn)的峰為酰胺Ⅰ帶特征吸收峰(C—O伸縮振動)，1568 cm-1出現(xiàn)的峰為酰胺Ⅱ帶特征吸收峰(N—H彎曲振動)，1320 cm-1出現(xiàn)的峰為酰胺Ⅲ帶特征吸收峰(C—N伸縮振動)。與甲殼素的紅外譜圖相比，在殼聚糖的紅外譜圖中(圖3b)，1654 cm-1的酰胺Ⅰ帶吸收峰明顯減弱，而在1572 cm-1處出現(xiàn)了很強的游離氨基振動吸收峰(N—H面內(nèi)彎曲振動)，說明甲殼素成功脫除乙?；?。

圖3 甲殼素(a)和殼聚糖(b)的紅外譜圖

圖4為制備的殼聚糖樣品的核磁氫譜，各峰歸屬如下：δ: 2.68(H2)，3.25～3.45(H3, H4, H5, H6)，4.42(H1)。δ=1.82處出現(xiàn)的極弱峰歸屬為乙?；募谆鶜滟|(zhì)子，說明脫除乙酰基較為完全。核磁與紅外結(jié)果相吻合。

圖4 殼聚糖的核磁氫譜

5.2 殼聚糖相對分子質(zhì)量的測定結(jié)果

在該實驗條件下制備的殼聚糖相對分子質(zhì)量為4.35×104。在進行相對分子質(zhì)量和脫乙酰度測定實驗時，要注意殼聚糖樣品的充分干燥，尤其是在對相對分子質(zhì)量較高的高脫乙酰度殼聚糖樣品進行測量時，由于其黏度較高，所用樣品量較少(30～50 mg)，稱量誤差會導致測量結(jié)果出現(xiàn)較大波動，重現(xiàn)性差。在本實驗條件下得到的是中低相對分子質(zhì)量(1×104～1×105)的殼聚糖，黏度相對較低，測量用量較大(0.3～1.0 g)，稱量誤差對測定結(jié)果影響較小，重現(xiàn)性好。

5.3 殼聚糖脫乙酰度的測定結(jié)果

根據(jù)式(1)、式(2)計算得到該實驗條件下制備的殼聚糖脫乙酰度為94.2%，與紅外、核磁結(jié)果所呈現(xiàn)的趨勢相符。酸堿滴定法是測定殼聚糖脫乙酰度較為簡便的方法，具有成本低廉、快速準確等特點。本實驗所制備的殼聚糖特性黏度僅為37.3，屬低黏度殼聚糖，水溶性較好，因此在采用酸堿滴定法測定殼聚糖脫乙酰度時，即便在接近滴定終點時，體系也基本能保持較為澄清的溶液狀態(tài)；此外，實驗中采用I-KI為指示劑，終點時稍過量的氫氧化鈉與殼聚糖的—NH3+(由殼聚糖的—NH2與鹽酸結(jié)合而成)反應生成游離的—NH2，進而與碘分子形成明亮的紫紅色n-σ型電荷轉(zhuǎn)移絡(luò)合物，振蕩不消退，使終點易于觀察。

6 注意事項

① 在甲殼素脫除乙酰基制備殼聚糖的實驗過程中使用了熱的濃堿溶液，應避免灼傷。

② 實驗后應回收酸堿廢液，不可隨意排放。

③ 在進行相對分子質(zhì)量和脫乙酰度測定實驗時，要注意將樣品充分干燥。

7 教學建議

① 殼聚糖相對分子質(zhì)量以及脫乙酰度的變化對其晶體結(jié)構(gòu)、水溶性、成膜性能、降解速率等均有顯著影響[14]，學生可采取以小組為單位的方式，設(shè)計單因素分析法的實驗方案，分別從反應時間、反應溫度、體系pH的調(diào)控等方面進行考察，設(shè)計實驗，并分析各種因素的影響規(guī)律。

② 測定殼聚糖脫乙酰度的方法較多，主要分為三大類，第一類是利用胺基的化學性質(zhì)，如易質(zhì)子化、易與醛基反應生成希夫堿等，可采用酸堿滴定法、電位滴定法、膠體滴定法等進行脫乙酰度的測定；第二類是利用胺基以及甲殼素/殼聚糖的波譜學特性，如酰胺基團在紫外光譜、紅外光譜中的特征吸收峰等，可采用紅外光譜法、紫外光譜法、核磁共振波譜法等進行脫乙酰度的測定；第三類是采用破壞樣品法，即元素分析法、色譜法、熱分析法等進行脫乙酰度的測定[15-16]。在實驗過程中，學生可采取橫向合作的方式，采用不同方法測定脫乙酰度，并比較各種方法的最佳適用體系及優(yōu)劣性。

③ 實驗報告以論文的形式完成，以達到綜合考察學生撰寫科技論文的目的。報告正文包括:實驗背景介紹及原理；采取的研究方法和技術(shù)路線；實驗結(jié)果與數(shù)據(jù)分析；實驗總結(jié)與改進。

8 實驗總結(jié)

本文介紹的“殼聚糖的制備與表征”實驗涉及了球磨機的使用，氮氣保護下的熱回流裝置的搭建，核磁、紅外光譜分析，以及黏度、脫乙酰度測定等相關(guān)知識和技能，是一個集制備和表征為一體的研究型綜合化學實驗。在實驗設(shè)計與實施過程中，學生運用所掌握的知識和技能，將飲食廢棄物蝦殼變?yōu)榫哂袘脙r值的殼聚糖，在熟悉的生活情境中感悟化學的魅力，認識與領(lǐng)悟化學和社會生活的聯(lián)系，提升實驗興趣。此外，由于實驗方案為學生查閱文獻后自行設(shè)計，他們期待通過實驗現(xiàn)象和實驗數(shù)據(jù)來驗證方案的合理性，因此學生對于問題的發(fā)現(xiàn)、分析和解決均表現(xiàn)出較強的欲望，再加上教師的適時指導和啟發(fā)，他們的求知欲和實驗積極性均得到較好提升。該實驗原料經(jīng)濟易得、趣味性強、反應條件溫和、重現(xiàn)性好，已在“化學科研基礎(chǔ)訓練”課程中連續(xù)向3屆學生開設(shè)，取得了較好的教學效果，是一個適合低年級本科生的研究型綜合化學實驗項目。

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A Research-oriented Comprehensive Experiment Related to Materials*——The Preparation and Characterization of Chitosan

Huang Wei**Li Weiwei Zheng Yuan

(ChemistryExperimentTeachingCenter,UniversityofScienceandTechnologyofChina,Heifei230026,Anhui,China)

"The preparation and characterization of chitosan" was set up as a research-oriented comprehensive experiment in the course of Primary Training of Chemical Research in the summer semester of USTC. With the local lobster shell as the raw material, we inquired into the preparation of chitosan after a series of reactions such as deproteinization, desalination, decoloration and deacetylation. The physicochemical properties of chitosan were characterized by FT-IR,1H-NMR, viscosity measurement and titrametry.

Lobster shell; Chitosan; Preparation and characterization; Research-oriented; Comprehensive chemical experiment

10.3866/pku.DXHX20150657

*通訊聯(lián)系人, E-mail:hwnk@ustc.edu.cn 李維維 鄭媛 (中國科學技術(shù)大學化學實驗教學中心 安徽合肥 230026)

2013年安徽省重大教學改革項目(No.2013zytz003); 2012年安徽省教學研究項目(No.2012jyxm020); 2014年度中國科學技術(shù)大學本科教學研究項目

O6-3; G64