溫愛萍，李 哲，李 任，余俊先，程 晟，冀曉俊，史麗敏，段美麗（.首都醫(yī)科大學附屬北京友誼醫(yī)院藥劑科，北京 00050；.首都醫(yī)科大學化學生物學與藥學院，北京 00069；.首都醫(yī)科大學附屬北京友誼醫(yī)院重癥醫(yī)學科，北京 00050）

HPLC法測定人血漿中游離亞胺培南濃度

溫愛萍1，李 哲2，李 任1，余俊先1，程 晟1，冀曉俊3，史麗敏1，段美麗3（1.首都醫(yī)科大學附屬北京友誼醫(yī)院藥劑科，北京 100050；2.首都醫(yī)科大學化學生物學與藥學院，北京 100069；3.首都醫(yī)科大學附屬北京友誼醫(yī)院重癥醫(yī)學科，北京 100050）

目的：建立人血漿中游離亞胺培南濃度的HPLC測定方法。方法：血漿樣本經超濾離心后，直接進樣，采用Agilent Zorbax SB-C8色譜柱（4.6 mm × 250 mm，5 μm），以乙腈-0.5 mol·L-1醋酸銨溶液為流動相進行梯度洗脫，流速1.0 mL·min-1，以頭孢他啶為內標，紫外檢測波長為298 nm，柱溫30 ℃。結果：亞胺培南在0.3 ～ 100.0 μg·mL-1范圍內線性關系良好（r ＞0.999），質控樣本（0.5、2.0、30.0、75.0 μg·mL-1）的方法學回收率分別為（104.54±3.17）%、（99.70±1.04）%、（98.93±1.12）%和（101.29±2.23）%；日內精密度RSD ≤ 3.03%，日間精密度RSD ≤ 5.11%。結論：本方法準確度高、靈敏度好、操作便捷，符合亞胺培南血藥濃度監(jiān)測和藥代動力學研究的要求。

游離亞胺培南；HPLC；血漿；超濾

亞胺培南為碳青霉烯類藥物，具有抗菌譜廣、抗菌作用強、對多種β-內酰胺酶高度穩(wěn)定的特點，主要用于多重耐藥的革蘭陰性桿菌感染、嚴重需氧菌與厭氧菌混合感染的治療以及病原未查明的嚴重感染[1]，是重癥感染患者常用的抗感染藥物之一。重癥感染患者的病理生理情況特殊，可能直接影響亞胺培南的體內過程，如根據常規(guī)方案給藥可能因血藥濃度過高或過低而導致不良反應或治療失敗[2-8]，因此對重癥感染患者進行亞胺培南的治療藥物監(jiān)測，可為臨床制定合理的給藥方案提供參考依據[6，9-11]。目前，國內外亞胺培南血藥濃度的測定方法主要有親水作用色譜-質譜檢測法[12-13]和HPLC-紫外檢測法[14-22]，質譜檢測法對儀器要求高，難以普及；多數HPLC-紫外檢測法文獻測定的是血漿中亞胺培南的總濃度[14-17，20-22]，而血中的游離藥物是產生藥理效應的部分，也只有游離藥物才能被機體轉化和排泄，因此測定游離藥物濃度更具有臨床意義[23]。本研究建立人血漿中游離亞胺培南濃度的高效液相色譜測定方法，以期為考察亞胺培南在重癥感染患者的藥動學方面提供方法學基礎。

1 儀器與試藥

Agilent 1100 HPLC系統(tǒng)（美國Agilent公司）；分析天平（德國Sartorius集團）；離心機（德國Eppendorf公司）；Amicon超濾管（0.5 mL，3 KD，美國Millipore公司）；Milli-Q plus超純水器（美國Millipore公司）。

注射用亞胺培南西司他?。▉啺放嗄?00 mg/西司他丁500 mg，美國默沙東公司）；USP亞胺培南對照品（純度93.2%，國藥集團化學試劑北京有限公司，批號I1K226）；內標頭孢他啶（純度84.2%，中國藥品生物制品檢定所，批號130484-200803）。乙腈，甲醇（色譜純，德國Merck公司）；乙酸銨、氫氧化鈉（NaOH）、3-（N-嗎啉基）丙磺酸（MOPS）均為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent Zorbax SB-C8柱（4.6 mm × 250 mm，5 μm），柱溫30 ℃；流動相：乙腈和0.5 mol·L-1醋酸銨緩沖液（pH 6.8），以梯度方式洗脫（初始乙腈2%，經5 min按比例增至40%，再經5 min按比例減至2%），流速：1.0 mL·min-1；紫外檢測波長：298 nm。

2.2 穩(wěn)定液的配制

稱取MOPS 2.64 g，用100 mL超純水溶解，加入適量NaOH調節(jié)pH值至6.8。

2.3 儲備液的配制

分別精密稱取亞胺培南和內標頭孢他啶對照品置于容量瓶中，加入穩(wěn)定液配制成1 mg·mL-1的亞胺培南和500 μg·mL-1的頭孢他啶儲備液，分裝后，– 70 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4 血漿樣本處理

精密吸取血漿樣本與穩(wěn)定液混合液（1∶1，200 μL），加入內標頭孢他啶儲備液20 μL，渦旋混勻，移入超濾管中，離心（13 000 r·min-1，10 min），吸取超濾液，50 μL進樣，記錄色譜圖。在本實驗條件下，亞胺培南和內標頭孢他啶分離良好，不受血漿色譜峰的干擾，見圖1。危重癥患者常用的萬古霉素、利奈唑胺、伏立康唑、甲硝唑、阿奇霉素、阿昔洛韋、咪達唑侖、芬太尼、丙泊酚、奧美拉唑、泮托拉唑、二羥丙茶堿、氨溴索、烏拉地爾、地爾硫卓、苯海拉明、地塞米松、異甘草酸鎂、還原型谷胱甘肽等藥物對本測定方法無顯著干擾。

2.5 標準曲線的制備

圖1 HPLC色譜圖A – 亞胺培南+頭孢他啶標準溶液，B – 空白血漿，C – 空白血漿+亞胺培南+頭孢他啶，D – 受試者血漿樣本；1 – 亞胺培南，2 – 頭孢他啶Fig 1 HPLC chromatogramsA – imipenem and ceftazidime standard solution, B – blank human plasma, C – blank plasma vortex with imipenem and ceftazidime, D –patient's plasma samples; 1 – imipenem, 2 – ceftazidime

以穩(wěn)定液和亞胺培南儲備液分別配制質量濃度為0.3、1.0、2.5、5.0、10.0、25.0、50.0、100.0 μg·mL-1的標準曲線溶液，測定當天，加入等比例空白血漿，按照“2.4”項下方法處理血漿樣本后進樣分析。以樣本峰面積與內標峰面積之比為橫坐標，血漿藥物濃度為縱坐標，用加權最小二乘法（W = 1/C2）進行回歸計算，求得標準曲線回歸方程為：Y = 0.0334 X + 0.0010（r = 0.999 6），整個測定過程中相關系數在0.999 0 ～1.000 0之間。

2.6 準確度和精密度

另以穩(wěn)定液和亞胺培南儲備液分別配制質量濃度為0.5、2.0、30.0、75.0 μg·mL-1的質控溶液。分別取5份質控溶液樣品各100 μL，測定當天，加入等比例空白血漿，按照“2.4”項下方法處理后進樣分析，連續(xù)測定5 d，以實測濃度和真實濃度的比值計算相對回收率，反映方法學準確度；以日內和日間實測濃度的RSD反映方法學精密度。結果見表1。

表1 亞胺培南測定方法的精密度和準確度.n= 5Tab 1 Precision and accuracy of determination method of imipenem.n= 5

2.7 提取回收率

分別取3份低、中、高濃度（2.0、30.0、75.0 μg·mL-1）的亞胺培南質控溶液樣本各100 μL，測定當天，加入等比例空白血漿，按照“2.4”項下方法處理血漿樣本后進樣分析，以血漿稀釋質控溶液樣本的峰面積與同濃度的質控溶液樣本經同倍數穩(wěn)定液稀釋后直接進樣的峰面積比值計算提取回收率，結果分別為（98.23±0.35）%，（96.83±1.61）%和（97.22± 2.23）%。

2.8 穩(wěn)定性

分別取50 μL亞胺培南和頭孢他啶儲備液，加入900 μL穩(wěn)定液，渦旋混合后，50 μL進樣分析，考察儲備液長期放置95 d（n = 3）及室溫放置6 h（n = 3）穩(wěn)定性；取低、中、高3個濃度（2.0、30.0、75.0 μg·mL-1）的亞胺培南質控溶液樣本，加入等比例空白血漿，考察反復凍融3次、室溫放置6 h（n = 3）、– 70 ℃放置3個月（n = 3）及自動進樣器放置6 h（n = 3）的穩(wěn)定性。另外，將受試者血樣（n = 3）分為兩份，一份立即離心（3000 r·min-1，10 min），分離血漿，加入等比例穩(wěn)定液，按照“2.4”項下方法處理血漿樣本后進樣分析；另一份放置于4 ℃冰盒中，2 h后進行離心，分離血漿，加入等比例穩(wěn)定液，按照“2.4”項下方法處理血漿樣本后進樣分析，考察受試者血樣4 ℃放置2 h的穩(wěn)定性。結果表明在上述條件下，亞胺培南穩(wěn)定性良好，儲備液RSD值均小于5%，血漿樣本RSD值均小于10%。

2.9 臨床應用

經北京友誼醫(yī)院倫理委員會批準，患者簽署知情同意書后，已將本方法用于4例危重癥患者游離亞胺培南血藥濃度的測定。亞胺培南西司他丁給藥方案為0.5 g（溶于100 mL 0.9%氯化鈉注射液，持續(xù)輸注1 h），每6 h給藥一次，達穩(wěn)態(tài)（連續(xù)給藥至少48 h）后于給藥前及給藥后0.5、1、1.5、2、3、4和6 h采集血液樣本，藥-時曲線見圖2。由圖可見，實測游離亞胺培南血藥濃度范圍為0.49 ～ 26.08 μg·mL-1，均在本方法的線性范圍內。相同的給藥方案條件下，4例患者體內的游離亞胺培南濃度存在明顯的個體差異，最高與最低峰濃度相差約4倍。

圖2 4例危重癥患者的藥-時曲線Fig 2 Concentration-time curve of 4 critically ill patients

3 討論

3.1 游離亞胺培南濃度測定方法

目前，游離藥物測定方法主要有平衡透析法、超離心法、凝膠過濾法和超濾離心法，超濾離心法簡便快捷，耗時較短，且結果穩(wěn)定、可靠，已成為游離藥物分析的首選方法[23-24]。根據文獻報道[18-19]，本研究應用超濾離心法對血漿樣本進行處理，研究結果表明此方法提取回收率高且較為穩(wěn)定，處理時間較蛋白沉淀法短，適合于臨床患者血藥濃度的快速測定及不穩(wěn)定藥物濃度的測定。

3.2 亞胺培南血漿樣本的穩(wěn)定性

亞胺培南在血漿中極不穩(wěn)定，溶液的pH偏酸或偏堿均會加快其降解[20]。早在1986年，就有研究者考察了亞胺培南在0.9%氯化鈉注射液及人血清中的穩(wěn)定性情況[25]，研究發(fā)現，2 ℃、25 ℃和37 ℃條件下，亞胺培南（2.5 mg·mL-1）在0.9%氯化鈉注射液中的半衰期分別為44.42 h、6.21 h和2.05 h；20 ℃和37 ℃條件下，亞胺培南（100 μg·mL-1）在人血清中的半衰期分別為58.72 h和10.73 h?？梢娫跍y定過程中尤其需要關注亞胺培南的穩(wěn)定性情況。在亞胺培南測定相關文獻中，多在血漿樣本中加入穩(wěn)定液以提高亞胺培南測定過程中的穩(wěn)定性，以滿足測定要求。本研究以0.126 mol·L-1MOPS緩沖液（pH 6.8）作為穩(wěn)定液，根據臨床樣本測定研究需要，重點考察了儲備液長期放置及室溫放置穩(wěn)定性，血漿樣品反復凍融、室溫放置、– 70 ℃放置及自動進樣器放置穩(wěn)定性，以及受試者血樣4 ℃冰盒放置穩(wěn)定性，結果表明樣本穩(wěn)定性均可滿足測定要求。

綜上，在關注臨床療效相關性和測定樣本穩(wěn)定性的基礎上，本研究建立了人血漿中游離亞胺培南濃度的HPLC測定方法，實際應用于4例危重癥患者亞胺培南濃度測定。結果表明本研究的樣本處理方法較為省時便捷，采血量少（僅需血漿樣本100 μL），尤其適用于兒童及危重癥患者的游離亞胺培南血藥濃度監(jiān)測和藥動學研究。

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Determination of free imipenem in human plasma by HPLC

WEN Ai-ping1, LI Zhe2, LI Ren1, YU Jun-xian1, CHENG Sheng1, JI Xiao-jun3, SHI Li-min1, DUAN Mei-li3(1. Department of Pharmacy, Beijing Friendship Hospital Affiliated to Capital Medical University, Beijing 100050, China; 2. School of Chemical Biology and Pharmaceutical Sciences, Capital Medical University, Beijing 100069, China; 3. Department of Critical Care Unit, Beijing Friendship Hospital Affiliated to Capital Medical University, Beijing 100050, China)

Objective:To establish the HPLC method for determining the concentration of free imipenem in human plasma.Methods:Prior to analysis, free imipenem was isolated from plasma samples using ultrafiltration and centrifugation. Then, the extracts were injected directly into an Agilent Zorbax SB-C8column (4.6 mm × 250 mm, 5 μm). The mobile phase was consisted of acetonitrile-ammonium acetate solution (0.5 mol·L-1), and the gradient elution mode was applied in chromatographic separation. The flow rate was 1.0 mL·min-1. Ceftazidime was chosen as internal standard. The detection wavelength was set at 298 nm. The column temperature was 30 ℃.Results:The linear range of the calibration curve was 0.3 – 100.0 μg·mL-1with a good correlation coefficient (r ＞ 0.999). The average recovery rates of quality control samples (0.5, 2.0, 30.0, 75.0 μg·mL-1) were (104.54 ± 3.17)%, (99.70 ± 1.04)%, (98.93 ± 1.12)% and (101.29 ± 2.23)%, respectively. The intra-day RSD was equal to or less than 3.03%, and interday RSD was equal to or less than 5.11%.Conclusion:The method was accurate, sensitive and simple, which was suitable for the therapeutic drug monitoring and clinical pharmacokinetic study of imipenem.

Free imipenem; HPLC; Plasma; Ultrafiltration

R917

A

1672 – 8157(2015)03 – 0151 – 04

2015-01-15

2015-04-01）

溫愛萍，女，主管藥師，主要從事臨床藥學工作。E-mail：wenaiping@126.com