劉利平，楊盛力，何婉，孫楓林，鮑世韻

1.暨南大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院/深圳市人民醫(yī)院肝膽外科，廣東 深圳 518020；

2. 華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬梨園醫(yī)院普通外科，湖北 武漢 430077；

3.暨南大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院/深圳市人民醫(yī)院腫瘤科，廣東 深圳 518020

乙肝病毒X蛋白上調(diào)肝癌細胞缺氧誘導(dǎo)因子-1α的作用和機制研究

劉利平1，楊盛力2，何婉3，孫楓林1，鮑世韻1

1.暨南大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院/深圳市人民醫(yī)院肝膽外科，廣東 深圳 518020；

2. 華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬梨園醫(yī)院普通外科，湖北 武漢 430077；

3.暨南大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院/深圳市人民醫(yī)院腫瘤科，廣東 深圳 518020

背景與目的：乙肝病毒X蛋白(hepatitis B virus X protein，HBx)和缺氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α)在肝癌發(fā)生、發(fā)展過程中起重要作用。有研究顯示，兩者在肝癌組織中的表達呈正相關(guān)，但相關(guān)機制尚不明確。本研究擬進一步在細胞水平上探討HBx對HIF-1α的調(diào)控作用及機制。方法：用LipofectemineTM2000包裹HBx表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到肝癌Huh7細胞。蛋白［質(zhì)］印跡法(Western blot)檢測Huh7細胞中HIF-1α和HIF-1β蛋白的表達；特異性試劑盒檢測HIF-1α轉(zhuǎn)錄活性；實時定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)檢測HIF-1α及其靶基因血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)和多藥耐藥基因1(multi-drug resistance gene 1，MDR1)mRNA表達變化；免疫共沉淀法檢測HIF-1α、HBx和希佩爾林道病腫瘤抑制蛋白(protein von Hippel-Lindau，pVHL)間的相互作用。結(jié)果：轉(zhuǎn)染HBx質(zhì)粒后，Huh7細胞中HIF-1α蛋白表達、轉(zhuǎn)錄活性及其靶基因VEGF和MDR1的mRNA表達水平明顯上調(diào)(P<0.05)，然而HBx對HIF-1α mRNA表達水平?jīng)]有明顯影響(P>0.05)。同時，HBx顯著削弱pVHL介導(dǎo)的泛素化水解蛋白酶降解HIF-1α的活性。免疫共沉淀法檢測進一步提示，HBx可直接結(jié)合pVHL，而對HIF-1α沒有結(jié)合作用。結(jié)論：HBx可能通過直接結(jié)合pVHL，抑制其與HIF-1α的相互作用，從而增強HIF-1α蛋白的穩(wěn)定性及轉(zhuǎn)錄活性。

肝細胞癌；缺氧誘導(dǎo)因子-lα；乙肝病毒X蛋白；希佩爾林道病腫瘤抑制蛋白

肝細胞性肝癌是我國最常見的惡性腫瘤之一，與慢性乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染密切相關(guān)［1］。乙肝病毒X蛋白(hepatitis B virus X protein，HBx)是HBV開放讀碼框編碼的一種多功能蛋白，通過與細胞內(nèi)多種與轉(zhuǎn)錄、基因調(diào)控有關(guān)的因子結(jié)合，廣泛激活病毒與細胞的啟動子，參與基因和信號通路調(diào)控，與肝癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)［2-3］。肝臟雖然血供豐富，但腫瘤內(nèi)由于新生血管功能缺陷和細胞代謝旺盛，常常導(dǎo)致局部組織嚴(yán)重缺氧。缺氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α)是腫瘤細胞調(diào)節(jié)適應(yīng)缺氧微環(huán)境最重要的因子，對維持腫瘤細胞的能量代謝、新血管生成、促進腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移、介導(dǎo)腫瘤化療耐藥起著重要作用［4-5］。作為肝癌發(fā)生、發(fā)展兩個最重要的調(diào)節(jié)蛋白，HBx和HIF-1α的相互作用越來越受到關(guān)注，雖有研究顯示兩者在肝癌組織中的表達呈正相關(guān)，但相關(guān)機制尚未完全闡明［6］。本研究擬進一步在細胞水平上探討HBx的HIF-1α的調(diào)控作用及相關(guān)機制。

1 材料和方法

1.1 材料

HBx質(zhì)粒(FLAG-154X)由美國德雷塞爾大學(xué)醫(yī)學(xué)院M. J. Bouchard博士贈送，經(jīng)PCR擴增HBx序列并插入pcDNA3.1載體，構(gòu)建HBx表達質(zhì)粒(pc3.1-HBx)，HIF-1α質(zhì)粒(HA-HIF-1α)和帶有FLAG標(biāo)簽的希佩爾林道病腫瘤抑制蛋白(protein von Hippel-Lindau，pVHL)質(zhì)粒(FLAG-pVHL)由美國國立癌癥研究所的J. S Issaacs博士贈送。PCR引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green Supermix和脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染劑LipofectamineTM2000購自美國Invitrogen公司，鼠抗人單克隆抗體HIF-1α、HIF-1β、HBx和β-actin、HRP標(biāo)記的兔抗鼠IgG、蛋白A/G磁珠購自美國Santa Cruz公司，鼠抗人單克隆抗體FLAG購自美國Sigma公司。HIF-1α特異性轉(zhuǎn)錄活性檢測試劑盒購自美國Cayman公司。細胞培養(yǎng)液DMEM和胎牛血清購自美國Hyclone公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)和質(zhì)粒轉(zhuǎn)染

肝癌細胞Huh7由含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液在37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。質(zhì)粒轉(zhuǎn)染時，將Huh7細胞(5×105個/孔)接種于6孔板中，在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中生長至80%左右匯度。采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染，按照脂質(zhì)體說明書操作，24 h后收集細胞檢測。

1.2.2 實時定量RCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)檢測細胞mRNA的表達

收獲各組Huh7細胞，加入TRIzol液1 mL提取細胞總RNA，測RNA的濃度和純度，取1 μg的總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。各基因需要的PCR引物見表1。cDNA被稀釋10倍后每個PCR反應(yīng)孔中加入1 μL，并加入10 nmol的上、下游引物各0.5 μL，無核酸酶的超凈水8 μL和SYBR Green Supermix 10 μL。PCR反應(yīng)在ABI 7900HT qRT-PCR檢測系統(tǒng)上運行，程序設(shè)置為：95 ℃2 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 60 s，40個循環(huán)；72 ℃10 min。采用2?ΔΔCt法計算相對mRNA表達。

表1 qRT-PCR引物Tab. 1 The primers for qRT-PCR

1.2.3 蛋白［質(zhì)］印跡法(Western blot)檢測蛋白的表達

用RIPA液提取細胞內(nèi)總蛋白，采用SDSPAGE 凝膠電泳分離蛋白，采用恒壓100 V，90 min將蛋白電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉2 h，加入1∶1 000稀釋的HIF-1α、HIF-1β、HBx、FLAG和β-actin抗體，于4 ℃溫育過夜。TBST洗膜后加入1︰3 000稀釋的過氧化物酶標(biāo)二抗，室溫溫育60 min，TBST洗膜，ECL化學(xué)發(fā)光顯影。

1.2.4 免疫共沉淀檢測蛋白間相互作用

用RIPA液提取細胞內(nèi)總蛋白，取500 μg總蛋白加入HBx抗體10 μg振蕩溫育12 h，然后加入20 μL蛋白A/G瓊脂糖磁珠沉淀免疫復(fù)合物，RIPA液洗滌3遍后，加入SDS緩沖液30 μL，置于水中煮沸10 min，然后行Western blot檢測：用HBx、HIF-1α和FLAG抗體檢測目的蛋白表達。

1.2.5 HIF-1α轉(zhuǎn)錄活性檢測

采用美國Cayman公司的試劑盒檢測HIF-1α轉(zhuǎn)錄活性［7］。首先提取細胞核蛋白，取20 μg核蛋白加入到預(yù)先包被含有HIF-1α反應(yīng)原件的特異性雙鏈DNA的96孔板中，然后4 ℃溫育16 h，PBS洗板3遍后加入特異性HIF-1α抗體，再用PBS洗板3遍并加入HRP標(biāo)記的特異性二抗，然后加入顯色劑在用分光光度計在450 nm波長下檢測吸光度(D)值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出相對HIF-1α轉(zhuǎn)錄活性。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 HBx對HIF-1α的表達調(diào)節(jié)和轉(zhuǎn)錄活性作用

在常氧條件下，Huh7細胞中HIF-1α被pVHL介導(dǎo)的泛素化水解酶降解，通常Western blot檢測表達很低。為了更好地顯示HBx對HIF-1α的調(diào)節(jié)作用，本研究共轉(zhuǎn)染了HIF-1α表達質(zhì)粒以提高HIF-1α的基礎(chǔ)表達水平。HBx顯著上調(diào)HIF-1α的表達，然而對HIF-1β的表達沒有明顯影響(圖1A)。HIF-1α轉(zhuǎn)移到細胞核與HIF-1β形成二聚體，并與下游靶基因啟動子結(jié)合進而促進其轉(zhuǎn)錄。HBx顯著上調(diào)HIF-1α的轉(zhuǎn)錄活性(P<0.05，圖1B)。進一步qRT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染HBx后HIF-1α靶基因血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)和多藥耐藥基因1(multi-drug resistance gene 1，MDR1) mRNA表達明顯升高(P<0.05，圖1C)。因此，HBx對肝癌細胞HIF-1α的表達和轉(zhuǎn)錄活性有明顯的上調(diào)作用。

2.2 HBx增強HIF-1α表達和轉(zhuǎn)錄活性作用機制

為了明確HBx上調(diào)HIF-1α表達作用機制，本研究首先檢測HBx對HIF-1α mRNA的影響。HBx對HIF-1α mRNA表達水平?jīng)]有明顯影響(P>0.05，圖2A)。pVHL可以促進泛素化水解酶介導(dǎo)的HIF-1α降解，因而Huh7細胞在轉(zhuǎn)染pVHL質(zhì)粒后HIF-1α表達明顯降低。然而，同時轉(zhuǎn)染HBx質(zhì)粒的Huh7細胞HIF-1α表達沒有明顯改變，提示HBx可能通過抑制pVHL的作用上調(diào)HIF-1α的表達(圖2B)。免疫共沉淀實驗結(jié)果顯示，HBx可以結(jié)合pVHL從而干擾pVHL介導(dǎo)的HIF-1α泛素化水解酶降解途徑，但HBx對HIF-1α沒有結(jié)合作用(圖2C)。因此，HBx可能通過結(jié)合pVHL，阻止其與HIF-1α相互作用，從而增強HIF-1α的穩(wěn)定性。

圖1 HBx對HIF-1α的表達調(diào)節(jié)和轉(zhuǎn)錄活性作用Fig. 1 The roles of HBx in regulating the expression and transcriptional activation of HIF-1α

圖2 HBx增強HIF-1α表達和轉(zhuǎn)錄活性作用機制Fig. 2 Mechanisms of HBx in up-regulating the expression and transcriptional activation of HIF-1α

3 討 論

肝癌是全世界第三大惡性腫瘤，在每年新增的約50萬肝癌病例中，其中有一半發(fā)生在我國［1］。早期的小肝癌手術(shù)切除預(yù)后較好，5年生存率可達75%，但大部分患者臨床確診時即為中晚期，從而失去手術(shù)機會或術(shù)后轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)率較高［8］。因此，深入探索肝癌發(fā)生、發(fā)展機制，對肝癌的防治有著重要意義。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，HIF-1α在肝癌組織中高表達，且與肝癌包膜不完整、門脈侵犯、術(shù)后轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)和總生存時間降低關(guān)系密切［9］。同時，HIF-1α在肝癌組織中的表達與HBx呈正相關(guān)［10］。在前期研究的基礎(chǔ)上，本研究進一步在細胞水平闡明HBx上調(diào)HIF-1α蛋白的表達和轉(zhuǎn)錄激活作用。HIF-1α在細胞核內(nèi)與HIF-1β結(jié)合形成二聚體，成為有活性的HIF-1復(fù)合物，與受其調(diào)節(jié)的下游靶基因的缺氧反應(yīng)元件結(jié)合，形成轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物啟動下游靶基因VEGF和MDR1等的轉(zhuǎn)錄［11］。VEGF是腫瘤新生血管形成最關(guān)鍵的生子因子，與肝癌侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［12-13］。MDR1是一種最典型的多藥耐藥基因，其編碼的P-糖蛋白是一種ATP依賴性膜轉(zhuǎn)運體，作用類似于排出泵，可通過將化療藥物從癌細胞中外排而使細胞內(nèi)藥物濃度降低，從而降低藥效，是導(dǎo)致肝癌化療耐藥的重要因子［14-15］。因此，HBx可以通過增強HIF-1α的表達和轉(zhuǎn)錄活性，促進肝癌的發(fā)生、發(fā)展，并導(dǎo)致預(yù)后不良。

研究表明，HIF-1α蛋白表達的調(diào)控最重要的是在轉(zhuǎn)錄后水平［16］。本研究也發(fā)現(xiàn)，HBx對HIF-1α mRNA表達水平?jīng)]有明顯影響。在常氧條件下，HIF-1α蛋白脯氨酸殘端發(fā)生羥基化，從而被pVHL識別并結(jié)合，啟動E3泛素化水解酶介導(dǎo)的蛋白降解途徑［17-18］。作為一個抑癌基因，pVHL通常因為基因突變而失活，從而導(dǎo)致一系列腫瘤的發(fā)生，如腎癌、血管母細胞瘤和嗜鉻細胞瘤［19］。我們研究發(fā)現(xiàn)，HBx可以直接結(jié)合pVHL，進而可能抑制pVHL與HIF-1α的結(jié)合，導(dǎo)致E3泛素化水解酶介導(dǎo)的HIF-1α蛋白降解受阻，從而上調(diào)HIF-1α的表達。因此，本研究結(jié)果可能揭示了一個新的HBx致癌機制，即通過直接結(jié)合pVHL導(dǎo)致其失去活性，從而阻斷HIF-1α蛋白的降解過程而使其表達升高。HBx蛋白為一種非結(jié)構(gòu)蛋白，可以通過折疊變形獲得二級結(jié)構(gòu)，從而與目的蛋白結(jié)合［20］。需要特別指出的是，本研究用的HBx質(zhì)粒序列為野生型，近年來在肝癌組織中檢測到的HBx序列通常含有各種突變，是否HBx突變體具有同樣或者更強的結(jié)合pVHL的活性，值得進一步研究［21］。

綜上所述，本研究在肝癌細胞水平上研究發(fā)現(xiàn)HBx可以通過直接結(jié)合pVHL，抑制HIF-1α蛋白的降解，從而增強HIF-1α的表達和轉(zhuǎn)錄活性，促進肝癌的發(fā)生、發(fā)展，并導(dǎo)致預(yù)后不良。因此，本研究揭示一個新的HBx致癌機制，豐富和完善HBx的功能，進一步推動肝癌發(fā)生、發(fā)展的可能機制的研究。

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The role of hepatitis B virus X protein in regulation of hypoxia inducible factor-1α and the underlying mechanisms in hepatocellular carcinoma

LIU Liping1, YANG Shengli2, HE Wan3, SUN Fenglin1, BAO Shiyun1(1.Department of Hepatobiliary and Pancreatic Surgery, Shenzhen People’s Hospital, the Second Clinical Medical College of Jinan University, Shenzhen Guangdong 518020, China; 2.Department of General Surgery, Liyuan Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan Hubei 430077, China; 3.Department of Medical Oncology, Shenzhen People’s Hospital, the Second Clinical Medical College of Jinan University, Shenzhen Guangdong 518020, China)

BAO Shiyun E-mail: baomi94@163.com

Background and purpose:Hepatitis B virus X protein (HBx) and hypoxia inducible factor-1α (HIF-1α) play key roles in hepatocarcinogenesis and the development of hepatocellular carcinoma. Positive correlation on the expression of these 2 proteins in hepatocellular carcinoma tissues has been found, whereas the underlying mechanisms have not been fully elucidated. This study focused on the role of HBx in regulating HIF-1α and the underlying mechanisms in hepatocellular carcinoma cells.Methods:The expression plasmids were transfected into Huh7 cells with LipofectemineTM2000. Western blot analysis was applied to detect the expressions of HIF-1α and HIF-1β protein. The transcriptional activity of HIF-1α was detected by the commercial analysis kits. The mRNA levels of HIF-1α and its target genes, including vascular endothelial growth factor (VEGF) and multi-drug resistance gene1 (MDR1), were detected by quantitative real-time PCR (qRT-PCR). Immunoprecipitation analysis was applied to detect the interaction of HIF-1α, HBx and protein von Hippel-Lindau (pVHL).Results:Huh7 cells transfected with HBx plasmid led to sharp increase of HIF-1α protein and transcriptional activity, as well as the mRNA of VEGF and MDR1 (P<0.05). However, the mRNA level of HIF-1α was not obviously changed after HBx transfection (P>0.05). Meanwhile, HBx also significantly impaired the function of pVHL in mediating the degradation of HIF-1α by ubiquitin hydrolase. This finding was further confirmed by the immunoprecipitation analysis, which showed that HBx could directly bind to pVHL, but not to HIF-1α.Conclusion:HBx may inhibit the inter-activation between pVHL and HIF-1α through directly binding to pVHL, and thus enhance the stability and transcriptional activity of HIF-1α.

Hepatocellular carcinoma; Hypoxia inducible factor-lα; Hepatitis B virus X protein; Protein von Hippel-Lindau

10.3969/j.issn.1007-3969.2015.05.003

R735.7

A

1007-3639(2015)05-0333-06

2014-12-19

2015-02-16）

國家自然科學(xué)青年基金(81402041)。

鮑世韻 E-mail:baomi94@163.com