范婷婷,唐良萏

(1.重慶市合川區(qū)人民醫(yī)院婦科，重慶合川 401520；2.重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院婦產(chǎn)科，重慶 400016)

沉默Nek2基因?qū)β殉舶㏒KOV3細胞周期的影響

范婷婷1,唐良萏2△

(1.重慶市合川區(qū)人民醫(yī)院婦科，重慶合川 401520；2.重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院婦產(chǎn)科，重慶 400016)

目的 研究RNA干擾NIMA相關(guān)激酶2(Nek2)表達對卵巢癌細胞SKOV3細胞周期的影響及其相關(guān)的分子機制。方法將針對Nek2基因的siRNA轉(zhuǎn)染至SKOV3細胞中，采用流式細胞技術(shù)檢測SKOV3細胞周期變化，并用Western blot技術(shù)檢測Nek2-siRNA轉(zhuǎn)染入卵巢癌SKOV3細胞48 h后，與細胞周期相關(guān)的因子cyclinB1、CDK1及P27蛋白表達水平以及ERK1/2磷酸化水平的變化。結(jié)果空白對照組、陰性對照組和RNA干擾組中處于G2/M期的細胞比例分別為13.72%、12.27%和1.56%，與兩對照組比較，處于G2/M期的干擾組細胞明顯減少(P<0.05)。Nek2基因沉默后，與兩對照組比較，SKOV3細胞內(nèi)cyclinB1和CDK1的蛋白表達水平明顯下降，P27的蛋白表達水平明顯上調(diào)，SKOV3細胞內(nèi)ERK1/2磷酸化水平明顯下降(P<0.05)。結(jié)論沉默Nek2基因，可阻止卵巢癌SKOV3細胞啟動有絲分裂，從而抑制其增殖。

RNA干擾；卵巢腫瘤；細胞周期；NIMA相關(guān)激酶

近年來，抗體芯片技術(shù)為腫瘤的早期診斷、腫瘤標志物的篩選鑒定以及藥物治療等方面提供了新的研究平臺，尤其在對腫瘤標志物的篩選和鑒定中運用最為廣泛。在前期實驗中，本課題組通過反向捕獲抗體芯片技術(shù)篩查發(fā)現(xiàn)NIMA相關(guān)激酶2(NIMA-related kinase2,Nek2)在卵巢癌中高表達，且NEK2-siRNA能有效抑制SKOV3細胞中Nek2的表達。由于Nek2是細胞周期Nek家族成員之一，在細胞周期中，其表達及活性高度保守。因此，本實驗將利用NEK2-siRNA進一步研究Nek2基因與卵巢癌SKOV3細胞周期的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1材料 卵巢漿液性乳頭狀囊腺癌細胞株SKOV3由第三軍醫(yī)大學大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所饋贈。Nek2、P27、cyclinB1、CDK1一抗均購自Abcam公司。Trizol、Lipofectamine 2000購自Invitrogen公司。根據(jù)Nek2基因序列，由上海吉瑪公司設計合成Nek2-siRNA序列，上游引物：5′-GGC ACA CCU UAU UAC AUG UTT-3′，下游引物：5′-ACA UGU AAU AAG GUG UGC CTT-3′。

1.2方法

1.2.1細胞轉(zhuǎn)染及分組 (1)細胞轉(zhuǎn)染：在37 ℃、5%CO2飽和濕度的條件下，用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液培養(yǎng)SKOV3細胞。用胰酶消化對數(shù)生長期細胞，制備成細胞懸液，將細胞按30%～50%密度接種于6孔板，培養(yǎng)過夜。轉(zhuǎn)染過程：首先制備siRNA/脂質(zhì)體復合物，于室溫放置20 min；然后轉(zhuǎn)染細胞，混勻后放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h后觀察轉(zhuǎn)染情況。(2)細胞分組：將實驗細胞分為3組，轉(zhuǎn)染Nek2-siRNA的SKOV3細胞為干擾組，轉(zhuǎn)染陰性對照序列的為陰性對照組，未經(jīng)任何處理的為空白對照組。轉(zhuǎn)染48 h后，用胰酶消化收集細胞，進行以下實驗。

1.2.2流式細胞儀檢測細胞周期 轉(zhuǎn)染48 h后收集細胞，使每個樣本細胞約為1×106個。棄上清液，于離心管中加入70%的預冷乙醇1 mL，吹打均勻，4 ℃固定12 h以上。檢測前1 000 r/min離心5 min，吹散細胞后用30D尼龍濾過膜過濾，減少聚在一起的細胞。用0.5 mL PBS重懸細胞，加入RNA酶，使其終濃度為50 μg/mL，37 °C孵育30 min，冰浴終止酶作用。加入5 μL 濃度為100 μg/mL碘化丙啶(PI)溶液，室溫中避光染色30 min，最后采用流式細胞儀檢測細胞周期，實驗重復3次。

1.2.3Western blot法檢測轉(zhuǎn)染后的SKOV3細胞中P27、cyclinB1、CDK1及pERK1/2蛋白表達的變化 提取各組總蛋白，進行蛋白定量，取等量樣本30 μg上樣于10%的聚丙烯酰胺凝膠電泳，然后轉(zhuǎn)膜。取出轉(zhuǎn)移好的PVDF膜，確定轉(zhuǎn)膜成功后，封閉，加一抗(1∶200)或β-actin抗體(1∶1 000)，4 ℃孵育過夜。加入二抗(1∶5 000)，室溫下脫色搖床上搖動封閉90 min，化學發(fā)光顯影。最后利用柯達數(shù)字科學圖像分析軟件測定蛋白印跡條帶凈灰度值，以β-actin為內(nèi)參照，計算二者的比值即為目的蛋白的相對表達水平。

2 結(jié) 果

2.1Nek2-siRNA干擾后對卵巢癌SKOV3細胞周期的影響 轉(zhuǎn)染Nek2-siRNA 48 h后，用流式細胞儀檢測SKOV3細胞周期結(jié)果表明，抑制Nek2的表達后，空白對照組、陰性對照組和干擾組處于G2/M期的細胞比例分別為：13.72%、12.27%和1.56%，干擾組細胞在S→G2轉(zhuǎn)換時受到抑制，處于G2/M期的干擾組細胞明顯減少，(P<0.05)，見圖1。

1.空白對照組；2.陰性對照組；3.干擾組。

圖1 流式細胞儀檢測細胞周期(n=3)

1.空白對照組；2.陰性對照組；3.干擾組；a：P<0.05，與干擾組比較。

圖2 3組SKOV3細胞中cyclinB1等表達比較(n=3)

1：空白對照組；2：陰性對照組；3：干擾組；a：P<0.05，與干擾組比較。

圖3 3組SKOV3細胞中pERK1/2表達比較(n=3)

2.2NEK2-siRNA干擾后SKOV3細胞中cyclinB1、CDK1和P27蛋白表達的變化 Nek2-siRNA轉(zhuǎn)染SKOV3細胞48 h后，cyclinB1、CDK1的表達明顯下調(diào)，P27的表達明顯上調(diào)(P<0.05)，見圖2。

2.3NEK2-siRNA干擾后SKOV3細胞中磷酸化ERK1/2(pERK1/2)表達的變化 Nek2-siRNA轉(zhuǎn)染SKOV3細胞48 h后，與空白、陰性對照組比較，pERK1/2的表達水平明顯降低(P<0.05)，見圖3。

3 討 論

Nek2是Nek家族成員之一，目前該家族擁有11個家族成員(Nek1～11)，它們具有相似的催化序列，其中因Nek2與NIMA的同源性最高而備受關(guān)注。Nek2屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，定位于中心體，有著激酶區(qū)域的氨基末端以及未催化調(diào)節(jié)區(qū)域的羧基末端，并通過磷酸化C-Nap1、rootletin、Nlp等底物調(diào)節(jié)紡錘體的形成和分離[1-2]。

近年來的研究表明，Nek2是協(xié)調(diào)中心體結(jié)構(gòu)和功能的重要因子，其通過與中心體蛋白的相互作用參與微管組裝并維持微管穩(wěn)定，進而維持中心體的穩(wěn)定[3]；通過磷酸化C-Nap1、rootletin、Nlp等底物調(diào)節(jié)紡錘體的形成和分離[1-2]；通過磷酸化高遷移率族蛋白(high-mobility group protein A2,HMGA2)參與染色質(zhì)的凝集；通過與Hec1、Mad1、Mda2的相互作用控制紡錘體檢查點[4-5]。Nek2表達水平具有周期依賴性，G1期時Nek2表達水平很低，但在G1/S間期其表達水平迅速上升3～4倍，并且在整個S期和G2期都保持這種高表達水平，一旦進入M期，Nek2的表達水平迅速降低[6]。由于Nek2的表達與細胞周期進程密切相關(guān)，本實驗利用流式細胞技術(shù)來探索Nek2基因沉默后對SKOV3細胞周期的影響。本檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與兩對照組比較，Nek2表達的下降導致細胞周期分布出現(xiàn)異常，干擾組細胞在S→G2轉(zhuǎn)換時受到抑制，處于G2/M期細胞明顯減少。本結(jié)果表明，基因沉默Nek2可使SKOV3 細胞進入G2/M期受阻，導致細胞最后不能順利通過有絲分裂期，進入下一個細胞周期，從而使細胞增殖能力降低。

有研究發(fā)現(xiàn)，Nek2定位于中心體并參與調(diào)節(jié)有絲分裂[7]，其在S期和G2期保持高表達水平，具有明顯的周期依賴性[6]。結(jié)合流式檢測結(jié)果可知，抑制Nek2的表達對SKOV3細胞進入G2/M期有明顯影響。因此，本實驗選擇cyclinB1、CDK1和P27進行Western blot檢測，初步探討Nek2影響細胞周期的有關(guān)機制。實驗結(jié)果表明，Nek2-siRNA轉(zhuǎn)染SKOV3細胞48 h后，cyclinB1和CDK1的蛋白表達水平較空白對照組明顯下降，P27的蛋白表達水平明顯上調(diào)。根據(jù)結(jié)果可推測，Nek2基因沉默后，通過對G2/M檢查點關(guān)鍵因子cyclinB1和CDK1以及對抑癌基因P27的調(diào)控，抑制SKOV3細胞進入G2/M期，從而不能啟動有絲分裂，無法進入下一個細胞周期，因此抑制了細胞增殖。Scott等[8]對漿液性卵巢腫瘤組織進行研究發(fā)現(xiàn)，cyclinB1的表達水平隨著卵巢腫瘤惡性程度的增加而增加。有研究證明，cyclinB1在多種惡性腫瘤中高表達，如胃癌、乳腺癌、淋巴瘤等[9-11]，由此可知cyclinB1與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。因此，本實驗認為可通過Nek2基因沉默使SKOV3細胞中cyclinB1的表達水平下降，從而達到抑制腫瘤細胞生長的目的。

細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extrallular signal regulated protein kinase,ERK)是絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)家族成員之一，細胞內(nèi)許多信號因子最終都是通過磷酸化ERK來發(fā)揮作用，可以說ERK是調(diào)節(jié)細胞生長發(fā)育的信號網(wǎng)絡核心，調(diào)控著細胞的增殖、分化和凋亡等重要的生物學過程[12]。近年來的研究證明ERK信號通路不僅參與對細胞周期G1/S的調(diào)節(jié)，而且參與對G2/M期調(diào)控[13-14]。為研究Nek2通過何種信號轉(zhuǎn)導通路來調(diào)控SKOV3細胞的各種生物學行為，本實驗對ERK1/2的磷酸化水平進行檢測，結(jié)果表明，Nek2-siRNA轉(zhuǎn)染入SKOV3細胞48 h后，與空白對照組比較，pERK1/2的表達水平明顯降低，說明Nek2依賴ERK信號通路發(fā)揮作用。

綜上所述，使用RNAi技術(shù)特異性沉默Nek2基因能夠有效抑制細胞周期相關(guān)因子cyclinB1和CDK1的蛋白表達，同時使P27蛋白表達增加，從而抑制SKOV3細胞進入G2/M期，使其無法啟動有絲分裂，因此抑制了細胞增殖。根據(jù)以上研究結(jié)果可推測，通過對Nek2基因進一步的深入研究，使其有望成為臨床上監(jiān)測卵巢癌發(fā)生、發(fā)展以及評估預后的新的標記物。Nek2基因及其信號轉(zhuǎn)導通路中的相關(guān)因子可作為抑制卵巢癌轉(zhuǎn)移和復發(fā)的重要靶點。

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Effect of silencing Nek2 gene on cell cycle of ovarian cancer SKOV3 cells*

FanTingting1,TangLiangdan2△

(1.DepartmentofGynecology,HechuanDistrictPeople′sHospital,Chongqing401520,China;2.DepartmentofGynecologyandObstetrics,FirstAffilliatedHospitalofChongqingMedicalUniversity,Chongqing400016,China)

Objective To study the effect of silencing Nek2 via RNAi on cell cycle of ovarian cancer SKOV3 cells and the related molecular mechanism.Methods The Nek2-siRNA was transfected into the ovarian cancer SKOV3 cells.The change of cell cycle of SKOV3 cells at 48 h after transfection was examined by the flow cytometry technique;Western blot assay was used to determine the change of level of the cell cycle related factors cyclinB1,CDK1,P27 and the phosphorylation level of the ERK1/2 after Nek2-siRNA transfection for 48 h.Results The flow cytometry detection results showed that the proportion of the cells in G2/M stage in the blank control group,negative control group and RNAi group was 13.72%,12.27% and 1.56% respectively.Compared with the control group,the number of the cells in G2/M stage in the transfected group was reduced obviously(P<0.05).The Western blot detection results showed that compared with the control group,the expression of cyclinB1 and CDK1 protein in SKOV3 cells was significantly reduced,the expression of P27 was increased after silencing Nek2 and the phosphorylation level of ERK1/2 in SKOV3 cells was significantly reduced after silencing Nek2 gene(P<0.05).Conclusion Silencing Nek2 gene might block the ovarian cancer cell line SKOV3 initiating mitosis,thus inhibit their proliferation.

RNA interference;ovarian neoplasms;cell cycle;NIMA-related kinase

·基礎研究

10.3969/j.issn.1671-8348.2015.11.007

教育部博士點基金資助項目(20080631001)；重慶市衛(wèi)生局重點項目(2009-1-59)。

范婷婷(1979-)，主治醫(yī)師，博士研究生，主要從事婦科腫瘤的診治研究。

△通訊作者，Tel：(023)89011092；Email:ldtang2002@yahoo.com.cn。

R737.31

A

1671-8348(2015)11-1463-03

2014-11-13

2014-12-28)