鄧岳，劉阿娜，王小明，周洪雷，李運倫，蔣海強

(1. 山東中醫(yī)藥大學，濟南 250355； 2. 山東中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院高血壓病中醫(yī)臨床研究中心，濟南 250011；3. 山東中醫(yī)藥大學實驗中心，濟南 250355)

HPLC-TOF-MS分析澤瀉提取物中三萜類化合物*

鄧岳1，劉阿娜1，王小明1，周洪雷1，李運倫2，蔣海強3

(1. 山東中醫(yī)藥大學，濟南 250355； 2. 山東中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院高血壓病中醫(yī)臨床研究中心，濟南 250011；3. 山東中醫(yī)藥大學實驗中心，濟南 250355)

分析和鑒定澤瀉提取物中的化學成分。釆用高效液相色譜與飛行時間質譜聯(lián)用技術(HPLC-TOF-MS)，在正離子檢測模式下用全掃描方式獲得高分辨質譜數(shù)據(jù)，結合Agilent Mass Hunter Qualitative Analysis軟件、PCDL、數(shù)據(jù)庫和參考文獻，總結已知化學成分的質譜裂解規(guī)律，對澤瀉中的三萜類成分進行定性鑒別。澤瀉提取物中共鑒定了22種三萜化合物。實驗結果為澤瀉的物質基礎及質量控制研究提供了理論依據(jù)。

澤瀉；三萜類；化學成分；高效液相色譜與飛行時間質譜聯(lián)用技術

澤瀉為澤瀉科植物澤瀉[Alisma orientalis (Sam.) Juzep.]的干燥塊莖，性寒味甘，具有利水滲濕、泄熱的功效，可用于小便不利、水腫脹滿、痰飲眩暈、高脂血等癥［1］。現(xiàn)代研究表明其具有利尿［2］、降血脂［3］、抗氧化、保肝［4］的作用。三萜類化合物是澤瀉的主要化學成分，如澤瀉醇A(alisol A)及其衍生物24-乙酰澤瀉醇A等，具有一系列藥理活性［5-7］。高效液相色譜與飛行時間質譜聯(lián)用(HPLC-TOF-MS)法分辨能力強，在全掃描的模式下可保證微量成分不被遺失，從而獲得大量、有效的化合物結構鑒定信息，是一種快速有效的化合物鑒定方法［8-9］。

目前對澤瀉整體藥效機制評價與總體藥物化學成分研究較多，但采用HPLC-TOF-MS法對其中的三萜類化合物的系統(tǒng)研究尚不多見。因此為了進一步明確澤瀉的藥效物質基礎，筆者對澤瀉的有效成分進行了提取，采用HPLC-TOF-MS法對澤瀉提取物中的三萜類化合物進行全面系統(tǒng)的定性鑒定，建立藥材質譜指紋圖譜，為澤瀉的綜合利用開發(fā)提供理論參考。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

高效液相色譜-飛行時間質譜儀：Agilent 1260 LC-6230 TOF-MS型，美國安捷倫公司；

純水系統(tǒng)：Milli-Q型，美國Millipore公司；

分析天平：CP225D型，德國SARTORIUS公司；

澤瀉藥材：澤瀉的干燥塊莖；

24-乙酰澤瀉醇A對照品：批號18674-16-3，20 mg／支，純度不小于98%，色譜純，北京寶賽希望生物科技有限公司；

23-乙酰澤瀉醇B對照品：批號26575-95-1，20 mg／支，純度不小于98%，北京寶賽希望生物科技有限公司；

乙腈、甲醇：色譜純，德國Merck公司；

甲酸：色譜純，美國Fisher公司；

實驗用水為超純水；

實驗用其它試劑均為分析純。

1.2 對照品溶液的制備

取24-乙酰澤瀉醇A及23-乙酰澤瀉醇B對照品適量，精密稱定，加甲醇溶解，定容至25 mL容量瓶中，稀釋至所需濃度，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾后備用。

1.3 供試品溶液的制備

將干燥的澤瀉藥材1.0 kg粉碎，過3號篩。每次準確稱取澤瀉粗顆粒500 g，加入以10倍藥材量的95%乙醇加熱回流提取3次，每次1.0 h，合并提取液，回收乙醇。藥渣再以10倍量的水加熱回流提取3次，每次1 h，合并提取液，蒸發(fā)水分。合并提取物并濃縮為浸膏(每mL含有1 g澤瀉生藥)。將藥材浸膏用甲醇溶解、稀釋，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾，即得濃度為50 mg／mL的澤瀉供試品溶液。

1.4 色譜條件

色 譜 柱：Halo C18柱(100 mm×2.1 mm，2.7 μm，美國AMT公司)；柱溫：25℃；流動相：0.1%甲酸水溶液(A)-乙腈(B)，流速為0.3 mL／min；進樣體積：2 μL；梯度洗脫：0～3 min 5% B，3～12 min 5%～12% B，12～29 min 12%～16% B，29～39 min 16%～18% B，39～49 min 18%～21% B，49～53 min 21%～25% B，53～58 min 25%～30% B，58～65 min 30%～36% B，65～73 min 36%～42% B，73～79 min 42%～52% B，79～83 min 52%～65% B，83～98 min 65%～75% B，98～100 min 100% B。

1.5 質譜條件

采用ESI離子源，在正離子模式下進行檢測。毛細管電壓：4 000 V；干燥氣流速：11 L／min；噴霧氣壓力：241.3 kPa(35 psi)；干燥氣溫度：350℃；碎片電壓：90，180，30，360 V；數(shù)據(jù)采集范圍：m／z50～1 000；選取m／z121.050 9，922.009 8的內標離子作參比離子。每次測定樣品前，采用調諧液(Turning mixture)校準質量軸。

2 結果與討論

2.1 藥材提取方法的建立

澤瀉藥材發(fā)揮其藥理作用的有效成分主要為澤瀉三萜類化合物，屬于醇溶性物質，大多采用乙醇提取工藝［10-12］。采用10倍量乙醇加熱回流提取，為最大限度地避免目標成分的遺失，再對藥渣采取10倍量的水加熱回流提取，使藥材中可能存在的苷類物質也能被提取得到。

2.2 流動相的選擇

在流動相的篩選過程中，使用乙腈作為有機相，水相的選擇分別對正離子模式下0.1%甲酸溶液，3 mmol/L乙酸銨溶液，3 mmol/L乙酸銨-0.2%乙酸溶液，5 mmol/L乙酸銨-0.1% 氨水（pH 7.0）體系及負離子模式下的0.1%甲酸溶液進行考察。結果表明采用正離子模式下0.1%甲酸溶液可以獲得較好的峰形和分離度，質譜響應良好。故選用正離子模式下0.1%甲酸溶液-乙腈作為流動相進行梯度洗脫。

2.3 碎裂電壓的選擇

在質譜分析過程中同時設置90，180，300，360 V 4個離子源內碎裂電壓，使化合物分子吸收能量后產生電離，生成分子離子，之后進一步按照化合物自身特有的碎裂規(guī)律分裂，適當增加碎裂電壓，減少簇離子的產生，并同時得到一系列典型的與結構相關的碎片離子信息，便于質譜數(shù)據(jù)的解析。

2.4 定性方法的建立

2.4.1 數(shù)據(jù)處理軟件

澤瀉中存在的萜類成分極性較小，在95 min內得到了較好的有效分離，正離子模式下的特征離子主要為［M+H］+和［M+Na］+，通過一級質譜獲得了高分辨的質核比，利用Agilent Mass Hunter Qualitative Analysis軟件在查找到化合物的精確質量數(shù)后，將質譜測量誤差設置在±5×10-6范圍內，計算出該質荷比所代表的化合物可能的元素組成，篩選最可能的化合物分子式，觀察其同位素分布情況并進行驗證。

2.4.2 數(shù)據(jù)庫的建立

通過澤瀉化學成分研究文獻及NCBI，CNKI，CA國內外專業(yè)數(shù)據(jù)庫等收集了澤瀉［6-7，13-19］中的106個化合物，采用安捷倫PCDL軟件建立包括化合物名稱、分子式、精確相對分子質量的相應的化學成分數(shù)據(jù)庫。通過檢索PCDL化合物數(shù)據(jù)庫以及與文獻總結中列出的化學成分再次比對，初步推斷澤瀉供試品溶液中的化學成分。

2.4.3 標準品比對

采用標準品23-乙酰澤瀉醇B及24-乙酰澤瀉醇A在相同條件下進行對照試驗，通過與對照品的保留時間、分子離子和特征碎片離子比對可以確定，在正離子模式下91.077，84.473 min處分別為23-乙酰澤瀉醇B及24-乙酰澤瀉醇A。

2.5 成分鑒定結果

澤瀉提取物的HPLC-TOF-MS總離子流圖見圖1。三萜類成分結構母核相同，是一類基本母核由30個碳原子組成的化合物。澤瀉中的三萜類成分多為原萜烷型四環(huán)三萜［5］，其結構具有一定的特征，如C-10位和C-14位上有β-CH3，C-20位上有S構型等，在質譜裂解中呈現(xiàn)一定的規(guī)律性。TOF-MS質譜數(shù)據(jù)及歸屬見表1，共鑒別出22種化合物。

圖1 澤瀉提取物的HPLC-TOF／MS總離子流圖

表1 澤瀉的化學成分鑒別結果

續(xù)表1

3 結語

采用HPLC-TOF-MS法對澤瀉提取物中的三萜類成分進行了系統(tǒng)的化學成分分析，共計鑒別了22種化合物，初步確定了澤瀉提取物中的主要有效成分，為進一步深入研究澤瀉的化學成分含量及開發(fā)應用提供一定的參考。

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中物院近4.5億元科學儀器向社會開放

為進一步加速軍民融合，助力創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)，不久前，中物院大型科學儀器開放共享平臺——中物院理化分析與無損檢測協(xié)作網(wǎng)在綿陽上線。網(wǎng)站將整合中物院300余臺套，總價值近4.5億元的理化分析與無損檢測設備向社會開放共享，為全國科研院所、科技企業(yè)提供全方位的分析檢測技術服務。

此次對外開放的設備包括分析檢測、性能測試、無損檢測、計量、環(huán)境監(jiān)測等10余種類，分析檢測對象包括金屬材料、高分子材料、無機材料、放射性材料、電子材料等多種金屬及非金屬材料；檢測范圍涉及生物醫(yī)藥、電子技術、機械加工、食品安全、航空航天、環(huán)保技術、汽車制造及新材料等領域。

此前國務院印發(fā)《關于國家重大科研基礎設施和大型科研儀器向社會開放的意見》。意見指出，近年來，科研設施與儀器規(guī)模持續(xù)增長，技術水平明顯提升。同時，科研設施與儀器利用率和共享水平不高的問題也逐漸凸顯出來，閑置浪費現(xiàn)象比較嚴重。基于上述情況，意見要求，加快推進科研設施與儀器向社會開放，進一步提高科技資源利用效率。

（科學日報）

Analysis of the Triterpenes in the Extract of Alisma Orientalis (Sam.) Juzep by HPLC-TOF-MS

Deng Yue1, Liu Ana1, Wang Xiaoming1, Zhou Honglei1, Li Yunlun2， Jiang Haiqiang3
（1. Pharmacy College of Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250355， China; 2. Traditional Chinese Medicine Clinical Research Base for Hypertension of Affiliated Hospital of Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250011，
China; 3. Experimental Center of Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250355， China）

The chemical constituents of the extract of Alisma orientalis (Sam.) Juzep were analyzed and authenticated. HPLC-TOF-MS technology was applied for high resolution mass spectrometry data operated in positive ion mode in full scan mode. With Agilent Mass Hunter Qualitative Analysis software，PCDL database and references，separating components in Alisma orientalis (Sam.)Juzep，based on the summary of fragmentation regularities of known chemical composition, 22 triterpene compounds were identified. The experimental results further enrich the research content of the chemical composition and provide certain theoretical basis for material basis and quality control of Alisma orientalis (Sam.)Juzep.

Alisma orientalis (Sam.) Juzep; triterpenes; chemical constituent; HPLC-TOF／MS

O657.7

：A

：1008-6145(2015)06-0011-04

10.3969／j.issn.1008-6145.2015.06.003

*國家自然科學基金資助課題(81273700，81102549)

聯(lián)系人：蔣海強；E-mail: jhq12723@163.com

2015-07-26