大連醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院泌尿外科，遼寧 大連 116023

檜木醇激活膀胱癌J82細(xì)胞自噬誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡

高玉仁，張德福，王梁，劉志宇

大連醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院泌尿外科，遼寧 大連 116023

背景與目的：膀胱癌是我國(guó)最常見(jiàn)的泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤，近年來(lái)發(fā)病率逐年上升，嚴(yán)重威脅著人類的健康。本研究旨在探討檜木醇對(duì)人膀胱癌J82細(xì)胞增殖、凋亡及自噬的作用，并初步闡明其作用機(jī)制。方法：采用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞的增殖活力，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞的凋亡狀態(tài)，采用蛋白[質(zhì)]印跡法(Western blot)檢測(cè)cleaved caspase 3、LC3及P62蛋白的表達(dá)，轉(zhuǎn)染EGFP-LC3后在激光共聚焦顯微鏡下觀察細(xì)胞自噬狀態(tài)。結(jié)果：檜木醇能夠顯著抑制J82細(xì)胞的增殖活力，通過(guò)激活caspase途徑誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，Z-VAD-FMK能夠部分抑制檜木醇的凋亡誘導(dǎo)作用。檜木醇能夠激活J82細(xì)胞發(fā)生自噬，上調(diào)LC3蛋白的表達(dá)，下調(diào)P62蛋白的表達(dá)。3-MA抑制自噬之后能夠部分逆轉(zhuǎn)檜木醇的抗腫瘤作用。結(jié)論：檜木醇可以顯著抑制J82細(xì)胞增殖并通過(guò)過(guò)度激活自噬促進(jìn)膀胱癌細(xì)胞凋亡。

檜木醇；膀胱癌；細(xì)胞增殖；細(xì)胞凋亡；細(xì)胞自噬

膀胱癌是我國(guó)最常見(jiàn)的泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤，近年來(lái)發(fā)病率逐年上升，嚴(yán)重威脅著人類的健康［1］。膀胱癌的復(fù)發(fā)率很高，據(jù)統(tǒng)計(jì)有16%～25%的復(fù)發(fā)性膀胱癌惡性程度較原發(fā)時(shí)有所增加，40%的新發(fā)膀胱癌為分化不好的高級(jí)別尿路上皮癌［2］。手術(shù)治療是膀胱癌的主要治療手段，表淺性膀胱癌通過(guò)手術(shù)治療可以獲得較為滿意的治療效果，而晚期膀胱癌的治療仍是臨床治療的一大難題。所以找到一種對(duì)于膀胱癌，尤其是對(duì)中晚期浸潤(rùn)性膀胱癌滿意的治療方法就顯得尤為緊迫。

檜木醇是一種天然化合物，從柏科植物中提?。?］。已有研究發(fā)現(xiàn)，檜木醇具有抗菌、抗炎、抗氧化及誘導(dǎo)分化等多種生物學(xué)作用［4-8］，最近的研究發(fā)現(xiàn)檜木醇可以導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞DNA損傷，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡［9-11］。但是檜木醇是否具有抗膀胱癌作用尚未見(jiàn)報(bào)道，本研究旨在進(jìn)一步明確檜木醇的抗膀胱癌作用機(jī)制，為檜木醇的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

人膀胱癌J82細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所細(xì)胞庫(kù)；檜木醇購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；EGFPLC3質(zhì)粒由日本大阪大學(xué)Tamotsu Yoshimori教授惠贈(zèng)；MEM培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司；胎牛血清及Opti-MEM培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；CCK-8購(gòu)自南京凱基生物科技公司；Z-VAD-FMK及3-MA購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司；Annexin V/PI凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)BD公司；LipofectamineTM2000購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；本研究所使用抗體均購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及質(zhì)粒轉(zhuǎn)染

人膀胱癌J82細(xì)胞培養(yǎng)于含有10%胎牛血清的MEM培養(yǎng)基中，于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)5%的飽和濕度培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染時(shí)，提前24 h將細(xì)胞傳代至激光共聚焦顯微鏡專用培養(yǎng)皿內(nèi)，細(xì)胞貼壁后換成Opti-MEM培養(yǎng)基，按LipofectamineTM2000使用說(shuō)明制備脂質(zhì)體-質(zhì)粒轉(zhuǎn)染復(fù)合物，將該復(fù)合物加入細(xì)胞后輕微振蕩，溫育6 h后換成新鮮完全培養(yǎng)基，24 h后觀察轉(zhuǎn)染效果，給予檜木醇刺激后6 h，在激光共聚焦顯微鏡下觀察并拍照存檔。

1.3 CCK-8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞傳代于96孔板內(nèi)，每孔100 μL細(xì)胞懸液(約7 000個(gè)細(xì)胞/孔)，待細(xì)胞貼壁后根據(jù)實(shí)驗(yàn)所需分別加入藥物處理，培養(yǎng)至所需時(shí)間后，每孔分別加入10 μL CCK-8溶液，放置于細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)溫育，根據(jù)培養(yǎng)基顏色變化適時(shí)終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀450 nm比色并記錄數(shù)據(jù)。

1.4 Annexin V/PI凋亡檢測(cè)

常規(guī)消化細(xì)胞，離心后PBS洗滌兩次，加入500 μL結(jié)合緩沖液重懸，加入5 μL的Annexin V和5 μL的PI至細(xì)胞懸液內(nèi)，輕輕混勻后避光染色15 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)，采用Flowjo軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.5 蛋白［質(zhì)］印跡法(Western blot)檢測(cè)

將細(xì)胞裂解后蛋白定量，制樣后取等量蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，300 mA恒流電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，用相應(yīng)一抗于4 ℃下封閉過(guò)夜，本研究所使用一抗封閉濃度均為1∶1 000。第2天，TBST洗膜之后用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的相應(yīng)二抗室溫封閉1 h。TBST洗膜后，ECL化學(xué)發(fā)光，拍照存檔。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

本實(shí)驗(yàn)所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)采用χ±s 表示，兩樣本均數(shù)間比較采用t檢驗(yàn)，多樣本均數(shù)間比較采用單因素方差分析，組間比較采用Dunnett t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 檜木醇抑制膀胱癌J82細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)J82細(xì)胞凋亡

在給予終濃度2.5 μmol/L檜木醇作用J82細(xì)胞24 h后，細(xì)胞活力明顯下降(P<0.01)，并且該作用呈現(xiàn)明顯的量效關(guān)系(圖1A)。隨著給藥劑量(2.5、5、10和20 μmol/L)的增加，J82細(xì)胞增殖抑制率(37.2%、53.5%、87.1%和97.8%)也隨之增加。

對(duì)J82細(xì)胞進(jìn)行Annexin V/PI染色之后應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)腫瘤細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果表明檜木醇能夠明顯的誘導(dǎo)J82細(xì)胞凋亡，給予2.5 μmol/L檜木醇作用J82細(xì)胞24和48 h之后，細(xì)胞凋亡率分別上升至4.75%和19.29%(圖1B)。

使用Western blot對(duì)凋亡相關(guān)蛋白caspase 3的活性形式cleaved caspase 3的表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，隨著檜木醇作用時(shí)間的延長(zhǎng)，J82細(xì)胞cleaved caspase 3的表達(dá)量明顯上升(圖1C)。我們進(jìn)一步使用caspase的抑制劑Z-VADFMK抑制caspase活性后進(jìn)行CCK-8實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，Z-VAD-FMK(50 μmol/L，24 h)能夠顯著逆轉(zhuǎn)檜木醇(2.5 μmol/L，24 h)對(duì)J82細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用(P<0.05，圖1D)，說(shuō)明檜木醇可以抑制膀胱癌J82細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)凋亡，且該凋亡效應(yīng)依賴caspase途徑。

2.2 檜木醇能夠誘導(dǎo)膀胱癌J82細(xì)胞發(fā)生自噬

EGFP-LC3這一質(zhì)粒能夠表達(dá)綠色熒光蛋白EGFP和LC3的融合蛋白，將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入J82細(xì)胞，待其穩(wěn)定表達(dá)后給予檜木醇(2.5 μmol/L，6 h)作用細(xì)胞，在激光共聚焦顯微鏡下可以觀察到藥物作用后的細(xì)胞內(nèi)綠色熒光點(diǎn)呈明顯的聚集分布，綠色熒光點(diǎn)數(shù)明顯上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，圖2A、B)。Western blot結(jié)果顯示，使用2.5 μmol/L的檜木醇作用細(xì)胞6及12 h后，細(xì)胞LC3-Ⅱ蛋白的表達(dá)量較對(duì)照組明顯上升，P62蛋白表達(dá)量明顯下降，且該變化具有時(shí)效關(guān)系(圖2C)。說(shuō)明檜木醇處理后的膀胱癌J82細(xì)胞內(nèi)自噬泡的數(shù)量顯著增加，細(xì)胞自噬被顯著激活。

2.3 檜木醇過(guò)度激活細(xì)胞自噬誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡

3-MA是細(xì)胞自噬的抑制劑，能夠抑制細(xì)胞的自噬活動(dòng)。我們使用3-MA抑制細(xì)胞自噬后再進(jìn)行CCK-8試驗(yàn)，結(jié)果顯示，3-MA可以部分逆轉(zhuǎn)檜木醇對(duì)腫瘤細(xì)胞的作用(P<0.01，圖3A)。使用Western blot進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，3-MA (2 mmol/L，12 h)作用細(xì)胞后，LC3-Ⅱ的表達(dá)量較對(duì)照組明顯下降，檜木醇及3-MA聯(lián)合給藥的LC3-Ⅱ型的表達(dá)量較檜木醇單獨(dú)作用明顯下降(圖3B)。Cleaved caspase 3的表達(dá)量在給予了3-MA后，也出現(xiàn)了明顯的下降(圖3C)。說(shuō)明檜木醇通過(guò)過(guò)度激活細(xì)胞自噬誘導(dǎo)J82細(xì)胞凋亡。

圖1 檜木醇抑制J82細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡Fig. 1 Hinokitiol inhibits proliferation and indues apoptosis of J82 cells

圖2 檜木醇激活J82細(xì)胞自噬Fig. 2 Hinokitiol induces autophagy in J82 cells

圖3 檜木醇通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞自噬促進(jìn)細(xì)胞凋亡Fig. 3 Hinokitiol induces cell apoptosis via autophagy induction

3 討 論

細(xì)胞自噬是生命科學(xué)及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)之一，作為細(xì)胞最基本的生理過(guò)程，自噬能夠維持細(xì)胞的能量代謝及細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)。當(dāng)細(xì)胞自噬發(fā)生時(shí)，自噬泡能夠?qū)⒋到獾奈镔|(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)至溶酶體，并與溶酶體融合成自噬溶酶體，溶酶體內(nèi)的酸性水解酶將待降解的物質(zhì)水解成核酸、氨基酸、糖原及脂肪酸等小分子物質(zhì)，進(jìn)而重新參與物質(zhì)再循環(huán)或直接參與細(xì)胞的代謝供能［12］。目前已知細(xì)胞自噬與多種疾病密切相關(guān)［13］，如阿爾茨海默病、肥厚性心肌病、慢性阻塞性肺病等。細(xì)胞自噬在腫瘤中的作用目前還不是十分清楚，有假說(shuō)認(rèn)為生理狀態(tài)下的細(xì)胞自噬能夠清除細(xì)胞內(nèi)能夠引起DNA損傷的物質(zhì)，如活性氧(reactive oxygen species，ROS)、受損傷的線粒體和錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)等，從而維持細(xì)胞基因組DNA的完整性和穩(wěn)定性，進(jìn)而抑制腫瘤的發(fā)生，當(dāng)腫瘤形成后，腫瘤細(xì)胞能夠通過(guò)細(xì)胞自噬活動(dòng)獲得更多的能量，反而促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的存活和生長(zhǎng)［14］。

細(xì)胞自噬與細(xì)胞凋亡之間的關(guān)系及具體機(jī)制目前仍不明確。目前的研究認(rèn)為，當(dāng)細(xì)胞自噬過(guò)度激活時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)由于被過(guò)度消耗，從而誘發(fā)了細(xì)胞凋亡，當(dāng)細(xì)胞自噬活動(dòng)受到過(guò)度抑制時(shí)，由于代謝嚴(yán)重障礙和合成底物嚴(yán)重不足，細(xì)胞也會(huì)發(fā)生凋亡［15］。本研究結(jié)果顯示，在給予膀胱癌J82細(xì)胞檜木醇處理之后，能夠引起細(xì)胞內(nèi)EGFP-LC3熒光點(diǎn)數(shù)的增加和聚集，細(xì)胞自噬標(biāo)志蛋白LC3-Ⅱ的表達(dá)量明顯上升，說(shuō)明細(xì)胞內(nèi)自噬泡的數(shù)量顯著增多。為了進(jìn)一步說(shuō)明細(xì)胞內(nèi)自噬泡的增多是由于細(xì)胞自噬激活引起的，我們又檢測(cè)了細(xì)胞自噬特異性的底物P62蛋白的表達(dá)量［16］，結(jié)果顯示，P62的表達(dá)量較對(duì)照組明顯下降，說(shuō)明檜木醇能夠顯著激活腫瘤細(xì)胞內(nèi)的自噬活動(dòng)。在本研究中，檜木醇引起J82細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞自噬的時(shí)間(6 h)明顯早于腫瘤細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞凋亡的時(shí)間(24 h)，為了進(jìn)一步說(shuō)明檜木醇引起的細(xì)胞凋亡與自噬是否有關(guān)，我們又使用3-MA抑制細(xì)胞自噬活動(dòng)之后進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明在抑制了細(xì)胞自噬之后檜木醇對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用能夠被部分逆轉(zhuǎn)，cleaved caspase 3的表達(dá)量出現(xiàn)了明顯下降，這些結(jié)果表明檜木醇的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)作用與細(xì)胞自噬激活有關(guān)，檜木醇能夠過(guò)度激活腫瘤細(xì)胞的自噬活動(dòng)，從而誘發(fā)細(xì)胞凋亡。

天然植物提取物在腫瘤治療中具有廣闊的應(yīng)用前景，檜木醇作為其中的一員，目前的研究還不夠深入，目前已知其具有抗乳腺癌、肺癌和直腸癌的作用［10-11,17］，且該作用與細(xì)胞周期阻滯、DNA損傷和細(xì)胞自噬相關(guān)。檜木醇對(duì)膀胱癌的作用還未見(jiàn)有報(bào)道，本研究從體外水平證實(shí)了檜木醇的抗膀胱癌作用，豐富了檜木醇的抗瘤譜，并初步說(shuō)明其通過(guò)過(guò)度激活腫瘤細(xì)胞自噬誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，為該化合物的臨床應(yīng)用和未來(lái)開(kāi)發(fā)提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

［1］ 韓蘇軍, 張思維, 陳萬(wàn)青, 等. 中國(guó)膀胱癌發(fā)病現(xiàn)狀及流行趨勢(shì)分析［J］. 癌癥進(jìn)展, 2013, 11(1): 89-95.

［2］ 吳階平. 吳階平泌尿外科學(xué)［M］. 1版. 濟(jì)南: 山東科學(xué)技術(shù)出版社, 2005: 965.

［3］ SUZUKI H, UEDA T, JURANEK I, et al. Hinokitiol, a selective inhibitor of the platelet-type isozyme of arachidonate 12-lipoxygenase［J］. Biochem Biophys Res Commun, 2000, 275(3): 885-889.

［4］ TANAKA T, MUTO N, IDO Y, et al. Induction of embryonal carcinoma cell differentiation by deferoxamine, a potent therapeutic iron chelator［J］. Biochim Biophys Acta, 1997, 1357(1): 91-97.

［5］ BYEON S E, LEE Y G, KIM J C, et al. Hinokitiol, a natural tropolone derivative, inhibits TNF-alpha production in LPS-activated macrophages via suppression of NF-kappaB［J］. Planta Med, 2008, 74(8): 828-833.

［6］ MANTER D K, KELSEY R G, KARCHESY J J. Antimicrobial activity of extractable conifer heartwood compounds toward Phytophthora ramorum［J］. J Chem Ecol, 2007, 33(11): 2133-2147.

［7］ KOMAKI N, WATANABE T, OGASAWARA A, et al. Antifungal mechanism of hinokitiol against Candida albicans［J］. Biol Pharm Bull, 2008, 31(4): 735-737.

［8］ LIU S, YAMAUCHI H. p27-Associated G1 arrest induced by hinokitiol in human malignant melanoma cells is mediated via down-regulation of pRb, Skp2 ubiquitin ligase, and impairment of Cdk2 function［J］. Cancer Lett, 2009, 286(2):240-249.

［9］ SHIH Y H, LIN D J, CHANG K W, et al. Evaluation physical characteristics and comparison antimicrobial and antiinflammation potentials of dental root canal sealers containing hinokitiol in vitro［J］. PLoS One, 2014, 9(6): e94941.

［10］ WANG W K, LIN S T, CHANG W W, et al. Hinokitiol induces autophagy in murine breast and colorectal cancer cells［J］. Environ Toxicol, 2014. doi: 10.1002/tox.22023. ［Epub ahead of print］

［11］ LI L H, WU P, LEE J Y, et al. Hinokitiol induces DNA damage and autophagy followed by cell cycle arrest and senescence in gefitinib-resistant lung adenocarcinoma cells［J］. PLoS One, 2014, 9(8): e104203.

［12］ MIZUSHIMA N, KOMATSU M. Autophagy: renovation of cells and tissues［J］. Cell, 2011, 147(4): 728-741.

［13］ CHOI A M, RYTER S W, LEVINE B. Autophagy in human health and disease［J］. N Engl J Med, 2013, 368(19): 1845-1846.

［14］ WHITE E. Deconvoluting the context-dependent role for autophagy in cancer［J］. Nat Rev Cancer, 2012, 12(6): 401-410.

［15］ MARI?O G, NISO-SANTANO M, BAEHRECKE E H, et al. Self-consumption: the interplay of autophagy and apoptosis［J］. Nat Rev Mol Cell Biol, 2014, 15(2): 81-94.

［16］ BJ?RK?Y G, LAMARK T, PANKIV S, et al. Monitoring autophagic degradation of p62/SQSTM1［J］. Methods Enzymol, 2009, 452: 181-197.

［17］ LEE Y S, CHOI K M, KIM W, et al. Hinokitiol inhibits cell growth through induction of S-phase arrest and apoptosis in human colon cancer cells and suppresses tumor growth in a mouse xenograft experiment［J］. J Nat Prod, 2013, 76(12): 2195-2202.

Hinokitiol induces bladder cancer J82 cells apoptosis via autophagy induction

GAO Yuren, ZHANG Defu, WANG Liang, LIU Zhiyu (Department of Urology, the Second Hospital of Dalian Medical University, Dalian Liaoning 116023, China)

LIU Zhiyu E-mail: lzydoct@163.com

Background and purpose:Bladder cancer is the most common urological malignancy in our country which seriously threatens human health, and its incidence increased year by year. This study aimed to investigate the effects of hinokitiol on the proliferation, apoptosis and autophagy in human bladder cancer cell lines.Methods:CCK-8 assays were performed to analyze the effects of hinokitiol on the proliferation of J82 cells. Apoptosis rate was determined by flow cytometry. Cleaved caspase 3, LC3 and P62 protein expression was determined using Western blot. EGFP-LC3 microscopy assay was performed to assess autophagy.Results:Hinokitiol significantly inhibited the proliferation of J82 cells and induced cell apoptosis via caspase pathway. The apoptosis effect of hinokitiol could be partially antagonized by Z-VAD-FMK. Hinokitiol induced autophagy of J82 cells, increased LC3 expression and down-regulated P62 expression. 3-MA is able to rescue Tet-induced cell death.Conclusion:Hinokitiol can inhibit the proliferation of J82 cells and induce cell apoptosis via autophagy activation.

Hinokitiol; Bladder cancer; Cell apoptosis; Cell proliferation; Cell autophagy

10.3969/j.issn.1007-3969.2015.05.008

R737.14

A

1007-3639(2015)05-0365-06

2014-12-03

2015-01-29）

劉志宇 E-mail:lzydoct@163.com