謝輝輝謝彤徐建亞沈存思賴子娟徐牛生汪受傳單進軍,（南京中醫(yī)藥大學中醫(yī)兒科學研究所,江蘇省兒童呼吸疾?。ㄖ嗅t(yī)藥）重點實驗室,南京00）（美國加州大學戴維斯分校基因組中心,NIH西海岸代謝組學研究中心,戴維斯9566）（賽默飛世爾科技（中國）有限公司,上海006）

基于代謝組學方法研究烏頭堿和苯甲酰烏頭原堿對BeW o細胞的毒性機制

謝輝輝1謝彤1徐建亞1沈存思1賴子娟2徐牛生3汪受傳1單進軍*1,21（南京中醫(yī)藥大學中醫(yī)兒科學研究所,江蘇省兒童呼吸疾?。ㄖ嗅t(yī)藥）重點實驗室,南京210023）
2（美國加州大學戴維斯分校基因組中心,NIH西海岸代謝組學研究中心,戴維斯95616）
3（賽默飛世爾科技（中國）有限公司,上海201206）

以BeWo細胞建立體外胎盤模型,采用基于氣相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用技術（GC-MS/MS）的代謝組學方法,研究烏頭堿及其代謝產(chǎn)物苯甲酰烏頭原堿的生殖毒性機制。收集不同時間點（0,6,12,24和36 h）藥物干預后的BeWo細胞裂解液,通過GC-MS/MS分析獲得細胞代謝輪廓；正交偏最小二乘法-判別分析（OPLSDA）顯示,BeWo細胞內(nèi)代謝物在藥物干預后呈動態(tài)變化。進一步通過變量重要性投影（VIP）值和單因素方差分析篩選差異性代謝物,最終鑒定出脯氨酸、甘氨酸、蘇氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、乙酰谷氨酰胺、賴氨酸、組氨酸、葡萄糖、半乳糖、琥珀酸共11個差異性代謝物。經(jīng)Metaboanalyst分析,主要涉及谷氨酰胺和谷氨酸代謝,甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝,丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝,賴氨酸降解,精氨酸和脯氨酸代謝,組氨酸代謝等6條代謝通路。實驗結果表明,烏頭堿和苯甲酰烏頭原堿主要通過影響氨基酸代謝對BeWo細胞產(chǎn)生生殖毒性作用。

烏頭堿；苯甲酰烏頭原堿；氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用；代謝組學；BeWo細胞；胚胎毒性

1 引 言

附子作為中醫(yī)臨床常用中藥,有回陽救逆、補火助陽、散寒止痛作用。但附子屬“妊娠禁忌藥物”, 2010版中國藥典同樣將其歸為孕婦慎用藥物[1]。附子的主要毒性成分為二萜類生物堿（如烏頭堿）及其相應苯甲酰代謝產(chǎn)物（如苯甲酰烏頭原堿等）[2]。目前研究集中于附子一般毒性及炮制或配伍解毒方面,生殖毒性,尤其是對胚胎的毒性報道較少[3,4]。研究發(fā)現(xiàn),烏頭堿（≥5μg/mL作用48 h）對大鼠胚胎（體外培養(yǎng)）可產(chǎn)生心臟缺陷、不規(guī)則椎體和大腦畸形等嚴重的致畸作用[5]；對斑馬魚胚胎心臟可引起心包囊水腫、心膜出血,甚至心率失常和心跳停止[6]。但附子所涉及的生殖毒性機制及代謝通路未見詳細報道。

胎盤作為母體與胎兒交換氣體、營養(yǎng)和廢物的場所,同時也是保護胚胎和胎兒免受有害物質(zhì)侵害的屏障[7],因此胎盤可作為生殖毒性研究的一個有效工具[8]；由于在體實驗存在獲取妊娠動物困難且實驗周期較長等問題,因此適宜的體外模型顯得尤為重要。BeWo細胞作為毒理學研究普遍使用的人胎盤細胞系之一,保持著較多的人類絨毛膜細胞生物學特點,是開展生殖毒性研究較為理想的體外模型[9]。

代謝組學通過分析生物體整體代謝物的改變來確定藥物、環(huán)境等因素所導致影響[10,11]。近年來,代謝組學在中藥毒性評價方面得到越來越多的應用,但未見有從整體評價附子生殖毒性的報道[12]。本研究以BeWo細胞建立體外胎盤模型,采用氣相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用技術（GC-MS/MS）的代謝組學方法,從整體角度研究附子主要毒性成分（烏頭堿及苯甲酰烏頭原堿）對胎盤細胞的毒性及對胚胎的可能毒性機制。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

配備AS 1310自動進樣器的Trace 1310氣相色譜和TSQ 8000質(zhì)譜儀,TG-5MS氣相色譜柱（30 m× 0.25 mm,0.25μm）,SpeedVac離心濃縮儀（Thermo公司）

烏頭堿（批號121026）、苯甲酰烏頭原堿（批號121109）購自成都普菲德生物技術公司；1,2-13C-肉蔻酸、BSTFA（含1％TMCS）、C8-C40烷烴系列標準品、吡啶、甲氧胺（Sigma公司）；F-12K培養(yǎng)基、胎牛血清（Gibco公司）；胰酶/EDTA溶液、青霉素/鏈霉素溶液（Wisent公司）；BCA蛋白定量試劑盒（Pierce公司）。

2.2 細胞實驗

BeWo細胞系購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心,細胞培養(yǎng)于含有10％（V/V）胎牛血清的F-12K培養(yǎng)基中（含100 U/mL青霉素和0.1mg/mL鏈霉素）。培養(yǎng)瓶置于5％CO2,37℃培養(yǎng)箱。獲得足量細胞后,以每孔2×105密度種植細胞于6孔板中,待細胞達到90％匯合率時,分別給予5μg/mL的烏頭堿及苯甲酰烏頭原堿DMSO溶液。在6,12,24和36 h分別棄培養(yǎng)液,生理鹽水沖洗2遍后,迅速加入液氮約3 mL進行淬滅,待液氮揮發(fā)后加入300μL純水,樣品制備前于-80℃保存。

2.3 樣品制備

上述樣本經(jīng)歷3次凍融循環(huán)（-80℃冰凍60min,37℃融化30min）后,反復沖洗10遍以保證細胞分離。取上述提取液20μL用于BCA法蛋白定量后,剩余約280μL提取液,加入900μL甲醇溶液（含內(nèi)標1,2-13C-肉蔻酸22.5μg）,渦旋5min后,離心（15000 r/min,10min）,取450μL上清液于離心濃縮儀揮干（45℃,14 Vac,～2 h）。

向上述樣本中加入30μL甲氧胺吡啶溶液（10mg/mL）,渦旋1min后振蕩1.5 h（30℃, 600 r/min）；加入30μL BSTFA（含1％TMCS）溶液后,渦旋1min后振蕩0.5 h（37℃,600 r/min）,取上清液50μL用于GC-MS/MS分析。

2.4 色譜-質(zhì)譜條件

載氣為氦氣,流速為1.2 mL/min,采用分流模式,進樣口溫度為250℃,分流比為20∶1,升溫程序：起始溫度60℃,保持1min后,以20℃/min升至320℃后,保持5min；進樣量為1μL。采用EI源,離子源溫度為280℃,離子傳輸線溫度為250℃,電離能為70 eV,采集范圍為m/z 50～500,采集時間3.5～19min。

2.5 數(shù)據(jù)處理

對得到的原始文件采用Xcalibur 2.2進行預處理,并通過內(nèi)標歸一化,得到適合SIMCA軟件分析的三維矩陣數(shù)據(jù)集,坐標分別為：推測化合物,樣品名及峰面積比率。采用PASW Statistics 18（SPSS公司）和SIMCA 13.0（Umetrics公司）進行單因素方差分析及OPLS-DA分析。使用NIST 2014數(shù)據(jù)庫和已有標準品對其進行驗證。

3 結果與討論

3.1 GC-MS/MS分析結果

不同時間點的細胞裂解液GC-MS/MS分析總離子流圖（TIC）見圖1?？鄢苌噭┍尘昂?共篩選出色譜峰72個。利用NIST數(shù)據(jù)庫對GC-MS/MS數(shù)據(jù)分析,根據(jù)匹配度、可能性和相關化合物保留指數(shù)（RI）,推測出41種化合物,包括脯氨酸、甘氨酸、蘇氨酸等多種氨基酸,葡萄糖、半乳糖、果糖等糖類以及琥珀酸、檸檬酸、尿素、肌醇、棕櫚酸、硬脂酸等多種小分子代謝物。

3.2 BeWo細胞代謝輪廓分析及差異性代謝物鑒定

采用Xcalibur處理各組細胞裂解液中篩選的72種共有色譜峰,再進行正交偏最小二乘法-判別分析（OPLS-DA）,由OPLS-DA得分圖（圖2）可見,在干預6 h后,烏頭堿組和苯甲酰烏頭原堿組樣本已可以同0 h時樣本區(qū)分,在干預24 h、36 h可以同0 h、6 h及12 h樣本良好區(qū)分,提示BeWo細胞代謝物在烏頭堿及苯甲酰烏頭原堿干預后不同時間點有明顯差異,在干預6 h和12 h已經(jīng)表現(xiàn)出毒性,在干預24 h和36 h毒性較為嚴重。通過VIP＞1及單因素方差分析（p＜0.05）篩選,共找出對得分圖區(qū)分做出主要貢獻的差異性代謝物共12種（見圖1）,并用標準品對脯氨酸、甘氨酸、蘇氨酸、琥珀酸、谷氨酸、谷氨酰胺、賴氨酸、葡萄糖進行了確認。

3.3 代謝通路分析

圖1 空白組（0 h）、烏頭堿（A）和苯甲酰烏頭原堿（BA）干預后不同時間點（6,12,24和36 h）的BeWo細胞的GC-MS總離子流圖Fig.1 TIC of BeWo intracellularmetabolites from blank group,aconitine and benzoylaconine treated groups at different time point（6,12,24 and 36 h）差異性代謝物（metabolites）：1.脯氨酸（Proline）,2.甘氨酸 （Glycine）,3.蘇氨酸（Threonine）,4.琥珀酸（Succinic acid）,5.谷氨酸（Glutamic acid）,6.未鑒定（Unknown）,7.乙酰谷氨酰胺（N-Acetylglutamine）,8.谷氨酰胺（Glutamine）,9.賴氨酸（lysine）,10.組氨酸（Histidine）,11.葡萄糖（Glucose）,12.半乳糖（Galactose）。1-5,8,9,11經(jīng)標準品鑒定（identified by standard substances）。

圖2 烏頭堿組（A）和苯甲酰烏頭原堿組（BA）在不同時間點OPLS-DA得分圖（R2X=0.861,Q2=0.438）Fig.2 Orthogonal partial least squares-discriminate analysis（OPLS-DA）score plot of time-dependent metabolic profiles in aconitine（A）and benzoylaconine（BA）treated group（R2X=0.861,Q2=0.438）

烏頭堿、苯甲酰烏頭原堿干預后不同時間點BeWo細胞內(nèi)差異性代謝物的相對含量變化見圖3,這些內(nèi)源性代謝物含量的變化可能導致了烏頭堿和苯甲酰烏頭原堿對BeWo細胞的毒性。使用Metabo-Analyst3.0進行代謝通路分析。根據(jù)通路影響值＞0.1得到：（1）谷氨酰胺和谷氨酸代謝,（2）甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝,（3）丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝,（4）賴氨酸降解,（5）精氨酸和脯氨酸代謝, （6）組氨酸代謝,共6條相關代謝通路。上述通路與差異性代謝物之間的聯(lián)系見圖4。

由圖3可見,上述差異性代謝物在干預后6,12 和24 h,大部分出現(xiàn)明顯下降,尤其以葡萄糖、半乳糖和甘氨酸、賴氨酸最為明顯；但在干預36 h后,糖類含量仍明顯下降,而大多數(shù)氨基酸反而出現(xiàn)含量增加。此現(xiàn)象可能與同時涉及氨基酸代謝和糖類代謝中能量供應受損有關。糖類含量明顯降低,使得蛋白質(zhì)分解為氨基酸,進而提供能量,從而引起干預后期大多數(shù)氨基酸的含量升高。

在干預6,12,24和36 h后,琥珀酸含量持續(xù)降低,同樣提示烏頭堿及苯甲酰烏頭原堿可以引起細胞能量供應受損[13]。胎盤和胚胎代謝旺盛,可能因為能量代謝障礙,引起細胞凋亡和胚胎生長發(fā)育受限,甚至死亡[14,15]。而谷氨酸、脯氨酸和谷氨酰胺作為對胎盤、胚胎及胎兒發(fā)育發(fā)揮特殊作用的一類氨基酸,其含量降低均可對胚胎產(chǎn)生不利影響[16～18]。圖3中烏頭堿可引起大部分差異性代謝物含量更顯著的改變,且在部分時間點與苯甲酰烏頭原堿有差異,提示烏頭堿產(chǎn)生毒性比苯甲酰烏頭原堿更強。

圖3 烏頭堿和苯甲酰烏頭原堿不同作用時間對BeWo細胞內(nèi)代謝物的影響Fig.3 Tme-dependent pattern of potential biomarkers in aconitine and benzoylaconine treated group*：與0 h比較,p＜0.05,Δ：烏頭堿與苯甲酰烏頭原堿比較,p＜0.05。*：Compared with 0 h group,p＜0.05；Δ：Comparison of aconitine and benzoylaconine group,p＜0.05.

4 結論

本實驗采用GC-MS/MS與OPLS-DA方法分析BeWo細胞代謝物在烏頭堿及苯甲酰烏頭原堿干預后不同時間的動態(tài)變化,共鑒定出脯氨酸、甘氨酸、蘇氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、乙酰谷氨酰胺、賴氨酸、組氨酸、葡萄糖、半乳糖、琥珀酸等11個差異性代謝物。經(jīng)Metaboanalyst分析得到谷氨酰胺和谷氨酸代謝,甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝,丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝,賴氨酸分解,精氨酸和脯氨酸代謝,組氨酸代謝等6條相關代謝通路。表明烏頭堿和苯甲酰烏頭原堿主要通過影響氨基酸代謝對BeWo細胞產(chǎn)生毒性作用,推測附子的胚胎毒性可能源于其毒性成分導致的胎盤氨基酸代謝紊亂。

圖4 烏頭堿和苯甲酰烏頭原堿對胎盤細胞內(nèi)代謝物的影響及其對胚胎毒性的可能機制Fig.4 Possible mechanism of aconitine and benzoylaconineinduced placental and fetal toxicity（1）谷氨酰胺和谷氨酸代謝,（2）甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝, （3）丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝,（4）賴氨酸降解,（5）精氨酸和脯氨酸代謝,（6）組氨酸代謝。（1）Glutamine and glutamate metabolism；（2）Glycine,serine and threoninemetabolism；（3）Alanine,aspartate and glutamate metabolism；（4）Lysine degradation；（5）Arginine and prolinemetabolism；（6）Histidinemetabolism.

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國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（2010年版）.北京：中國醫(yī)藥科技出版社,2010：177-178

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（Received 23 May 2015；accepted 31 August2015）

This work was supported by the National Natural Science Foundation of China（NO.81303299）

M etabolom ics Study of Aconitine and Benzoylaconine Induced Reproductive Toxicity in BeW o Cell

XIE Hui-Hui1,XIE Tong1,XU Jian-Ya1,SHEN Cun-Si1,LAIZi-Juan2,XU Niu-Sheng3, WANG Shou-Chuan1,SHAN Jin-Jun*1,21（Jiangsu Key Laboratory ofPediatric Respiratory Disease,Institute ofPediatrics in Chinese Medicine, Nanjing University ofChinese Medicine,Nanjing 210023,China）
2（Genome Center ofUC Davis,NIHWest CoastMetabolomics Center,Davis95616,USA）
3（Thermo Fisher Scientific,（China）Shanghai201206,China）

An intracellular metabonomics method based on gas chromatography coupled with mass spectrometer（GC-MS/MS） was established to explore the toxicity mechanism of aconitine and benzoylaconine.BeWo,the continuous cell lines originated from human placentawere selected to establish the in vitro placentamodel.The intracellularmetaboliteswere extracted after exposed with 5μg/mL aconitine and benzoylaconine for 0,6,12,24 and 36 h,respectively.The intracellularmetabolic profiling was acquired by GC-MS/MS.Orthogonal partial least squares discriminant analysis（OPLS-DA）score plot showed the timedependent change of themetabolomics profiles between the control and intervention groups.After screened by variable influence on projection（VIP）value,one-way analysis of variance and searched with NIST 2014 database, we identified 11 metabolites, including proline, glycine, threonine, glutamic acid, N-acetylglutamine,glutamine,lysine,histidine,succinic acid,glucose and galactose,whichmainly involved these pathways：（1）glutamine and glutamate metabolism,（2）glycine,serine and threonine metabolism, （3）alanine,aspartate and glutamate metabolism,（4）lysine degradation,（5）arginine and proline metabolism and（6）histidinemetabolism.The results demonstrated that amino acid metabolism was themain metabolic pathway and responsible for the placental and fetal toxicity of aconitine and benzoylaconine.

Aconitine；Benzoylaconine；Gas chromatography-mass spectrometry；Metabonomics；BeWo cell；Fetal toxicity

10.11895/j.issn.0253-3820.150430

2015-05-23收稿；2015-08-31接受

本文系國家自然科學基金（No.81303299）、江蘇省研究生培養(yǎng)創(chuàng)新工程（No.SJZZ_0124）資助

E-mail：jshan@njucm.edu.cn