楊立新，張麗娜，張?zhí)毂?/p>

1.沈陽醫(yī)學(xué)院附屬中心醫(yī)院內(nèi)分泌科，遼寧 沈陽 110024；

2.沈陽醫(yī)學(xué)院附屬中心醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，遼寧 沈陽 110024；

3.中國醫(yī)科大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，遼寧 沈陽 110001

胰腺神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤中DJ-1蛋白高表達(dá)的臨床意義

楊立新1，張麗娜2，張?zhí)毂?

1.沈陽醫(yī)學(xué)院附屬中心醫(yī)院內(nèi)分泌科，遼寧 沈陽 110024；

2.沈陽醫(yī)學(xué)院附屬中心醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，遼寧 沈陽 110024；

3.中國醫(yī)科大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，遼寧 沈陽 110001

背景與目的：胰腺神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤(pancreatic neuroendocrine neoplasms，PNENs)癥狀復(fù)雜多樣，易發(fā)生誤診和漏診。本研究旨在探討PNENs中DJ-1蛋白表達(dá)水平及其在病程進(jìn)展及預(yù)后中的臨床意義。方法：采用ELISA法檢測16例PNENs及25例健康人血清中DJ-1蛋白的水平，采用免疫組織化學(xué)法檢測了78例PNENs病理組織中DJ-1蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果：PNENs患者血清中DJ-1蛋白水平顯著高于健康人(36.19±6.71 vs 24.68±5.94 ng/mL；P＜0.001)；53.8%的PNENs組織中DJ-1蛋白呈陽性表達(dá)(42/78)；PNENs組織中DJ-1表達(dá)水平與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.033)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移(P=0.017)、TNM分期(P=0.012)、以及病理分級(P=0.049)呈顯著正相關(guān)；作為非獨立風(fēng)險因素，DJ-1陽性表達(dá)與PNENs患者OS(P=0.003)及DFS(P=0.018)縮短均顯著相關(guān)。結(jié)論：PNENs存在DJ-1蛋白高表達(dá)，且與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移、病程進(jìn)展及不良預(yù)后相關(guān)。

胰腺神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤；DJ-1；免疫組織化學(xué)；生存分析

胰腺神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤(pancreatic neuroendocrine neoplasms，PNENs)起源于胰腺小管的多能干細(xì)胞，約占所有胰腺腫瘤的1%～2%［1］。PNENs的癥狀復(fù)雜多樣，臨床醫(yī)師對其認(rèn)識普遍不足，常發(fā)生誤診和漏診，導(dǎo)致病程遷延，由良性發(fā)展成惡性，給患者帶來嚴(yán)重的健康損害。目前臨床上對PNENs的診斷主要借助于影像學(xué)及血清神經(jīng)內(nèi)分泌標(biāo)志物檢測等手段，但不易判斷其嚴(yán)重程度及提示預(yù)后［2］。因此，篩選能提示PNENs嚴(yán)重程度及預(yù)后的的新型分子標(biāo)志物成為該研究領(lǐng)域的熱點。

DJ-1基因(也稱為Parkinson 7，PARK7)，在人體多種組織均有表達(dá)，參與抑制細(xì)胞凋亡、抗氧化及細(xì)胞轉(zhuǎn)化等多種功能［3-4］，是近年新發(fā)現(xiàn)的癌基因［5］。近年研究發(fā)現(xiàn)，在諸如肺癌、宮頸癌、食管癌及白血病等多種惡性腫瘤組織中均存在DJ-1蛋白高表達(dá)，且與化療耐藥、患者生存期縮短等相關(guān)［6-9］；同時，在惡性腫瘤患者血清或其它體液中，DJ-1蛋白水平較健康人亦顯著增高，且隨著腫瘤的進(jìn)展而增高［10-13］。在關(guān)于PNENs的研究中，國內(nèi)外鮮見有關(guān)DJ-1基因及蛋白表達(dá)的報道。

本研究應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)檢測16例PNENs及25例健康人血清中DJ-1蛋白的水平；采用免疫組織化學(xué)法檢測了78例PNENs組織中DJ-1蛋白的表達(dá)情況，并分析PNENs組織中DJ-1表達(dá)水平與患者臨床病理參數(shù)及隨訪預(yù)后資料的相關(guān)性，以探討DJ-1表達(dá)水平在PNENs病程進(jìn)展及預(yù)后中的臨床意義，判斷DJ-1可否作為PNENs的新型分子標(biāo)志物。

1 材料和方法

1.1 主要試劑

DJ-1/PARK7 ELISA檢測試劑盒購自美國MyBioSource公司(MBS027308)；兔抗人DJ-1多克隆抗體購自圣克魯斯生物技術(shù)(上海)有限公司(sc-32874)；UltraSensitive TM SP超敏濃縮試劑盒購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司(KIT-9720)；DAB顯色試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司(LI-9032/9033)。

1.2 血清樣本及病理組織樣本

本研究所用血清樣本來自沈陽醫(yī)學(xué)院附屬中心醫(yī)院2011—2013年收治的16例PNENs患者群體，收集患者入院治療前空腹采集的外周靜脈血樣，并分離得到血清樣本；另外收集了在本院體檢中心進(jìn)行健康體檢的25例健康人空腹靜脈血樣，并分離得到血清樣本。上述血清標(biāo)本加入0.02%疊氮鈉后，于-80 ℃冰凍保存，以備檢測。組織樣本均來自沈陽醫(yī)學(xué)院附屬中心醫(yī)院2004年—2009年78例PNENs患者手術(shù)切除的病理組織，手術(shù)前患者均未接受放療或化療。

1.3 ELISA檢測

應(yīng)用DJ-1 ELISA檢測試劑盒檢測16例PNENs患者及25例健康人血清樣品中DJ-1蛋白水平，具體操作步驟參照說明書進(jìn)行。

1.4 免疫組織化學(xué)染色及結(jié)果判讀

保存于-80℃的手術(shù)切除組織經(jīng)室溫解凍后，用4%多聚甲醛固定2 d，常規(guī)制作石蠟包埋組織塊，切4 μm厚石蠟切片，固定于經(jīng)多聚賴氨酸處理的防脫載玻片上。將組織切片依次進(jìn)行二甲苯脫蠟，乙醇脫苯、水化處理，于檸檬酸鹽緩沖液(pH為6.0)中在80 kpa壓力下修復(fù)5 min。經(jīng)H2O2、正常山羊血清處理后，切片滴加DJ-1一抗(1︰200稀釋)并于4 ℃溫育過夜。次日切片經(jīng)生物素標(biāo)記二抗以及鏈真菌抗生物素蛋白-辣根過氧化酶(SP)復(fù)合物溫育后，滴加新鮮配制的DAB 溶液顯色，并進(jìn)行蘇木素復(fù)染。以PBS液代替DJ-1抗體作為陰性對照。

DJ-1蛋白陽性表達(dá)部位為細(xì)胞質(zhì)。染色結(jié)果綜合染色強(qiáng)度和著色腫瘤細(xì)胞百分率進(jìn)行判定。染色強(qiáng)度評分為：無染色0分，弱染色1分，中等強(qiáng)度染色2分，強(qiáng)染色3分；著色腫瘤細(xì)胞百分率評分為：≤5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，＜75%為4分；染色強(qiáng)度和著色腫瘤細(xì)胞百分率的乘積為總積分，范圍0～12，總積分≤3定義為陰性表達(dá)，總積分＞3定義為陽性表達(dá)。閱片工作由兩位有經(jīng)驗的臨床病理醫(yī)師進(jìn)行盲法判讀。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 16.0軟件包對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。采用獨立樣本t檢驗分析PNENs患者和健康人血清樣本中DJ-1蛋白水平的組間差異；采用Pearson χ2檢驗或Fisher確切概率法分析DJ-1蛋白表達(dá)水平與PNENs患者臨床病理參數(shù)相關(guān)性。自疾病確診至發(fā)生局部復(fù)發(fā)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移之間的時間定義為無病生存期(disease-free survival，DFS)，自疾病確診至患者因該病死亡或已知的最后1次隨訪之間的時間定義為總體生存期(overall survival，OS)；本研究采用log-rank檢驗繪制Kaplan-Meier曲線，并采用Cox回歸來進(jìn)行單變量和多變量分析，進(jìn)行生存分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 患者臨床資料

本研究中PNENs患者的臨床資料如表1所示，78例PNENs患者中，男性45例，女性33例；患者平均年齡為57.9歲(21歲～79歲)；其中27例(34.6%)患者淋巴結(jié)發(fā)生轉(zhuǎn)移。本研究中共收集到68例PNENs患者的生存資料，隨訪率為87.2%，隨訪時間為44～113個月，隨訪中位時間為98個月；隨訪患者中因PNENs死亡16例，PNENs復(fù)發(fā)28例，患者OS的平均值為105.4個月，DFS的平均值為97.6個月，患者5年生存率為98.5%。本樣本中部分患者臨床資料收集不完全。

2.2 PNENs患者血清中DJ-1蛋白的水平

應(yīng)用ELISA法檢測了25例正常健康人及16例PNENs患者血清樣品中DJ-1蛋白水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，正常健康人血清中DJ-1蛋白平均水平24.68±5.94 ng/mL，PNENs患者血清中DJ-1蛋白平均水平為36.19±6.71 ng/mL。采用獨立樣本t檢驗進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，與正常健康人相比，PNENs患者血清中DJ-1蛋白水平顯著增高(P＜0.001)。

2.3 DJ-1蛋白在PNENs組織中的表達(dá)

應(yīng)用免疫組化法檢測DJ-1蛋白的表達(dá)情況，78例PNENs組織中，有42例DJ-1蛋白呈陽性表達(dá)，陽性率為53.8%(42/78)，DJ-1蛋白在PNENs組織中陰性表達(dá)和陽性表達(dá)的情況見圖1。

2.4 DJ-1與PNENs臨床病理參數(shù)的相關(guān)性

應(yīng)用Pearson χ2檢驗或Fisher確切概率法分析DJ-1蛋白表達(dá)與PNENs患者的臨床病理參數(shù)的相關(guān)性(表2)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的組織相比，在發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的PNENs組織中，DJ-1表達(dá)水平顯著增高(P=0.033)；同樣與無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的組織相比，在發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的PNENs組織中DJ-1表達(dá)水平亦顯著增高(P=0.017)；與TNM分期為Ⅰ～Ⅱ期的組織相比，Ⅲ～Ⅳ期的PNENs組織中DJ-1表達(dá)水平顯著增高(P=0.012)；此外，隨著PNENs組織病理分級增加，DJ-1表達(dá)水平顯著增高(P=0.049)。DJ-1表達(dá)水平與患者性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤大小、有無瘤栓、以及分化程度等病理參數(shù)之間無顯著相關(guān)性(P＞0.05)。

表1 78例PNENs患者的臨床病理特征Tab. 1 Clinicopathological characters of 78 PNENs cases

圖1 DJ-1蛋白在PNENs病理組織中的陰性表達(dá)和陽性表達(dá)Fig. 1 Expression of DJ-1 in PNENs pathological tissues

表2 DJ-1蛋白表達(dá)與PNENs病理參數(shù)的相關(guān)性Tab. 2 Correlation of DJ-1 expression and clinicopathological features of PNENs patients

2.5 DJ-1對PNENs患者生存期的影響

應(yīng)用log-rank檢驗分析DJ-1蛋白表達(dá)水平與PNENs患者的OS及DFS的關(guān)系，本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，DJ-1陽性表達(dá)可顯著縮短患者的OS(P=0.003，圖2A)及DFS(P=0.018，圖2B)。

單變量COX回歸法分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期、分化程度、病理分級及DJ-1表達(dá)水平均與患者的OS及DFS顯著相關(guān)，此外，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和瘤栓與DFS亦顯著相關(guān)(表3)。鑒于單變量COX回歸分析的結(jié)果，本研究引入腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、瘤栓、TNM分期、分化程度、病理分級、及DJ-1表達(dá)水平等病理參數(shù)，進(jìn)一步進(jìn)行多變量COX回歸分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(OS，P=0.041；DFS，P=0.013)和病理分級(OS，P=0.015；DFS，P=0.019)為影響OS及DFS的獨立風(fēng)險因素，此外，影響DFS的獨立風(fēng)險因素還有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移(P=0.020)和分化程度(P＜0.001，(表4)。

表3 單變量Cox回歸法分析PNENs臨床病理參數(shù)與患者OS及DFS的相關(guān)性Tab. 3 Univariate Cox regression analysis of clinicopathological data correlated with OS and DFS in PNENs

表4 多變量Cox回歸法分析PNENs臨床病理參數(shù)與患者OS及DFS的相關(guān)性Tab. 4 Multivariate Cox regression analysis of clinicopathological data correlated with OS and DFS in PNENs

圖2 DJ-1蛋白表達(dá)對PNENs患者OS和DFS的影響Fig. 2 The influence of DJ-1 expression on the OS and DFS of PNENs patients.

3 討 論

DJ-1在多種惡性腫瘤中存在過表達(dá)，且與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移、病程進(jìn)展以及不良預(yù)后等相關(guān)。在胰腺腫瘤領(lǐng)域，He等［14］發(fā)現(xiàn)在胰腺癌中存在DJ-1高表達(dá)，并且與腫瘤分期、侵襲、轉(zhuǎn)移和預(yù)后有關(guān)；在神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤領(lǐng)域，Miyajima等［15］研究發(fā)現(xiàn)星形細(xì)胞瘤中DJ-1蛋白表達(dá)隨腫瘤WHO分級增加顯著增高；Zhang等［16］和Krause等［17］的研究均發(fā)現(xiàn)在甲狀腺組織惡性病變的過程中存在DJ-1表達(dá)水平的增加。但是對PNENs中DJ-1的表達(dá)尚未見報道。本研究應(yīng)用ELISA法檢測了16例PNENs患者及25例正常健康人血清中DJ-1蛋白的水平，發(fā)現(xiàn)與其它腫瘤相似，PNENs患者血清中DJ-1蛋白水平著增高于健康人，這提示DJ-1在PNENs的發(fā)生、發(fā)展過程中可能起到一定的作用。

本研究進(jìn)一步采用免疫組化法檢測了78例PNENs組織中DJ-1蛋白的表達(dá)情況，并與患者的臨床病理參數(shù)進(jìn)行相關(guān)性分析。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)PNENs出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或者遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移時，DJ-1表達(dá)水平則隨之增高，并且晚期PNENs較早期PNENs表達(dá)更多的DJ-1。說明DJ-1可能參與PNENs的侵襲轉(zhuǎn)移、病程進(jìn)展過程。

在卵巢癌［13］、喉癌［18］、食管癌［8］、肝癌［19］等諸多惡性腫瘤中，均發(fā)現(xiàn)DJ-1蛋白高表達(dá)與不良預(yù)后相關(guān)。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，DJ-1陽性表達(dá)與PNENs患者OS及DFS縮短顯著相關(guān)，說明PNENs高表達(dá)DJ-1蛋白可提示患者不良預(yù)后。

近年來，PNENs的診斷與治療取得了較快的進(jìn)展，但是鑒于該類疾病的病情復(fù)雜、癥狀不明顯、可惡性轉(zhuǎn)化等特征，在其早期診斷方法，尤其是快速簡捷的新型分子標(biāo)志物檢測上還有很多的難點尚未攻克。DJ-1蛋白在多種腫瘤中均發(fā)現(xiàn)有作為分子標(biāo)志物的潛質(zhì)，可提示腫瘤進(jìn)展、藥物敏感性及預(yù)后等。本研究的結(jié)果也支持DJ-1有作為PNENs的診斷分子標(biāo)志的潛質(zhì)。后續(xù)研究將擴(kuò)大患者樣本量，設(shè)置對照組，進(jìn)一步確定DJ-1能否作為PNENs的一種診斷分子標(biāo)志物。

綜合本研究的結(jié)果，PNENs存在DJ-1蛋白高表達(dá)，且與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移、病程進(jìn)展及不良預(yù)后相關(guān)。

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The clinical significance of DJ-1 over expression in pancreatic neuroendocrine neoplasms

YANG Lixin1, ZHANG Lina2, ZHANG Tianbiao3(1. Department of Endocrinology, Central Hospital Affliated to Shenyang Medical College, Shenyang Liaoning 110024, China; 2. Department of ICU, Central Hospital Affliated to Shenyang Medical College, Shenyang Liaoning 110024, China; 3. Department of Biochemistry and Molecular Biology, China Medical University, Shenyang Liaoning 110001, China)

YANG Lixin E-mail: sy_yanglx@126.com

Background and purpose:The symptoms of pancreatic neuroendocrine neoplasms (PNENs) are complicated, that might lead to misdiagnosis. This study aimed to detect the expression level of DJ-1 in PNENs and explore the clinical significance of DJ-1 in PNENs.Methods:DJ-1 protien levels in the serum of 16 cases of PNENs patients and 25 cases of healthy persons were detected by ELISA analysis; The expressions of DJ-1 in 78 cases of PNENs tissues were detected by immunohistochemical staining.Results:The DJ-1 level in the serum of PNENs patients was signifcantly higher than healthy persons (36.19±6.71 vs 24.68±5.94 ng/mL; P＜0.001); 53.8% (42/78) cases of PNENs tissues showed DJ-1 positive staining; DJ-1 expression level in PNENs tissues had signifcantly positive correlation with lymph node metastasis (P=0.033), distant metastasis (P=0.017), TNM stage (P=0.012), and pathology grade (P=0.049); As a dependent risk factor, DJ-1 expression was signifcantly associated with shorter OS (P=0.003) and DFS (P=0.018) of PNENs patients.Conclusion:High expression of DJ-1 protein correlated with invasion and metastasis, disease progression, and poor prognosis in PNEN.

Pancreatic neuroendocrine neoplasms; DJ-1; Immunohistochemistry; Survival analysis

10.3969/j.issn.1007-3969.2015.02.006

R735.9

A

1007-3639(2015)02-0112-07

2014-09-12

2014-12-15）

遼寧省自然科學(xué)基金項目（201202279）。

楊立新 E-mail:sy_yanglx@126.com