劉宇帥，李晶，張淑梅，孟利強(qiáng)

（1.黑龍江省科學(xué)院高技術(shù)研究院，哈爾濱150010；2.黑龍江省科學(xué)院微生物研究所，哈爾濱150020）

PCR-DGGE技術(shù)研究大豆內(nèi)生細(xì)菌多樣性

劉宇帥1，2，李晶1，2，張淑梅1，2，孟利強(qiáng)1，2

（1.黑龍江省科學(xué)院高技術(shù)研究院，哈爾濱150010；2.黑龍江省科學(xué)院微生物研究所，哈爾濱150020）

本研究采用了巢氏PCR法，先以799F-1492R引物，以大豆基因組DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增，將目的條帶切膠回收并進(jìn)行第二步PCR，其中以GC-968F-1378R為引物，最終得到了V6、V7、V8三個高變區(qū)的目的片段（470bp）。采用分子生物學(xué)技術(shù)PCR-DGGE分析大豆內(nèi)生細(xì)菌多樣性發(fā)現(xiàn)，大豆葉片中的內(nèi)生細(xì)菌多樣性要小于根部和莖部；大豆不同的品種間存在很多共有條帶，而每個不同品種又存在各自的特有條帶；在大豆的各個不同生長時期內(nèi)生細(xì)菌多樣性逐漸增加，只有在結(jié)莢期內(nèi)生細(xì)菌多樣性最小。

大豆；內(nèi)生細(xì)菌；PCR-DGGE；多樣性

植物內(nèi)生細(xì)菌是一種十分重要的生防細(xì)菌來源，研究植物內(nèi)生細(xì)菌已成為控制植物病害的一條有效途徑［1］。內(nèi)生細(xì)菌能夠抑制植物病原菌的侵入和生長，而且可以促進(jìn)植物的生長。內(nèi)生細(xì)菌能夠占據(jù)植物體內(nèi)有利生態(tài)位，而且不易受環(huán)境條件的影響，能夠定殖于植株相應(yīng)部位抵抗病原物的入侵［2］。隨著植物內(nèi)生細(xì)菌的深入研究，其生防價值日益突出，研究植物內(nèi)生細(xì)菌可以發(fā)揮內(nèi)生細(xì)菌的有益生物學(xué)作用，防治植物病害，提高作物生產(chǎn)力，將為我們帶來良好的經(jīng)濟(jì)和社會效益。

本研究通過非培養(yǎng)方法揭示了大豆內(nèi)生細(xì)菌的種群多樣性特征信息及動態(tài)分布，發(fā)現(xiàn)不同大豆品種內(nèi)生細(xì)菌的種群存在差異，揭示了各個大豆品種不同生長期植株根、莖、葉不同部位內(nèi)生細(xì)菌種群結(jié)構(gòu)以及動態(tài)變化情況，將有利于開發(fā)植物內(nèi)生細(xì)菌這個巨大的微生物資源寶庫，帶來巨大的社會效益［3,4］。

1 實驗方法

1.1 樣品總DNA的提取與純化

采用TIANamp Bacteria DNA Kit基因組提取試劑盒（TIANGEN）提取基因組，提取大豆植株樣本總DNA。

利用Universal DNA Purification Kit總DNA純化回收用試劑盒（TIANGEN），按說明書操作。

1.2 大豆內(nèi)生細(xì)菌16S rDNA片段的PCR擴(kuò)增

大豆植株樣本內(nèi)生細(xì)菌的16S rDNA片段PCR擴(kuò)增利用巢式PCR方法，以大豆樣本總DNA為模板，細(xì)菌通用引物799F(AACAGGATTAGATACCCT G)和1492R(GGTTACCTTGTT ACGACTT)擴(kuò)增細(xì)菌16S rDNA片段，這樣可以免去大豆植株體細(xì)胞中線粒體及葉綠體遺傳物質(zhì)的干擾。將擴(kuò)增產(chǎn)物中分子量為740 bp左右的片段回收，并將其作為模板，選用引物968F(AAC GCG AAG AAC CTT AC)和1378R (CGG TGT GTA CAA GGC CCG)擴(kuò)增細(xì)菌16S rDNA的V6-V8高變區(qū)［5］。引物合成時，在引物968F的5'端加上40個堿基的GC夾(GCCGGGCCGGGG GCACCGCGCGGG GCGGCGGGGCCGCGCGG)，引物由寶生物有限公司合成，擴(kuò)增試劑均購自TIANGEN公司。

PCR擴(kuò)增方法、反應(yīng)體系及回收方法參照文獻(xiàn)［6］。

1.3 DGGE對大豆內(nèi)生細(xì)菌多樣性分析

根據(jù)DGGE條件優(yōu)化的結(jié)果，制備聚丙烯酰胺凝膠，變性劑濃度為25%～75%，預(yù)電泳條件為55℃，120 V電泳10 min，然后取各樣品15 μL加入各點樣孔，在120 V電壓下，電泳10 h。

電泳完成后采用銀染法對凝膠進(jìn)行染色，并采用Quantity One分析軟件對各個樣品的DGGE分離條帶進(jìn)行分析。主要分析各個條帶的遷移速率、灰度指數(shù)及數(shù)量關(guān)系。分析各樣品在DGGE圖譜中的各個參數(shù)，采用Shannon-Weiner指數(shù)(H)，豐富度指數(shù)(S)和均勻度指數(shù)(E)等指標(biāo)比較各個樣品內(nèi)生細(xì)菌的多樣性［7］。

2 結(jié)果與討論

2.1 大豆基因組DNA的提取

內(nèi)生細(xì)菌基因組總DNA的提取是分析其種群多樣性的關(guān)鍵。通過實驗結(jié)果可以看出圖1，基因組主條帶清晰且沒有彌散條帶，只有部分RNA存在，可以通過純化回收避免對下一步PCR實驗的影響。

圖1 總DNA的提取檢測Fig.1 Abstracting and testing of total DNA

2.2 DGGE對大豆內(nèi)生細(xì)菌多樣性分析

2.2.1 大豆不同組織部位內(nèi)生細(xì)菌多樣性比較

大豆同一時期不同組織部位內(nèi)生細(xì)菌16S rDNA PCR產(chǎn)物的變性梯度凝膠電泳結(jié)果如圖2所示。不同的樣品經(jīng)變性梯度凝膠電泳后，都分離得到數(shù)目不等的電泳條帶，并且每個條帶的染色強(qiáng)度和遷移率各不相同，有一些條帶染色強(qiáng)度較高，也有一些條帶染色強(qiáng)度較弱。由圖2可以看出，根部和莖部內(nèi)生細(xì)菌DGGE圖譜較為相似，存在很多共有條帶，說明根部和莖部存在很多共有內(nèi)生細(xì)菌類型。而葉片的內(nèi)生細(xì)菌條帶數(shù)量要明顯少于根部和莖部，說明葉片中的內(nèi)生細(xì)菌多樣性要小于根部和莖部。

圖2 大豆不同組織部位內(nèi)生細(xì)菌16S rDNA-PCR產(chǎn)物DGGE圖譜Fig.2 DGGE Spectrum of Endophytic bacteria 16s rDNA-PCR's product at different tissue of soybean

細(xì)菌多樣性指數(shù)是用來分析細(xì)菌物種數(shù)和個體數(shù)量以及均勻度分布的綜合指標(biāo)［8］。根據(jù)電泳圖譜中每個條帶的強(qiáng)度，采用Quantity One軟件對大豆不同組織部位中細(xì)菌多樣性指數(shù)(H)、均勻度(E)和豐富度(S)進(jìn)行分析，結(jié)果如表1。結(jié)果顯示，大豆根部和莖部的內(nèi)生細(xì)菌多樣性指數(shù)(H)相似，分別為3.57和3.32，而葉片中的內(nèi)生細(xì)菌多樣性指數(shù)(H)僅為1.89，遠(yuǎn)小于根部和莖部。

表1 大豆不同組織部位內(nèi)生細(xì)菌多樣性指數(shù)、均勻度及豐富度Tab.1 Diversity factor,unity and abundance of endophytic bacteria at different tissue of soybean

2.2.2 大豆不同品種內(nèi)生細(xì)菌多樣性比較

分別于同一生長時期，取黑農(nóng)59和合豐55兩個品種大豆的同一部位內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行16S rDNA PCR-DGGE分析，電泳圖譜如圖3所示。由圖譜可以看出，黑農(nóng)58和合豐55存在很多共有條帶，如k1、k2、k3、k4、k6、k7、k8，說明大豆不同品種間存在很多共有內(nèi)生細(xì)菌類型。除共有條帶外，不同大豆品種均具有各自特有的條帶，如h1和h2只有在黑農(nóng)58存在，而k5只在合豐55中存在，說明每個品種都具有各自特有的細(xì)菌類型。

圖3 黑農(nóng)58、合豐55內(nèi)生細(xì)菌16S rDNA-PCR產(chǎn)物DGGE圖譜Fig.3 DEEG spectrum of endophytic bacteria 16s rDNA-PCR's product in Heinong 58 and Hefeng 55

對大豆不同品種內(nèi)生細(xì)菌多樣性指數(shù)(H)、均勻度(E)和豐富度(S)進(jìn)行分析，結(jié)果如表2。黑農(nóng)58和合豐55的“香農(nóng)——維納”多樣性指數(shù)分別為3.44、3.49，說明這兩個大豆品種內(nèi)生細(xì)菌都具有豐富的多樣性。

表2 黑農(nóng)58、合豐55內(nèi)生細(xì)菌多樣性指數(shù)、均勻度及豐富度Tab.2 Diversity factor,unity and abundance of endophytic bacteria in Heinong 58 and Hefeng 55

2.2.3 大豆不同生長時期內(nèi)生細(xì)菌多樣性比較

同一品種不同生長時期大豆內(nèi)生細(xì)菌16S rDNA PCR產(chǎn)物的變性梯度凝膠電泳（DGGE）結(jié)果如圖4所示。其中大豆分枝期和開花期的內(nèi)生細(xì)菌條帶要多于出苗期和結(jié)莢期。大豆分枝期和開花期共有的內(nèi)生細(xì)菌條帶最多，出苗期特有的內(nèi)生細(xì)菌條帶較多，如m1、m2，結(jié)莢期內(nèi)生細(xì)菌條帶數(shù)量最少。

圖4 大豆不同生長時期內(nèi)生細(xì)菌16S rDNA-PCR產(chǎn)物DGGE圖譜Fig.4 DEEG spectrum of endophytic bacteria 16s rDNA-PCR's product in soybean at different growing stages.

對大豆不同生長時期內(nèi)生細(xì)菌多樣性指數(shù)(H)、均勻度(E)和豐富度(S)進(jìn)行分析，結(jié)果如表3?！跋戕r(nóng)-維納”多樣性指數(shù)顯示，隨著大豆的出苗期、分枝期以及開花期的出現(xiàn)，內(nèi)生細(xì)菌多樣性逐漸增加，而在結(jié)莢期內(nèi)生細(xì)菌多樣性最小，大豆內(nèi)生細(xì)菌多樣性在分枝期、開花期最豐富。

表3 大豆不同生長時期內(nèi)生細(xì)菌多樣性指數(shù)、均勻度及豐富度Tab.3 Diversity factor,unity and abundance of endophytic bacteria in soybean at different stages

3 結(jié)論

本研究選用的巢氏PCR法適合進(jìn)行大豆內(nèi)生細(xì)菌多樣性研究，可以獲得大豆內(nèi)生細(xì)菌16S rDNA的V6、V7、V8三個高變區(qū)的目的片段。采用PCR-DGGE分析大豆內(nèi)生細(xì)菌多樣性發(fā)現(xiàn)，大豆葉片中的內(nèi)生細(xì)菌多樣性要小于根部和莖部；大豆不同的品種間存在很多共有條帶，而每個不同品種又存在各自特有的條帶；在大豆的各個不同生長時期內(nèi)生細(xì)菌多樣性逐漸增加，而在結(jié)莢期內(nèi)生細(xì)菌多樣性最小。

［1］林玲，喬勇升，顧本康，等.植物內(nèi)生細(xì)菌及其生物防治植物病害的研究進(jìn)展［J］.江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報，2008，（06）:969-974.

［2］喻江，于鎮(zhèn)華，劉曉冰，等.植物根組織內(nèi)生細(xì)菌多樣性及其促生作用［J］.中國農(nóng)學(xué)通報，2015，（13）:169-175.

［3］孫磊.非培養(yǎng)方法和培養(yǎng)方法對水稻內(nèi)生細(xì)菌和根結(jié)合細(xì)菌的研究［D］.北京：首都師范大學(xué)，2006.

［4］劉丹，張麗萍，史延茂，等.生防細(xì)菌對植物根圍微生態(tài)效應(yīng)的研究進(jìn)展［J］.中國農(nóng)學(xué)通報，2014，（07）:260-265.

［5］夏冬亮.毛竹根部內(nèi)生細(xì)菌多樣性研究［D］.保定：河北大學(xué)，2009.

［6］孟利強(qiáng)，趙曉宇，張先成，等.大豆內(nèi)生細(xì)菌種群多樣性PCR-DGGE分析方法的優(yōu)化研究［J］.黑龍江大學(xué)自然科學(xué)學(xué)報，2013，（03）:390-395.

［7］聶志娟，徐鋼春，程起群，等.海洋生境刀鱭菌群PCR-DGGE指紋圖譜構(gòu)建及分析［J］.海洋科學(xué)，2014（10）:63-69.

［8］劉國紅，劉波，車建美，等.仙草植物內(nèi)生芽胞桿菌種群多樣性研究［J］.氨基酸和生物資源，2015，（01）:35-40.

Study on Diversity of Soybean Endophytic Bacteria by PCR-DGGE Technology

LIUYu-shuai1,2,Li jing1,2,ZHANGShu-mei1,2,MENGLi-qiang1,2
（1.High Tech Research Institute,HeilongjiangAcademyofSciences,Harbin 150010，China；
2.Institute ofMicrobiology,HeilongjiangAcademyofSciences,Harbin 150020,China）

By nested PCR method and with 799F~1492R as primers,the genomic DNA of soybean has been amplified.Then we recycled the target DNA from the gel and conducted the second PCR with primers GC-968F-1378R.Finally we got the target fragment(470bp)of three high variable regions(V6,V7,V8).PCR-DGGE was used to analyze the diversity of endophytic bacteria of soybean.The diversity of endophytic bacteria in soybean leaves was less than that in roots and stems,and there were many common bands in different varieties of soybean,while each of the different varieties have their specific bands.During different growth periods of soybean the diversities of endophytic bacteria gradually increase,onlyin the pod bearingperiod endophytic bacteria diversityreached the minimum.

Soybean;Endophytic Bacteria;PCR-DGGE;Diversity

S565.1

A

1674-8646（2015）10-0008-03

2015-08-14