師海蓉，陳瑩，李長雷，邱文洪

1.江漢大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)與病理生理學(xué)教研室，湖北 武漢 430056；

2.江漢大學(xué)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室，湖北 武漢 430056；

3.江漢大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心，湖北 武漢 430056

慢病毒介導(dǎo)的shRNA靶向干擾I2PP2A胃癌穩(wěn)定細胞株的建立

師海蓉1，陳瑩1，李長雷2，邱文洪3

1.江漢大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)與病理生理學(xué)教研室，湖北 武漢 430056；

2.江漢大學(xué)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室，湖北 武漢 430056；

3.江漢大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心，湖北 武漢 430056

背景與目的：蛋白磷酸酶2A抑制劑-2(inhibitor 2 of protein phosphatase 2A，I2PP2A)在包括胃癌的多種腫瘤中過度表達，提示其可能在胃癌的發(fā)生中發(fā)揮重要作用。為進一步探討I2PP2A的功能及其在胃癌發(fā)生中的作用，建立穩(wěn)定抑制I2PP2A基因表達的人胃癌BGC823細胞株。方法：篩選出I2PP2A基因的RNA干擾(RNA interference，RNAi)有效靶序列，合成靶序列的Oligo DNA并構(gòu)建pGLV2-shRNA-I2PP2A慢病毒載體，酶切和測序鑒定正確后，經(jīng)病毒包裝，感染BGC823細胞，經(jīng)嘌呤霉素篩選穩(wěn)定表達細胞株，通過實時定量PCR(real-time PCR，RT-PCR)和蛋白［質(zhì)］印跡法(Western blot)鑒定I2PP2A的表達。結(jié)果：重組慢病毒質(zhì)粒經(jīng)測序鑒定正確；RT-PCR和Western blot證實干擾I2PP2A后，BGC823細胞株中I2PP2A表達水平明顯降低，抑制率約為90%。結(jié)論：成功構(gòu)建了I2PP2A shRNA慢病毒表達載體，建立了穩(wěn)定抑制I2PP2A基因表達的人胃癌BGC823細胞株，為進一步研究I2PP2A在胃癌發(fā)生中的作用提供了可靠的細胞模型。

蛋白磷酸酶2A抑制劑-2；胃癌；慢病毒；穩(wěn)定細胞株

蛋白磷酸酶2A抑制劑-2(inhibitor 2 of protein phosphatase 2A，I2PP2A)，又稱SET基因［1］、模板活化因子-1(template activating factor 1β，TAF1β)［2］等。已有研究表明I2PP2A廣泛表達于人類不同組織和細胞系，其表達異常與多種疾病相關(guān)。對胃癌組織mRNA進行I2PP2A cDNA表達分析發(fā)現(xiàn)，腫瘤組織中I2PP2A表達是相應(yīng)正常組織的2倍或更高［3］。在SETCAN轉(zhuǎn)基因小鼠中伴隨有胃黏膜的自發(fā)增生與β-catenin的過表達［4］。本實驗室前期研究也發(fā)現(xiàn)，人胃癌組織中有I2PP2A的表達，且其表達水平明顯高于癌旁黏膜及正常組織，提示I2PP2A蛋白在胃癌的發(fā)生、發(fā)展中具有重要的作用。為了探討I2PP2A在胃癌的發(fā)生及發(fā)展中的作用，本實驗通過構(gòu)建干擾I2PP2A的慢病毒重組質(zhì)粒，建立穩(wěn)定靶向干擾I2PP2A表達的胃癌細胞株，為研究I2PP2A在胃癌發(fā)生中的作用提供了可靠的細胞模型。

1 材料和方法

1.1 材料

為了衡量算法的檢測精度，定義均方根誤差(Root Mean Square Error,RMSE)，其數(shù)學(xué)表達式如下：

大腸桿菌DH5α、HEK293T細胞和人胃癌細胞BGC823均為本室保存。引物由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成。Pfu DNA polymerase購自生工生物工程(上海)股份有限公司。實驗中使用到的DNA內(nèi)切酶、DNA連接酶和DNA marker均購自加拿大MBI Fermentas公司。PCR產(chǎn)物純化試劑盒、DNA片段純化回收試劑盒及質(zhì)粒抽提試劑盒購自德國Qiagen公司；慢病毒表達系統(tǒng)由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司提供；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清和胰蛋白酶購自美國Gibco公司；嘌呤霉素購自美國Sigma公司；兔多克隆抗體I2PP2A以及辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG購自美國Santa Cruz公司，鼠單克隆抗體GAPDH購自武漢博士德生物工程有限公司。用于蛋白［質(zhì)］印跡法(Western blot)檢測的增強化學(xué)發(fā)光試劑ECL和BCA蛋白定量試劑盒購自美國Pierce公司。PVDF轉(zhuǎn)印膜購自美國Millipore公司。

1.2 方法

1.2.1 shRNA序列的設(shè)計及合成

為進一步確定穩(wěn)定篩選是否成功，取各組生長狀態(tài)良好的細胞提取總蛋白做Western blot分析與鑒定，結(jié)果顯示，與BGC823組相比，pGLV2-shRNA-I2PP2A的I2PP2A的表達明顯減少(P<0.01)，而pGLV2-shRNA.NC的I2PP2A表達未見下降。表明穩(wěn)定表達siRNA-I2PP2A細胞構(gòu)建成功。為進一步確定穩(wěn)定細胞株構(gòu)建成功，細胞傳至50代再次進行鑒定，抑制效果仍非常顯著(圖3)。說明細胞株內(nèi)I2PP2A的表達得到了穩(wěn)定抑制，成功的建立了I2PP2A表達穩(wěn)定抑制的胃癌細胞株。

表1 shRNA干擾序列Tab. 1 Sequence of shRNA oligonucleotide

1.2.2 重組慢病毒質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定

1.2.5 實時定量PCR(real-time PCR，RT-PCR)檢測I2PP2A mRNA的表達

分別溶解正義和反義單鏈shRNA模板，取等量模板寡核苷酸及10×DNA退火緩沖液，混勻后按照如下程序進行退火處理：95 ℃ 5 min；85 ℃ 5 min；75 ℃ 5 min；70 ℃ 5 min；得到濃度為10 μmol/L的shRNA模板。取pGLV2載體，經(jīng)AgeI和EcoRI雙酶切，并回收，將退火后的雙鏈shRNA模板與線性化的載體于22 ℃連接1 h，轉(zhuǎn)化JM 109感受態(tài)細胞，涂布于含Amp的LB平板上，37 ℃培養(yǎng)過夜；挑取單克隆菌落，接種于含Amp的LB培養(yǎng)液中，37 ℃培養(yǎng)過夜；收集菌液，抽提重組質(zhì)粒測序鑒定(由上海英駿生物技術(shù)有限公司完成)，測序正確的質(zhì)粒命名為pGLV2-shRNA-I2PP2A及陰性對照質(zhì)粒pGLV2-shRNA.NC。

1.2.3 慢病毒的制備及病毒滴度測定

1.2.7 CCK-8檢測穩(wěn)定表達細胞增殖

柏林的博物館好看，柏林的咖喱香腸好吃，但如果你問我在柏林漫游時，對哪里印象最深刻，我一定會回答：街頭形形色色的柏林熊！它們或呆萌，或文藝，或指明道路，或表示歡迎。這些花花綠綠、憨態(tài)可掬的“大塊頭”經(jīng)過藝術(shù)家鬼斧神工的改造，幻化為個性鮮明的城市文化符號。從2002年開始，它們走出德國，開啟“聯(lián)合熊熊展”的世界環(huán)游之旅。很多國家都擁有一頭代表自己國家的“柏林熊”，可愛的大熊們手牽著手，向世界呼喊著：“和平，和平！”

2.4 Western blot鑒定I2PP2A的表達

1.2.4 慢病毒感染及穩(wěn)定表達細胞株篩選

以此證明，如果我們把后進生看作是未經(jīng)雕琢的璞玉，那么老師的責(zé)任就是把它挖掘出來，琢去那些掩蓋著它原來光輝的雜質(zhì)，使它重放光芒。

該地鐵區(qū)間隧道覆土厚16.15 m，產(chǎn)生沉降的隧道區(qū)域及聯(lián)絡(luò)通道底部土質(zhì)為④3淤泥質(zhì)粉質(zhì)黏土層。隧道下部為軟臥層，厚 8 m；軟臥層含水量較高，為45.7%；壓縮模量非常低，為2.48；標(biāo)貫擊數(shù)僅為1.6。該土層土質(zhì)蠕變性非常敏感，且自身強度非常低，周邊施工對土體擾動以及對隧道沉降與收斂影響非常明顯。

收集細胞，以T R I z o l試劑提取細胞總RNA，紫外分光光度計定量RNA，瓊脂糖凝膠電泳驗證R N A完整性。以基因特異性引物進行PCR擴增，以GAPDH作為內(nèi)參。I2PP2A引物序列：上游引物為5’-CAGAAGAGGTCAGAATTGATCGC-3’，下游引物為5’-TGGTTGACAAATGTTGTT ACCCA-3’，擴增片段長度為62 bp。GAPDH引物序列：上游引物為5’-CATGAGAAGTATGAC A A C A G C C T-3’，下游引物為5’-AGTCCTTCCACGATACCAAAGT-3’，擴增片段長度為113 bp。PCR擴增產(chǎn)物電泳結(jié)果顯示，PCR產(chǎn)物大小正確，無雜帶說明無非特異性擴增。實驗重復(fù)3次。組間的表達差異通過計算2-ΔΔCt予以表示。反應(yīng)條件：95 ℃變性3 min；95 ℃ 12 s，62 ℃ 40 s，共40個循環(huán)。實驗重復(fù)3次。I2PP2A表達抑制率(%)=(1-轉(zhuǎn)染組I2PP2A相對表達量/對照組I2PP2A相對表達量)×100%。用同樣的方法分別測定第50代子細胞系對I2PP2A的抑制率，檢測細胞傳代對shRNA抑制力的影響。

1.2.6 Western blot檢測I2PP2A蛋白的表達

培養(yǎng)的穩(wěn)定表達細胞株至第10代，收集細胞提取總蛋白，進行SDS-PAGE電泳，電泳后濕轉(zhuǎn)至PVDF膜，含5%脫脂奶粉的TBS-T(含0.05% Tween-20的TBS)37 ℃封閉60 min，加1∶1 000稀釋的抗I2PP2A蛋白的多克隆抗體4 ℃溫育過夜。TBS-T漂洗5 min×3次，加入1∶2 000稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG 37 ℃溫育45 min。TBS-T漂洗5 min×3次，ECL化學(xué)發(fā)光試劑檢測。圖像應(yīng)用Gel-Pro Analyzer軟件進行灰度分析。

將狀態(tài)良好、處于對數(shù)生長期的293T細胞接種于10 cm細胞培養(yǎng)皿(約5×l06個細胞)，培養(yǎng)過夜后，將重組質(zhì)粒pGLV2-shRNA-I2PP2A及陰性對照質(zhì)粒各4 μg，在LipofectamineTM2000介導(dǎo)下與包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細胞，具體操作按試劑說明書進行。轉(zhuǎn)染后1 d，更換10 mL含10%血清DMEM培養(yǎng)液。置于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的飽和濕度培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)；分別在轉(zhuǎn)染后48和72 h后，收集細胞培養(yǎng)上清液進行濃縮，用0.45 μm孔徑的濾器(Millipore公司產(chǎn)品)過濾，收集濾液，50 000×g離心提純獲得病毒純化液1 mL，分裝5管，每管200 μL，于-80 ℃冰箱中凍存?zhèn)溆?。因包裝所用病毒pGLV2-U6-puro不帶GFP不便直接觀察，實驗選用pGLV2-U6-GFP病毒同時包裝作參照，以判定病毒的包裝滴度及目的細胞的侵染效率。

取生長狀態(tài)良好的胃癌細胞，按5×103個/孔的細胞濃度接種于96孔板，每組重復(fù)5次。分別培養(yǎng)1、2、3、4 d，除去培養(yǎng)液，加入新鮮的培養(yǎng)基100 μL，每孔避光加入10 μL CCK-8，避光培養(yǎng)2 h，檢測450 nm的吸光度(D450)值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行方差分析、t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

隨著經(jīng)濟全球化和文化多元化的不斷深入,為推動區(qū)域性合作與全球性發(fā)展,在多種語言交織下達成共識,翻譯行業(yè)發(fā)展迅猛。各國對翻譯服務(wù)也出臺了一系列的標(biāo)準(zhǔn)文件,希望通過統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)對譯文質(zhì)量進行有效的控制。然而,相對國外比較健全的翻譯質(zhì)量管理體系,國內(nèi)翻譯市場準(zhǔn)入門檻較低,屢現(xiàn)壓價等惡性競爭,整個行業(yè)不夠規(guī)范,翻譯專業(yè)的課程設(shè)置遠不能滿足市場對人才的實際需求,這些問題都給翻譯產(chǎn)出的質(zhì)量帶來了極大的挑戰(zhàn)。

2 結(jié) 果

2.1 重組慢病毒質(zhì)粒的鑒定

淺表層的危巖清理，采用人工配合風(fēng)鎬、撬棍、鋼釬進行，施工作業(yè)前拴好安全繩，安全繩拴于穩(wěn)定的樹樁上或插筋上，清理時按4～6人為1作業(yè)小組，1人負責(zé)安全監(jiān)護，其余人員用風(fēng)鎬、撬棍和鋼釬進行清撬，多組平行錯距作業(yè)，表層的危巖清撬完成后，及時請地質(zhì)工程師及相關(guān)工程人員現(xiàn)場判定確認處理效果，明確是否繼續(xù)進行清撬施工，如圖2所示。

重組慢病毒質(zhì)粒pGLV2-shRNA-I2PP2A經(jīng)測序鑒定證實，插入的基因序列與設(shè)計的序列完全一致，無堿基突變(圖1)，表明慢病毒質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2.2 穩(wěn)定表達細胞株的篩選

病毒感染BGC823細胞24 h后，用不含病毒上清液的正常培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞，待細胞培養(yǎng)至80%～90%融合時，加入致死濃度摸索試驗中的嘌呤霉素最佳藥物濃度(0.4 μg/mL)，同時設(shè)立空白對照組。維持嘌呤霉素濃度，隔天換液，觀察。經(jīng)過3個嘌呤霉素篩選周期后，感染重組病毒組陽性細胞存活，而未感染病毒的野生BGC823細胞組細胞幾乎全部死亡。至空白組細胞全部被殺死后(大約1周)，收集存活的細胞并擴增培養(yǎng)建立穩(wěn)定表達的pGLV2-shRNAI2PP2A及陰性對照質(zhì)粒pGLV2-shRNA.NC細胞系(圖2)。

圖1 重組慢病毒質(zhì)粒的測序圖譜Fig. 1 Sequencing of recombinant lentivirus plasmid

圖2 嘌呤霉素篩選后各孔存活情況Fig. 2 Cells survival after puromycin selection

2.3 各組細胞中I2PP2A mRNA的轉(zhuǎn)錄水平

取各組生長狀態(tài)良好的細胞提取RNA，用RT-PCR檢測各組細胞I2PP2A的表達水平。結(jié)果顯示，與BGC823和pGLV2-shRNA-NC兩組相比，pGLV2-shRNA-I2PP2A的I2PP2A mRNA表達顯著降低(P<0.01)，而pGLV2-shRNA.NC中I2PP2A mRNA的表達與BGC823細胞相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05，表2)。表明經(jīng)慢病毒介導(dǎo)的RNA干擾(RNA interference，RNAi)作用后，BGC823細胞I2PP2A基因mRNA的轉(zhuǎn)錄水平明顯降低，抑制率為93%。細胞傳至50代再次鑒定，I2PP2A的mRNA抑制率為91%，可見細胞傳代對shRNA抑制力的影響差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

慢病毒侵染效率檢測表明當(dāng)慢病毒的滴度達到1×108TU/mL時，慢病毒侵染BGC823細胞的效率分別可達到75%。分別用陽性重組病毒和對照重組病毒以此滴度感染提前1 d接種于6孔細胞培養(yǎng)板中的BGC823細胞(1.5×106個細胞/孔)，同時加入終濃度為5 μg/mL的聚凝胺。24 h后，用不含病毒上清的正常培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞，待細胞培養(yǎng)至80%～90%融合時，加入致死濃度摸索試驗中的嘌呤霉素最佳藥物濃度(0.4 μg/mL)，同時設(shè)立空白對照組。維持嘌呤霉素濃度，隔天換液，觀察。至空白組細胞全部被殺死后(大約1周)，收集存活的細胞并擴增培養(yǎng)建立穩(wěn)定表達的pGLV2-shRNA-I2PP2A及陰性對照質(zhì)粒pGLV2-shRNA.NC細胞系。

采用逐孔稀釋法在293T細胞中測定病毒滴度。測定前1 d，將滴度測定所需的293T細胞接種于96孔板，每孔加3×104個細胞，用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，體積為100 μL。將慢病毒原液10 μL，用10%FBS的DMEM培養(yǎng)基10倍稀釋3個梯度(1∶10、1∶100、1∶1 000)后感染293T細胞，24 h后換液，72 h熒光顯微鏡觀察熒光并統(tǒng)計表達GFP的細胞數(shù)目，計算病毒滴度。病毒滴度計算公式：病毒滴度(TU/mL)=帶熒光的細胞數(shù)目/稀釋的濃度梯度×103。

根據(jù)前期實驗結(jié)果確定的有效靶序列，按如下結(jié)構(gòu)設(shè)計：pGLV2-shRNA模板中的loop結(jié)構(gòu)選用了CTCGAG以避免形成終止信號。正義鏈模板的5’端添加了CCGG，與AgeI酶切后形成的黏端互補；反義鏈模板的5’端添加了AATT，與EcoRI酶切后形成的黏端互補。按同樣方法設(shè)計l條陰性對照(shRNA.NC)序列(表1)。

老姆登村位于怒江東岸的碧羅雪山，海拔從1300米至2300米，6個自然村，12個村民小組。全村有317戶,1168人。村子海拔2000米以上為人工防護林及原始森林。種植業(yè)與林副業(yè)相結(jié)合，種植業(yè)尤為發(fā)達。目前村里正在實施一戶一宅的政策，村民們不能建新房，也不能加蓋房屋，因此限制了旅游發(fā)展。國家公園的建設(shè)將會對當(dāng)?shù)氐穆糜螛I(yè)發(fā)展帶來機遇，但游客的到來也會破壞杜鵑林，因此，村委會制定了保護七蓮湖的規(guī)定，包括禁止亂砍亂伐，呼吁導(dǎo)游帶游客到七蓮湖時自帶煤炭來解決生活用火，并要求村民加強監(jiān)督。

表2 各組細胞I2PP2A mRNA的轉(zhuǎn)錄水平Tab. 2 Transcription levels of I2PP2A mRNA in various groups

圖3 Western blot檢測I2PP2A蛋白的表達Fig. 3 I2PP2A protein detected by Western blot

2.5 CCK-8法檢測穩(wěn)定表達細胞株的增殖

增殖實驗結(jié)果顯示，I2PP2A穩(wěn)定抑制后對細胞的增殖在24 h即出現(xiàn)明顯抑制。與對照組相比，穩(wěn)定表達細胞對增殖的抑制在1～4 d差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。由此可以看出，降低I2PP2A的表達水平可有效抑制胃癌細胞BGC823的增殖能力(圖4)。

中國雖然已成為世界上第二大經(jīng)濟體，但在金融業(yè)發(fā)展水平上未能進入世界第一效率陣營，在金融服務(wù)及金融監(jiān)管上仍需要向世界先進水平看齊。

圖4 CCK-8法檢測穩(wěn)定表達細胞增殖抑制作用Fig. 4 The proliferation of stable transfection cell lines tested by CCK-8 assay

3 討 論

大量的研究表明I2PP2A廣泛表達于人類不同組織和細胞系，具有高度保守的結(jié)構(gòu)特征和進化機制，提示I2PP2A蛋白具有重要的功能，與多種生物活動相關(guān)，如細胞周期調(diào)控［5］、細胞凋亡［6-8］、遷移［9-10］和DNA損傷修復(fù)［11］及氧化應(yīng)激［12］等多個生物過程，是重要的細胞因子，且I2PP2A的異常表達可能與胃癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)［3-4］。本實驗室前期研究也發(fā)現(xiàn)，人胃癌組織中I2PP2A的表達水平明顯高于癌旁黏膜及正常組織，且I2PP2A在胃癌細胞株BGC823和SGC7901中均有很好的表達，與細胞的侵襲能力成正相關(guān)，提示I2PP2A蛋白在胃癌的發(fā)生、發(fā)展中可能具有重要的作用。目前研究認為I2PP2A可通過抑制腫瘤抑制因子蛋白磷酸酶2A(protein phosphatase 2A，PP2A)［13-14］和轉(zhuǎn)移抑制因子nm23-H1［15］兩條通路參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。PP2A被認為是潛在的腫瘤抑制因子和治療靶標(biāo)［16-18］，主要通過下調(diào)在腫瘤中異常表達的Akt、β-catenin和c-myc來發(fā)揮其抑癌作用［19-21］。因此，下調(diào)在胃癌中過表達的I2PP2A可作為一個潛在的腫瘤治療的靶點。

畔湖鎮(zhèn)伴湖，像截舊褲腳丟在洞庭湖邊。那條青石板路終日里濕漉漉的，灑滿魚腥味。兩排舊木板房歪歪斜斜，瓦脊上這里那里粘著干枯的青苔蘚。街雖古舊，卻因船碼頭仗勢，人氣挺旺。終日里肩擔(dān)穿插，人流不斷。鎮(zhèn)政府坐落在地勢較高的街北頭，那里從前是救撈局的地盤，有一幢氣派的古建筑。后來拆了建了辦公樓。

RNAi能特異性抑制靶基因的表達，具有高特異性、高效性、高穩(wěn)定性、可傳播性和可遺傳性等特點［22］，已成為基因功能、人類疾病模型及基因治療研究的常用技術(shù)［23-24］。siRNA轉(zhuǎn)染技術(shù)的關(guān)鍵在于轉(zhuǎn)染效率的高低，而慢病毒載體［25-26］不僅轉(zhuǎn)導(dǎo)效率較高，還可以將外源基因或外源的shRNA有效地整合到靶細胞基因組中，是目前常用的有效實現(xiàn)目的基因或目的shRNA的長期、穩(wěn)定表達的理想載體。本研究采用的慢病毒表達載體是以國際通用的第3代載體系統(tǒng)為基礎(chǔ)，通過一定的改建，構(gòu)成的4質(zhì)粒體系。其中，轉(zhuǎn)移載體包含轉(zhuǎn)移目的基因的慢病毒骨架及其包裝產(chǎn)生相應(yīng)基因組RNA的所有順式作用元件，并且可以單一或多重組合的穩(wěn)定或條件誘導(dǎo)性表達轉(zhuǎn)移基因或shRNA；另外，通過3個輔助質(zhì)粒(pGag/Pol、pRev和pVSV-G)，提供病毒包裝所需的反式作用因子，同時采用“自我滅活”修飾，阻止子代病毒自我復(fù)制和轉(zhuǎn)移，從而確保產(chǎn)生的慢病毒具備良好的生物安全性。與MuLV等逆轉(zhuǎn)錄病毒載體相比，慢病毒載體的整合更偏向于宿主細胞基因組的基因表達活躍區(qū)，激活沉默的原癌基因的概率可能比逆轉(zhuǎn)錄病毒載體低且U6啟動子能在宿主細胞中指導(dǎo)siRNA持續(xù)表達。同時本實驗中所用載體系統(tǒng)帶有抗嘌呤霉素的抗性基因，可據(jù)此對侵染細胞進行篩選，可為方便有效獲得穩(wěn)定表達細胞株提供實驗基礎(chǔ)。

RT-PCR和Western blot檢測穩(wěn)定表達細胞株的I2PP2A mRNA和蛋白的表達水平，發(fā)現(xiàn)對I2PP2A的抑制率約為90%，并且實驗結(jié)果也顯示，在20、30和50代中，篩選出的穩(wěn)定表達株仍具有較高的抑制效果。以上結(jié)果表明針對靶基因的特異RNAi慢病毒感染后獲得了明顯的干擾效果，證實了我們構(gòu)建的RNAi慢病毒能在人胃癌細胞BGC823內(nèi)能夠高效、特異、穩(wěn)定的對I2PP2A基因產(chǎn)生抑制作用。

穩(wěn)定沉默I2PP2A的BGC823細胞系的獲得為更深入的研究I2PP2A在胃癌中的調(diào)控作用及機制提供了可靠的體外細胞模型，為研究I2PP2A蛋白生物學(xué)功能的分子機制提供了有力工具。

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Establishment of a stable gastric cancer cell line with lentivirus-mediated RNA interference for I2PP2A

SHI Hairong1,CHEN Ying1, LI Changlei2, QIU Wenhong3(1.Department of Pathology and Pathophysiology, School of Medicine, Jianghan University, Wuhan Hubei 430056, China; 2.Department of Immunology, School of Medicine, Jianghan University, Wuhan Hubei 430056, China; 3.Laboratory Animals Center, School of Medicine, Jianghan University, Wuhan Hubei 430056, China)

QIU Wenhong E-mail: qiuwenhong@hotmail.com

Background and purpose:Overexpression of inhibitor of protein phosphatase 2 A-2 (I2PP2A) in many tumors including gastric cancer suggests that I2PP2A may contribute to the development of gastric cancer. To further study the biological function of I2PP2A and its role in gastric cancer, we established a BGC823 cell line for stable expression of shRNA targeting human I2PP2A gene.Methods:A double-stranded shRNA targeting the I2PP2A was designed, synthesized and was inserted into a lentivirus vector (pGLV2), and the insertion was identified by restriction endonuclease analysis and DNA sequencing. BGC823 cells were then transfected with the packaged recombinant lentivirus, and resistant cell clones were selected with puromycin. The expression of I2PP2A was examined using real-time PCR (RT-PCR) and Western blot.Results:Sequencing result proved that recombinant lentivirus vector pGLV2-shRNA-I2PP2A was constructed correctly. RT-PCR and Western blot results confirmed that the expression of I2PP2A was significantly down-regulated in this infected BGC823 cell line. The efficiency of siRNA interference of I2PP2A could be up to about 90%.Conclusion:A lentiviral vector carrying a shRNA targeting the I2PP2A gene is successfully constructed, and a BGC823 cell line stably expressing I2PP2A shRNA is established with this lentiviral system.

Inhibitor 2 of protein phosphatase 2A; Gastric cancer; Lentivirus; Stable cell line

10.3969/j.issn.1007-3969.2015.05.006

R735.2

A

1007-3639(2015)05-0352-08

2014-05-27

2014-09-15）

國家自然科學(xué)基金(81001082)。

邱文洪 E-mail:qiuwenhong@hotmail.com