彭絮，徐蓓，江紅,宋德偉

(1.北京交通大學(xué)理學(xué)院，北京 100044； 2.中國計(jì)量科學(xué)研究院化學(xué)所，北京 100013)

血清雌二醇標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研制*

彭絮1，2，徐蓓2，江紅1,宋德偉2

(1.北京交通大學(xué)理學(xué)院，北京 100044； 2.中國計(jì)量科學(xué)研究院化學(xué)所，北京 100013)

介紹高濃度血清雌二醇標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研制。采集的全血不加任何添加劑和抗凝劑，離心分離出血清，分裝。采用同位素稀釋-液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法(ID-LC-MS／MS)對(duì)高濃度血清雌二醇標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行定值及均勻性和穩(wěn)定性檢驗(yàn)，對(duì)定值不確定度進(jìn)行了評(píng)定。結(jié)果表明，高濃度血清雌二醇標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值結(jié)果為3.06 ng／g，擴(kuò)展不確定度為0.08 ng／g (k=2)，均勻性和穩(wěn)定性符合國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)技術(shù)要求。采用IFCC RELA比對(duì)樣品和歐洲標(biāo)準(zhǔn)局標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)血清17β-雌二醇標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)對(duì)定值方法進(jìn)行確認(rèn)，測(cè)量結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)偏差在該標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)量值的不確定度范圍內(nèi)。研制的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)量值經(jīng)過日本計(jì)量院驗(yàn)證，測(cè)量結(jié)果為(3.03±0.1) ng／g。該標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的量值具有溯源性和準(zhǔn)確性。

血清；雌二醇；同位素稀釋-液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法；定值；均勻性；穩(wěn)定性

血清中雌二醇含量是臨床檢測(cè)中主要的生化指標(biāo)之一，測(cè)定血清中雌二醇的含量對(duì)診斷某些婦科及內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病很有價(jià)值［1］。臨床測(cè)量雌二醇的方法主要有免疫分析方法［2-3］、高效液相色譜法［4］、氣相色譜法［5］、GC／MS法［6-7］和LC／MS／MS法［8-10］。不同的方法其測(cè)量結(jié)果間差異較大，因此需要研制相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，對(duì)實(shí)驗(yàn)儀器進(jìn)行校準(zhǔn)，以提高和保證臨床檢驗(yàn)的準(zhǔn)確性，實(shí)現(xiàn)測(cè)量結(jié)果的可溯源性和可比性。

目前國內(nèi)無相應(yīng)的血清雌二醇標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，國外只有正常濃度范圍的，沒有病理狀態(tài)下高含量的血清雌二醇標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，造成測(cè)量標(biāo)準(zhǔn)范圍窄，不能滿足臨床要求，為此筆者研制了高濃度孕婦血清雌二醇標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。采用同位素稀釋液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(ID-LC-MS／MS)法對(duì)研制的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行定值，根據(jù)ISO-Guide 35(2006)［11］及JJF 1343-2012［12］進(jìn)行均勻性、穩(wěn)定性檢驗(yàn)及定值不確定度評(píng)定。采用IFCC RELA比對(duì)JCTLM(國際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)溯源聯(lián)合委員會(huì))樣品和歐洲標(biāo)準(zhǔn)局標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)血清17β-雌二醇標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)對(duì)定值方法進(jìn)行確認(rèn)，保證了測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀：API5000型，AB應(yīng)用生物系統(tǒng)，美國ABSCIEX公司；

SPE固相萃取柱：C18Cartridges Sep-Pak VAc 3 mL(500 mg)，美國Waters公司；

10-乙基吖啶酮-2-磺酰氯(EASC)：純度為99%；

乙腈、乙酸乙酯、甲醇：色譜純；

無水碳酸鈉、碳酸氫鈉：分析純；

孕婦血清標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：冰凍混合人血清，中國軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院輸血醫(yī)學(xué)研究所；

17β-雌二醇標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(CRM578)：人血清凍干粉，歐洲標(biāo)準(zhǔn)局；

2013 IFCC RELA比對(duì)JCTLM樣品A：人血清凍干粉；

17β-雌二醇NMIJ CRM 6004-a：純度98.4%，擴(kuò)展不確定度0.3%(k=2)，日本國家計(jì)量院；

17β-雌二醇標(biāo)記物：E2-16，16，17-d3，純度99.4%，加拿大CDN isotopes公司。

1.2 血清雌二醇標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)

與中國軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院輸血醫(yī)學(xué)研究所合作制備，將采集的全血不加任何添加劑和抗凝劑，離心分離出血清，得到5項(xiàng)指標(biāo)(艾滋、梅毒、乙肝、丙肝、轉(zhuǎn)氨酶)正常的孕婦留樣血清。在無菌環(huán)境中，混合所有血清樣品，過濾除菌，邊攪拌邊分裝，用5.0 mL離心管包裝，每支2.5 mL，于-80℃冷凍保存。

1.3 定值方法

1.3.1 校準(zhǔn)溶液配制

配制17β-雌二醇標(biāo)準(zhǔn)及標(biāo)記物／乙腈儲(chǔ)備液，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10.0 ng／g，于-80℃保存。固定標(biāo)記物的量，使其中雌二醇標(biāo)準(zhǔn)與標(biāo)記物的質(zhì)量比從0.5到1.5，配制系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，于45℃下氮?dú)獯蹈珊笱苌?/p>

1.3.2 樣品處理

取血清標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)約0.3 mL于瓶中稱量，加入1.5 mL水后再分別加入含α-萘酚2 μg及炔諾孕酮31 μg (100 nmol)溶液，以E2-16，16，17-d3為內(nèi)標(biāo)，用重量法與血清標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)混合，加入量與對(duì)應(yīng)校準(zhǔn)曲線中的量相同，再加入0.5 mol／L乙酸鈉緩沖液0.4 mL(pH5.0)，混勻后在室溫下平衡2 h。

采用固相萃取(SPE)法提取雌二醇。常規(guī)潤(rùn)洗活化后上樣，用20 mL水淋洗并抽干，2.5 mL甲醇洗脫。洗脫液以氮?dú)庥?5℃吹干后用0.5 mL 0.1 mol／L Na2CO3-NaHCO3(pH10.5)緩沖液復(fù)溶，再用3 mL乙酸乙酯萃取凈化2次，氮?dú)獯蹈?。用乙腈?fù)溶后，加入0.1 mol／L Na2CO3-NaHCO3(pH10.5)緩沖液，10-乙基吖啶酮-2-磺酰氯(EASC)進(jìn)行衍生(60℃反應(yīng)3 min)，冷卻后加入乙腈-水(體積比1∶1)，衍生樣品用0.22 μm有機(jī)濾膜過濾后進(jìn)行液相色譜-質(zhì)譜測(cè)定。

1.3.3 定值測(cè)定條件

(1)色譜 條 件。 色譜柱：Agilent ZORBAX ECLIPSE XDB-C18柱 (2.1 mm×150 mm，5 μm)；流動(dòng)相：A相為0.1%甲酸水溶液，B相為0.1%甲酸乙腈溶液，梯度洗脫：0→15 min，40%→100%B，15→17 min，100%B，流量為0.3 mL／min；色譜柱溫度：30℃。

(2)質(zhì)譜條件。ESI源，正離子多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)掃描(MRM)模式；MRM監(jiān)測(cè)的母離子、子離子質(zhì)荷比(m／z)分別為17β-E2 558→223，E2-16，16，17-d3561→223；噴霧電壓(IS)：5 000V；溫度：550℃；去簇電壓(DP)：150 V；射入電壓(EP)：10 V；CE：558→223(58 V)；561→223(60 V)；碰撞室射出電壓(CXP)：13 V；氣簾氣壓力(CUR)：0.07 Pa；霧化氣壓力(Gas1)：0.38 Pa；輔助氣壓力(Gas2)：0.34 Pa；碰撞氣壓力(CAD)：0.07 Pa。

2 均勻性檢驗(yàn)及定值結(jié)果

從分裝的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中隨機(jī)抽取10瓶，每一瓶測(cè)定3個(gè)子樣；采用單因素方差分析法評(píng)估樣品的均勻性［11-12］。

組間方差和：

組內(nèi)方差之和：

其中n，m，N為每個(gè)樣品測(cè)量次數(shù)、組數(shù)和樣品總測(cè)量個(gè)數(shù)；s1，s2為組間和組內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)偏差；v1，v2為自由度。

根據(jù)自由度(v1，v2)及給定的顯著水平α，可由F分布臨界值表查得臨界值Fα。若F＜Fα，則認(rèn)為數(shù)據(jù)組間無明顯差異。

每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)樣品與其標(biāo)準(zhǔn)溶液同一批測(cè)定。樣品重復(fù)進(jìn)樣3次，計(jì)算結(jié)果的平均值作為有效數(shù)據(jù)。先測(cè)定1.3.1中由低到高的系列校準(zhǔn)溶液，通過不同質(zhì)量比下得到的質(zhì)譜響應(yīng)峰面積比對(duì)其質(zhì)量比做圖，得到校準(zhǔn)曲線，再對(duì)血清樣品進(jìn)行測(cè)定，將測(cè)得的質(zhì)譜響應(yīng)峰面積比代入校準(zhǔn)曲線方程，計(jì)算出雌二醇與雌二醇標(biāo)記物的質(zhì)量比，從而得到該血清樣品中雌二醇的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。圖1為血清中雌二醇與雌二醇標(biāo)記物的選擇離子色譜圖，測(cè)定結(jié)果見表1。

圖1 血清中17β-雌二醇與17β-雌二醇標(biāo)記物的選擇離子色譜圖

表1 血清雌二醇標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值測(cè)量結(jié)果

根據(jù)表1數(shù)據(jù)計(jì)算得總平均值為3.06 1 ng／g，因此血清樣品中雌二醇標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的定值結(jié)果約等于3.06 ng／g，瓶間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.009%。

由均勻性檢驗(yàn)數(shù)據(jù)可按公式計(jì)算出瓶間方差和、瓶?jī)?nèi)方差和、F值：

瓶間：Q1=0.020 75，v1=m-1=9，s12=0.002 31；

瓶?jī)?nèi)：Q2=0.016 69，v2=N-m=21，s22=0.000 83；

計(jì)算得F=2.78。

查表得Fα=3.71，F(xiàn)＜Fα，可以判定研制的血清雌二醇標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)是均勻的。

3 穩(wěn)定性考察

依據(jù)文獻(xiàn)［12-13］對(duì)血清樣品進(jìn)行穩(wěn)定性考察，在6個(gè)月內(nèi)對(duì)血清中雌二醇測(cè)定3次，每次隨機(jī)取3支血清樣品，用t檢驗(yàn)法進(jìn)行穩(wěn)定性評(píng)價(jià)。

s——測(cè)量方法的標(biāo)準(zhǔn)偏差；

tα(n-1)——t檢驗(yàn)臨界值；

n——測(cè)量次數(shù)。

表2 血清雌二醇標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)穩(wěn)定性考察結(jié)果

4 定值結(jié)果的不確定度評(píng)定

血清中17β-雌二醇定值結(jié)果的不確定度，由A類不確定度與B類不確定度組成，包括測(cè)量結(jié)果的重復(fù)性引入的不確定度，稱量引入的不確定度，線性回歸、均勻性等引入的不確定度等［14］，各不確定度分量評(píng)定結(jié)果見表3。

經(jīng)計(jì)算，相對(duì)合成不確定度：urel=1.3%，不確定度：u=1.3%×3.06 ng／g=0.04 ng／g。

定值結(jié)果的擴(kuò)展不確定度：U=uk=0.08 ng／g，k=2。

表3 定值不確定度分量

5 定值方法驗(yàn)證

采用ID-LC-MS／MS方法測(cè)定了2013 IFCC RELA比對(duì)JCTLM樣品A及歐洲標(biāo)準(zhǔn)局標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)血清中17β-雌二醇標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)CRM 578［15］，測(cè)定結(jié)果見表4。由表4可知，測(cè)定結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)偏差在標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)量值不確定度范圍內(nèi)。研制的血清中雌二醇標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)經(jīng)過日本計(jì)量院測(cè)量比對(duì)，測(cè)量結(jié)果為(3.03±0.1) ng／g。

表4 雌二醇比對(duì)樣品及標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)測(cè)量結(jié)果

6 結(jié)語

研制了高濃度血清雌二醇標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，采用同位素稀釋-液相色譜質(zhì)譜法(ID-LC-MS／MS)對(duì)其進(jìn)行了定值，按照國際、國內(nèi)的技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)和規(guī)范進(jìn)行了均勻性、穩(wěn)定性檢驗(yàn)及其不確定度的評(píng)定；采用2013 IFCC RELA比對(duì)JCTLM樣品和歐洲標(biāo)準(zhǔn)局標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)血清17β-雌二醇標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行了方法驗(yàn)證，測(cè)量結(jié)果可溯源到JCTLM認(rèn)可的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，并經(jīng)過國際同行的驗(yàn)證，保證了標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的溯源性和量值的準(zhǔn)確。

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［14］ JJF 1135-2005 化學(xué)分析測(cè)量不確定度評(píng)定［S］.

［15］ ECSC-EC-EAEC(Brussels) The certification of estradiol-17βin three lyophilized serum materials(CRM576，CRM577 and CRM578)［S］.

RoHS測(cè)試方法又發(fā)布IEC 62321-6: 2015

IEC 62321-6：2015版本于2015年6月5日正式發(fā)布，即多溴聯(lián)苯和多溴聯(lián)苯醚的確認(rèn)測(cè)試方法。

IEC 62321-1: 2013 簡(jiǎn)介和概述；

IEC 62321-2: 2013 樣品的拆卸，拆解和機(jī)械拆分；

IEC 62321-3-1: 2013 使用XRF對(duì)電子產(chǎn)品中的鉛、鎘、汞、總鉻和總溴進(jìn)行篩選；

IEC 62321-3-2: 2013 使用C-IC對(duì)聚合物和電子產(chǎn)品中的總溴進(jìn)行篩選；

IEC 62321-4: 2013 使 用CV-AAS，CV-AFS，ICPOES，ICP-MS確定聚合物、金屬和電子材料中的汞；

IEC 62321-5: 2013 使用AAS，AFS，ICP-OES，ICPMS確定聚合物和電子材料中的鎘、鉛和鉻，以及確認(rèn)金屬材料中的鎘和鉛；

IEC 62321-6: 2015 使用GC-MS，IAMS和HPLC測(cè)定聚合物和電子材料中多溴聯(lián)苯和多溴聯(lián)苯醚。

(儀器信息網(wǎng))

Development of Serum 17β-estradiol Reference Material

Peng Xu1，2， Xu Bei2， Jiang Hong1， Song Dewei2
(1.College of Science， Beijing Jiaotong University， Beijing 100044， China；2.Division of Chemistry， National Institute of Metrology， Beijing 100013， China)

The development of high concentration of serum 17β-estradiol reference material was introduced. The serum standard samples were isolated from collected blood by certain conditions before packing，the checking of uniformity，stability test and certified value were systematically studied by ID-LC-MS／MS. The uncertainty of determination was evaluated. The results showed that the certified value of the reference material of high concentration of serum 17β-estradiol reference material was 3.06 ng／g with an relative expanded uncertainty of 0.08 ng／g (k=2). The uniformity and stability of the reference material of serum 17β-estradiol could meet the technical requirements of the standard reference material. IFCC RELA sample and European Commission CRM were used for confirmation of dermination method, and the standard deviation of analysis result was in the range of uncertainty. The 17β-estradiol reference material value was proven by the Metrology Institute of Japan, and the detection result was (3.03±0.1) ng／g. The quantity value of the reference material is traceable and accuracy.

serum; estradiol; ID-LC-MS／MS; certification; homogeneity; stability

O656

：A

：1008-6145(2015)04-0001-04

10.3969／j.issn.1008-6145.2015.04.001

*國家科技基礎(chǔ)條件平臺(tái)工作項(xiàng)目(2011FY130100)

聯(lián)系人：徐蓓；E-mail: xubei@nim.ac.cn

2015-03-25