黃微

介紹一個(gè)與材料相關(guān)的研究型綜合化學(xué)實(shí)驗(yàn)*
——?dú)ぞ厶堑闹苽渑c表征

黃微

在中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)夏季學(xué)期的研究型實(shí)驗(yàn)課程“化學(xué)科研基礎(chǔ)訓(xùn)練”中開設(shè)“殼聚糖的制備與表征”綜合實(shí)驗(yàn)，以龍蝦殼為原料，通過除蛋白、脫鹽、脫色、脫乙酰等一系列反應(yīng)，制備得到目標(biāo)產(chǎn)物殼聚糖。運(yùn)用紅外光譜、核磁共振儀、黏度法、滴定等對(duì)產(chǎn)品的結(jié)構(gòu)及性能進(jìn)行表征。

龍蝦殼 殼聚糖 制備表征 研究型 綜合化學(xué)實(shí)驗(yàn)

殼聚糖(chitosan)是由自然界廣泛存在的甲殼素(chitin)經(jīng)過脫乙酰作用得到的，化學(xué)名為聚葡萄糖胺(1-4)-2-氨基-β-D葡萄糖，是迄今為止發(fā)現(xiàn)的唯一天然堿性多糖[1]。該天然多糖具有優(yōu)異的血液相容性、生物官能性、安全性、可降解性等，已成功應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、化工、污水處理、金屬提取及回收、生物醫(yī)學(xué)工程等諸多領(lǐng)域，是目前應(yīng)用最為廣泛的材料之一[2-6]。

關(guān)于殼聚糖的制備已有諸多文獻(xiàn)報(bào)道[7-8]，但將其作為一個(gè)完整的研究型化學(xué)實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目引入至本科實(shí)驗(yàn)教學(xué)還較為少見。在中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)夏季學(xué)期的研究型實(shí)驗(yàn)課程“化學(xué)科研基礎(chǔ)訓(xùn)練”中，我們將其作為實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目之一，為學(xué)生開設(shè)了“殼聚糖的制備與表征”綜合實(shí)驗(yàn)。讓學(xué)生在教師指導(dǎo)下，進(jìn)行殼聚糖相關(guān)文獻(xiàn)的檢索、方案設(shè)計(jì)、實(shí)驗(yàn)實(shí)施、報(bào)告撰寫、結(jié)題答辯，較為完整地進(jìn)行一次簡(jiǎn)單的科研實(shí)踐過程。該實(shí)驗(yàn)時(shí)長(zhǎng)為3周，計(jì)40學(xué)時(shí)、1學(xué)分[9]。下面對(duì)該實(shí)驗(yàn)的教學(xué)過程進(jìn)行簡(jiǎn)單介紹。

1 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/h2>

① 了解殼聚糖的性質(zhì)及應(yīng)用。

② 學(xué)習(xí)利用龍蝦殼制備殼聚糖的原理及方法。

③ 學(xué)習(xí)利用紅外、核磁、烏氏黏度計(jì)等儀器表征物質(zhì)結(jié)構(gòu)的方法。

④ 學(xué)習(xí)文獻(xiàn)檢索以及科技論文的撰寫。

2 實(shí)驗(yàn)原理

龍蝦殼中甲殼素含量為20%～30%，有機(jī)物(以蛋白質(zhì)為主)含量約30%，無機(jī)物(以碳酸鈣為主)含量約40%[10]。因此由蝦殼制備甲殼素的過程，實(shí)際就是將甲殼素與蛋白質(zhì)和無機(jī)鹽分離的過程。根據(jù)甲殼素不溶于稀堿及稀酸的特性，可采用堿浸、酸浸的方法依次破壞蝦殼中的蛋白質(zhì)和碳酸鹽。此外，蝦殼中含有的大量色素(蝦紅素)會(huì)影響產(chǎn)品的表觀和純度，可采用無水乙醇回流除去，再利用高錳酸鉀溶液將殘留色素氧化，隨后加入適量硫代硫酸鈉溶液以除去殘余高錳酸鉀，干燥得到甲殼素，再進(jìn)一步通過脫乙酰反應(yīng)制備得到殼聚糖。甲殼素與殼聚糖的結(jié)構(gòu)式如圖1所示。

圖1 甲殼素與殼聚糖的結(jié)構(gòu)式

3 試劑儀器

3.1 試劑

蝦殼取自合肥市龍蝦一條街的飲食拋棄物，剔去殘肉，洗凈晾干備用。

NaOH溶液(0.1 mol/L、2.5 mol/L、10 mol/L)，HCl溶液(0.1 mol/L、1 mol/L)，乙醇，1% KMnO4溶液，2% Na2S2O3溶液，3% HAc溶液，0.2 mol/L NaCl-0.1 mol/L HAc混合溶液，1% I-KI溶液。

3.2 儀器

行星式球磨粉碎機(jī)(南京新校園儀器廠，型號(hào)PM2L)，IKA磁力攪拌器(德國(guó)IKA公司，型號(hào)RCT-basic)，離心機(jī)(德國(guó)Sigma公司，型號(hào)3K18)，傅立葉紅外光譜儀(美國(guó)ThermoFisher公司，型號(hào)Nicolet 6700)，核磁共振波譜儀(瑞士Bruker公司，型號(hào)UitraShied 300M)，烏氏黏度計(jì)(上海申誼玻璃制品有限公司，毛細(xì)管直徑0.4～0.5 mm)。

4 實(shí)驗(yàn)步驟

4.1 殼聚糖的制備

4.1.1 甲殼素的制備

① 粉碎蝦殼：將龍蝦殼洗凈、烘干，以球磨機(jī)粉碎，備用。

② 除蛋白、脂肪：稱取粉碎的蝦殼100 g，置于1000 mL燒杯中，加入2.5 mol/L NaOH溶液400 mL，室溫下攪拌12 h。

③ 除鹽：將蝦殼水洗至中性，稍瀝干，加入1 mol/L HCl溶液500 mL，室溫下攪拌6 h，再進(jìn)行堿浸、水洗、酸浸、水洗，重復(fù)兩次，用清水洗至中性。

④ 脫色：將上述產(chǎn)品用乙醇回流2 h，過濾，收集固體，并用1% KMnO4溶液浸泡1 h，過濾清洗，再加入2% Na2S2O3溶液浸沒樣品，逐滴加入1 mol/L HCl溶液，攪拌至紫色褪去，得到甲殼素，過濾清洗，烘干。

4.1.2 殼聚糖的制備

殼聚糖為甲殼素脫除乙?；漠a(chǎn)品，具有溶液黏稠、易成膜等特點(diǎn)。甲殼素在脫除乙?；耐瑫r(shí)會(huì)引起相對(duì)分子質(zhì)量降低，因此在實(shí)驗(yàn)中要根據(jù)實(shí)際需要調(diào)控反應(yīng)條件，其制備過程如下：

在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，將5.0 g甲殼素加入到100 mL 10 mol/L的NaOH水溶液中，在100 ℃回流3 h，過濾，濾渣水洗至中性后，用3% HAc溶液攪拌溶解，過濾得上清液，再用NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至9，逐漸析出膠狀物，離心分離，產(chǎn)物干燥后即得到殼聚糖。

實(shí)驗(yàn)流程如圖2所示。

圖2 由龍蝦殼制備殼聚糖的實(shí)驗(yàn)流程圖

4.2 殼聚糖的表征

4.2.1 殼聚糖結(jié)構(gòu)表征

采用傅立葉紅外光譜儀以及核磁共振儀表征殼聚糖結(jié)構(gòu)。其中，紅外光譜測(cè)試采用KBr壓片法；核磁共振測(cè)試以TMS為內(nèi)標(biāo)、DCl/D2O (V(DCl)∶V(D2O)=4%)為溶劑。

4.2.2 殼聚糖相對(duì)分子質(zhì)量測(cè)定

4.2.3 殼聚糖脫乙酰度測(cè)定

依據(jù)殼聚糖的游離氨基能吸附碘分子并呈現(xiàn)亮紫色的特性[12]，以碘作指示劑，采用酸堿滴定法測(cè)定殼聚糖脫乙酰度。

準(zhǔn)確稱取0.3 g干燥至恒重的殼聚糖于250 mL錐形瓶中，加入30 mL 0.1 mol/L HCl標(biāo)準(zhǔn)溶液，室溫?cái)嚢柚镣耆芙?，加?0 mL蒸餾水稀釋，滴加2～3滴1% I-KI溶液。用0.1 mol/L NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至剛出現(xiàn)亮紫色顆粒狀沉淀，即為滴定終點(diǎn)，平行測(cè)定3次，按以下公式計(jì)算脫乙酰度(DD)[13]。

(1)

(2)

式中w(NH2)為—NH2的質(zhì)量分?jǐn)?shù)；c1為標(biāo)準(zhǔn)鹽酸溶液濃度(單位為mol/L)；V1為加入的標(biāo)準(zhǔn)鹽酸溶液體積(單位為mL)；c2為標(biāo)準(zhǔn)氫氧化鈉溶液濃度(單位為mol/L)；V2為消耗的標(biāo)準(zhǔn)氫氧化鈉溶液體積(單位為mL)；G為樣品質(zhì)量(單位為g)；161為殼聚糖結(jié)構(gòu)單元對(duì)應(yīng)的摩爾質(zhì)量(單位為g/mol)；9.94%為DD=100%的殼聚糖中的氨基含量。

5 結(jié)果與討論

5.1 殼聚糖結(jié)構(gòu)表征

圖3為在上述實(shí)驗(yàn)條件下制備的甲殼素和殼聚糖的紅外譜圖。其中，甲殼素(圖3a)各主要峰歸屬如下：1654 cm-1出現(xiàn)的峰為酰胺Ⅰ帶特征吸收峰(C—O伸縮振動(dòng))，1568 cm-1出現(xiàn)的峰為酰胺Ⅱ帶特征吸收峰(N—H彎曲振動(dòng))，1320 cm-1出現(xiàn)的峰為酰胺Ⅲ帶特征吸收峰(C—N伸縮振動(dòng))。與甲殼素的紅外譜圖相比，在殼聚糖的紅外譜圖中(圖3b)，1654 cm-1的酰胺Ⅰ帶吸收峰明顯減弱，而在1572 cm-1處出現(xiàn)了很強(qiáng)的游離氨基振動(dòng)吸收峰(N—H面內(nèi)彎曲振動(dòng))，說明甲殼素成功脫除乙酰基。

圖3 甲殼素(a)和殼聚糖(b)的紅外譜圖

圖4為制備的殼聚糖樣品的核磁氫譜，各峰歸屬如下：δ: 2.68(H2)，3.25～3.45(H3, H4, H5, H6)，4.42(H1)。δ=1.82處出現(xiàn)的極弱峰歸屬為乙?；募谆鶜滟|(zhì)子，說明脫除乙酰基較為完全。核磁與紅外結(jié)果相吻合。

圖4 殼聚糖的核磁氫譜

5.2 殼聚糖相對(duì)分子質(zhì)量的測(cè)定結(jié)果

在該實(shí)驗(yàn)條件下制備的殼聚糖相對(duì)分子質(zhì)量為4.35×104。在進(jìn)行相對(duì)分子質(zhì)量和脫乙酰度測(cè)定實(shí)驗(yàn)時(shí)，要注意殼聚糖樣品的充分干燥，尤其是在對(duì)相對(duì)分子質(zhì)量較高的高脫乙酰度殼聚糖樣品進(jìn)行測(cè)量時(shí)，由于其黏度較高，所用樣品量較少(30～50 mg)，稱量誤差會(huì)導(dǎo)致測(cè)量結(jié)果出現(xiàn)較大波動(dòng)，重現(xiàn)性差。在本實(shí)驗(yàn)條件下得到的是中低相對(duì)分子質(zhì)量(1×104～1×105)的殼聚糖，黏度相對(duì)較低，測(cè)量用量較大(0.3～1.0 g)，稱量誤差對(duì)測(cè)定結(jié)果影響較小，重現(xiàn)性好。

5.3 殼聚糖脫乙酰度的測(cè)定結(jié)果

根據(jù)式(1)、式(2)計(jì)算得到該實(shí)驗(yàn)條件下制備的殼聚糖脫乙酰度為94.2%，與紅外、核磁結(jié)果所呈現(xiàn)的趨勢(shì)相符。酸堿滴定法是測(cè)定殼聚糖脫乙酰度較為簡(jiǎn)便的方法，具有成本低廉、快速準(zhǔn)確等特點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)所制備的殼聚糖特性黏度僅為37.3，屬低黏度殼聚糖，水溶性較好，因此在采用酸堿滴定法測(cè)定殼聚糖脫乙酰度時(shí)，即便在接近滴定終點(diǎn)時(shí)，體系也基本能保持較為澄清的溶液狀態(tài)；此外，實(shí)驗(yàn)中采用I-KI為指示劑，終點(diǎn)時(shí)稍過量的氫氧化鈉與殼聚糖的—NH3+(由殼聚糖的—NH2與鹽酸結(jié)合而成)反應(yīng)生成游離的—NH2，進(jìn)而與碘分子形成明亮的紫紅色n-σ型電荷轉(zhuǎn)移絡(luò)合物，振蕩不消退，使終點(diǎn)易于觀察。

6 注意事項(xiàng)

① 在甲殼素脫除乙酰基制備殼聚糖的實(shí)驗(yàn)過程中使用了熱的濃堿溶液，應(yīng)避免灼傷。

② 實(shí)驗(yàn)后應(yīng)回收酸堿廢液，不可隨意排放。

③ 在進(jìn)行相對(duì)分子質(zhì)量和脫乙酰度測(cè)定實(shí)驗(yàn)時(shí)，要注意將樣品充分干燥。

7 教學(xué)建議

① 殼聚糖相對(duì)分子質(zhì)量以及脫乙酰度的變化對(duì)其晶體結(jié)構(gòu)、水溶性、成膜性能、降解速率等均有顯著影響[14]，學(xué)生可采取以小組為單位的方式，設(shè)計(jì)單因素分析法的實(shí)驗(yàn)方案，分別從反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度、體系pH的調(diào)控等方面進(jìn)行考察，設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，并分析各種因素的影響規(guī)律。

② 測(cè)定殼聚糖脫乙酰度的方法較多，主要分為三大類，第一類是利用胺基的化學(xué)性質(zhì)，如易質(zhì)子化、易與醛基反應(yīng)生成希夫堿等，可采用酸堿滴定法、電位滴定法、膠體滴定法等進(jìn)行脫乙酰度的測(cè)定；第二類是利用胺基以及甲殼素/殼聚糖的波譜學(xué)特性，如酰胺基團(tuán)在紫外光譜、紅外光譜中的特征吸收峰等，可采用紅外光譜法、紫外光譜法、核磁共振波譜法等進(jìn)行脫乙酰度的測(cè)定；第三類是采用破壞樣品法，即元素分析法、色譜法、熱分析法等進(jìn)行脫乙酰度的測(cè)定[15-16]。在實(shí)驗(yàn)過程中，學(xué)生可采取橫向合作的方式，采用不同方法測(cè)定脫乙酰度，并比較各種方法的最佳適用體系及優(yōu)劣性。

③ 實(shí)驗(yàn)報(bào)告以論文的形式完成，以達(dá)到綜合考察學(xué)生撰寫科技論文的目的。報(bào)告正文包括:實(shí)驗(yàn)背景介紹及原理；采取的研究方法和技術(shù)路線；實(shí)驗(yàn)結(jié)果與數(shù)據(jù)分析；實(shí)驗(yàn)總結(jié)與改進(jìn)。

8 實(shí)驗(yàn)總結(jié)

本文介紹的“殼聚糖的制備與表征”實(shí)驗(yàn)涉及了球磨機(jī)的使用，氮?dú)獗Ｗo(hù)下的熱回流裝置的搭建，核磁、紅外光譜分析，以及黏度、脫乙酰度測(cè)定等相關(guān)知識(shí)和技能，是一個(gè)集制備和表征為一體的研究型綜合化學(xué)實(shí)驗(yàn)。在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與實(shí)施過程中，學(xué)生運(yùn)用所掌握的知識(shí)和技能，將飲食廢棄物蝦殼變?yōu)榫哂袘?yīng)用價(jià)值的殼聚糖，在熟悉的生活情境中感悟化學(xué)的魅力，認(rèn)識(shí)與領(lǐng)悟化學(xué)和社會(huì)生活的聯(lián)系，提升實(shí)驗(yàn)興趣。此外，由于實(shí)驗(yàn)方案為學(xué)生查閱文獻(xiàn)后自行設(shè)計(jì)，他們期待通過實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)來驗(yàn)證方案的合理性，因此學(xué)生對(duì)于問題的發(fā)現(xiàn)、分析和解決均表現(xiàn)出較強(qiáng)的欲望，再加上教師的適時(shí)指導(dǎo)和啟發(fā)，他們的求知欲和實(shí)驗(yàn)積極性均得到較好提升。該實(shí)驗(yàn)原料經(jīng)濟(jì)易得、趣味性強(qiáng)、反應(yīng)條件溫和、重現(xiàn)性好，已在“化學(xué)科研基礎(chǔ)訓(xùn)練”課程中連續(xù)向3屆學(xué)生開設(shè)，取得了較好的教學(xué)效果，是一個(gè)適合低年級(jí)本科生的研究型綜合化學(xué)實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目。

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A Research-oriented Comprehensive Experiment Related to Materials*——The Preparation and Characterization of Chitosan

Huang Wei**Li Weiwei Zheng Yuan

(ChemistryExperimentTeachingCenter,UniversityofScienceandTechnologyofChina,Heifei230026,Anhui,China)

"The preparation and characterization of chitosan" was set up as a research-oriented comprehensive experiment in the course of Primary Training of Chemical Research in the summer semester of USTC. With the local lobster shell as the raw material, we inquired into the preparation of chitosan after a series of reactions such as deproteinization, desalination, decoloration and deacetylation. The physicochemical properties of chitosan were characterized by FT-IR,1H-NMR, viscosity measurement and titrametry.

Lobster shell; Chitosan; Preparation and characterization; Research-oriented; Comprehensive chemical experiment

10.3866/pku.DXHX20150657

*通訊聯(lián)系人, E-mail:hwnk@ustc.edu.cn 李維維 鄭媛 (中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)化學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心 安徽合肥 230026)

2013年安徽省重大教學(xué)改革項(xiàng)目(No.2013zytz003); 2012年安徽省教學(xué)研究項(xiàng)目(No.2012jyxm020); 2014年度中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)本科教學(xué)研究項(xiàng)目

O6-3; G64