華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬武漢市第一醫(yī)院臨床免疫學(xué)實驗室，湖北 武漢 430022

高遷移率族蛋白B1激活NF-κB/αvβ3而增加A549細(xì)胞遷移與侵襲能力

朱建華，胡娜，趙嵐，黃炎

華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬武漢市第一醫(yī)院臨床免疫學(xué)實驗室，湖北 武漢 430022

背景與目的：高遷移率族蛋白B1(high mobility group box 1，HMGB1)在多種腫瘤中高表達(dá)，在腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。本研究旨在探討HMGB1促進(jìn)肺癌A549細(xì)胞侵襲的分子機(jī)制。方法：肺癌A549細(xì)胞經(jīng)HMGB1，NF-κB抑制劑6-amino-4-quinazoline (QNZ) 或Bortezomib (Bort)處理后，劃痕實驗和Transwell小室體外侵襲實驗檢測腫瘤細(xì)胞的遷移及侵襲能力；NF-κB熒光素酶報告基因?qū)嶒灆z測NF-κB活性；Real-time RT-PCR和Western blot檢測A549細(xì)胞NF-κB和整合素αvβ3表達(dá)。結(jié)果：HMGB1能增強(qiáng)A549細(xì)胞遷移和侵襲能力，增加NF-κBp65蛋白的表達(dá)，同時增強(qiáng)A549細(xì)胞NF-κB活性，Real-time RT-PCR和Western blot檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)HMGB1上調(diào)腫瘤細(xì)胞αvβ3表達(dá)。NF-κB抑制劑QNZ或Bort消除HMGB1促進(jìn)A549細(xì)胞遷移及侵襲，增強(qiáng)NF-κB表達(dá)和活性以及αvβ3表達(dá)的效應(yīng)。結(jié)論：HMGB1通過激活A(yù)549細(xì)胞NF-κB上調(diào)αvβ3表達(dá)促進(jìn)A549細(xì)胞遷移與侵襲行為。

高遷移率族蛋白B1；A549；腫瘤轉(zhuǎn)移；NF-κB；αvβ3

肺癌是近年來發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤之一，腫瘤轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致死亡的主要原因，腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移與多種蛋白的表達(dá)有關(guān)。高遷移率族蛋白B1(high mobility group box 1，HMGB1)是細(xì)胞內(nèi)一種含量豐富的非組蛋白染色體結(jié)合蛋白，HMGB1在結(jié)直腸腺癌、肝癌、乳腺癌、肺癌、宮頸癌及白血病等多種腫瘤中表達(dá)升高［1］。人結(jié)腸癌細(xì)胞釋放的HMGB1可抑制樹突狀細(xì)胞活性而抑制抗腫瘤免疫，促進(jìn)結(jié)腸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移［2］。研究表明，HMGB1介導(dǎo)金屬基質(zhì)蛋白酶9表達(dá)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲［3］。盡管越來越多的研究發(fā)現(xiàn)HMGB1與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，但其機(jī)制仍然不明。本研究主要探討HMGB1促進(jìn)肺癌細(xì)胞遷移與侵襲的分子機(jī)制，證明HMGB1激活A(yù)549細(xì)胞NF-κB，上調(diào)與侵襲相關(guān)蛋白的表達(dá)而促進(jìn)肺癌侵襲，為臨床治療肺癌提供實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞與試劑

人非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞株購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心(武漢)。細(xì)胞培養(yǎng)所用試劑DMEM粉劑購自美國Gibco公司；特級胎牛血清購自杭州四季青公司；HMGB1購自美國Sigma-Aldrich公司；NF-κB抑制劑6氨基喹唑啉(6-amino-4-quinazoline，QNZ)購自德國Merck Biosciences公司；NF-κB抑制劑硼替佐咪(Bortezomib，Bort)購自美國Millennium Pharmaceuticals公司；Transwell小室購自美國BD公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國Fermentas公司；羊抗人αv和β3一抗、兔抗人NF-κBp65抗體、驢抗羊二抗及羊抗兔二抗均購自美國Santa Cruz公司；NF-κB熒光素酶報告基因系統(tǒng)購自美國Invitrogen公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及細(xì)胞分組

將A549細(xì)胞接種在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，加入100 U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素，置于37 ℃，CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。A549細(xì)胞經(jīng)HMGB1(200 ng/mL)、NF-κB抑制劑QNZ(40 nmol/L)或Bort(20 nmol/L)處理24 h，根據(jù)加入的試劑，分為以下6組：①正常對照組；②HMGB1組；③QNZ組；④HMGB1+QNZ組；⑤Bort組；⑥HMGB1+ Bort組。

1.2.2 劃痕實驗

將對數(shù)生長期A549細(xì)胞接種于6孔板，細(xì)胞融合度達(dá)到70%以上時用Tip頭在培養(yǎng)板劃均勻直線。PBS洗去漂浮細(xì)胞，于37 ℃，CO2體積分?jǐn)?shù)為5%條件下溫育48 h，在顯微鏡下觀察拍照，測量細(xì)胞遷移距離，并計算各組細(xì)胞的劃痕修復(fù)率。劃痕修復(fù)率(%)=［0 h劃痕寬度-48 h劃痕寬度)/0 h劃痕寬度］×100%。

1.2.3 腫瘤細(xì)胞侵襲遷移實驗

預(yù)處理后的A549細(xì)胞，于37 ℃，CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h。Transwell小室用Matrigel包被(10 μg/μL)的8 μm孔徑膜將其分隔為上、小室。下室加完全培養(yǎng)基600 μL，將各組細(xì)胞用PBS洗滌后用無血清培養(yǎng)基懸浮，調(diào)整濃度至1×106/mL，加100 μL至上室，于37 ℃，CO2體積分?jǐn)?shù)為5%條件下溫育8 h，取出小室，用PBS潤濕，用棉簽擦去微孔膜上層的細(xì)胞，PBS洗滌，將Transwell小室用4%甲醛溶液固定15 min，結(jié)晶紫染色，顯微鏡下觀察，隨機(jī)選取5個高倍視野(×200)進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)，并計算平均值，實驗重復(fù)3次。

1.2.4 NF-κB熒光素酶報告實驗

預(yù)處理后的A549細(xì)胞，將1×104個對數(shù)生長期細(xì)胞接種至24孔板，融合度達(dá)70%～80%時，依照LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑的操作指南，轉(zhuǎn)染質(zhì)粒(pNFkB-TA-Luc 0.4 μg，pCMVβgal 0.1 μg)，細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)24 h。徹底吸棄培養(yǎng)基，PBS洗滌2次，每孔加入100 μL 1×Reporter Lysis緩沖液，冰上溫育15 min，4 ℃，10 000×g離心5 min，取細(xì)胞裂解上清液50 μL加入96孔板，分別加入50 μL Steady Glo reagent，冰上溫育5 min。在激發(fā)波長430 nm，發(fā)射波長550 nm設(shè)置下，用HTS7000BioAssay Reader檢測熒光素酶活性。取細(xì)胞裂解上清液50 μL加入96孔板，加入50 μL的β-gal Assay 2×緩沖液并混勻，37 ℃溫箱中溫育，當(dāng)溶液變?yōu)闇\黃色時，加入150 μL 1 mol/L碳酸鈉中止反應(yīng)。在吸收波長為405 nm處，使用HTS7000 Bio Assay Reader檢測β-gal值以標(biāo)化轉(zhuǎn)染效率。計算熒光素酶強(qiáng)度值/ β-gal值，得到相對熒光素酶活性，即相對發(fā)光值(relative light unit，RLU)。

1.2.5 Real-time RT-PCR檢測αvβ3的 mRNA表達(dá)

預(yù)處理的A549細(xì)胞在6孔板中培養(yǎng)12 h后，提取各組細(xì)胞總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，用SYBR Green Ⅰ法，在Mx3000P實時定量熒光PCR儀進(jìn)行熒光定量PCR檢測αvβ3的mRNA表達(dá)水平，每個樣本做3個復(fù)孔，設(shè)定閾值，測定平均Ct值。

1.2.6 Western blot檢測αvβ3和NF-κB蛋白質(zhì)水平

預(yù)處理后的A549細(xì)胞，按照每1.0×106個細(xì)胞加入100 μL RIPA蛋白裂解液，混勻后置冰上20 min，4 ℃，14 000×g離心30 min，將上清液轉(zhuǎn)入潔凈EP管，采用BCA蛋白定量分析檢測蛋白含量。取20 μg蛋白采用伯樂公司的8%～12%梯度聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，電轉(zhuǎn)移到0.45 μm PVDF膜。將轉(zhuǎn)有蛋白的PVDF膜置于5%脫脂奶粉-TBST室溫中振蕩封閉1 h，然后置于適當(dāng)稀釋的一抗中4 ℃溫育過夜；第2天室溫用1×TBST洗滌PVDF膜，將膜置于適當(dāng)稀釋的含辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗的1×TBST中，室溫溫育1 h；用1×TBST洗滌后，進(jìn)行化學(xué)發(fā)光操作，伯樂公司ChemicDoc XRS系統(tǒng)曝光，并用Quantity One imaging軟件對曝光后條帶進(jìn)行分析。所用抗體為：羊抗人αvβ3抗體，兔抗人NF-κBp65抗體，β-actin (Santa Cruz Biotechnology；1∶1 000)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 HMGB1及NF-κB抑制劑對A549遷移能力的影響

劃痕實驗結(jié)果(圖1)，與對照組，HMGB1+QNZ組和HMGB1+Bort組劃痕修復(fù)率比較，HMGB1組細(xì)胞劃痕修復(fù)率顯著增加，劃痕區(qū)明顯縮窄，差異有統(tǒng)計學(xué)意義[(43.42±0.53)%、(42.79±0.37)%、(43.12±0.44)%vs(76.53±0.71)%，P＜0.05]；單獨NF-κB抑制劑QNZ組和Bort組劃痕修復(fù)率分別為(41.89±0.25)%和(41.21±0.75)%，與對照組比較，劃痕區(qū)無明顯縮窄，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。以上結(jié)果表明HMGB1能促進(jìn)A549細(xì)胞遷移，NF-κB抑制劑逆轉(zhuǎn)HMGB1促A549細(xì)胞遷移效應(yīng)。

圖1 HMGB1促進(jìn)A549細(xì)胞遷移，NF-κB抑制劑逆轉(zhuǎn)HMGB1促A549細(xì)胞遷移效應(yīng)Fig. 1 HMGB1 promoted A549 cells migration and NF-κB inhibitors reverse this effect

2.2 HMGB1及NF-κB抑制劑對A549細(xì)胞體外侵襲能力的影響

體外侵襲實驗結(jié)果(圖2)顯示，HMGB1組A549細(xì)胞穿過Matrigel人工基底膜的細(xì)胞數(shù)為(177±12)，與對照組(91±7)、HMGB1+QNZ組(45±3)和HMGB1+Bort組(53±7)比較，明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；NF-κB抑制劑QNZ組和Bort組細(xì)胞穿膜數(shù)分別為(39±6)和(42±5)，與對照組比較，細(xì)胞穿膜數(shù)明顯減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。此結(jié)果表明，HMGB1能增強(qiáng)A549細(xì)胞侵襲能力，抑制NF-κB活性則抑制A549細(xì)胞侵襲且消除HMGB1促進(jìn)A549細(xì)胞侵襲效應(yīng)。

圖2 HMGB1增強(qiáng)A549細(xì)胞侵襲，NF-κB抑制A549細(xì)胞侵襲且消除HMGB1促進(jìn)A549細(xì)胞侵襲效應(yīng)Fig. 2 HMGB1 promoted A549 cells invasion and NF-κB inhibitors reverse this effect

2.3 HMGB1及NF-κB抑制劑對A549細(xì)胞NF-κB表達(dá)及活性的影響

Western blot檢測結(jié)果顯示，與對照組比較，HMGB1組A549細(xì)胞NF-κB蛋白表達(dá)顯著增加(圖3A)。NF-κB熒光素酶報告基因試驗結(jié)果顯示，HMGB1組A549細(xì)胞NF-κB的活性與對照組比較增強(qiáng)3.12倍，與HMGB1+QNZ組和HMGB1+Bort組比較，NF-κB的活性分別增強(qiáng)了6.21倍和5.73倍，NF-κB抑制劑消除了HMGB1的激活效應(yīng)而且強(qiáng)烈抑制A549細(xì)胞基礎(chǔ)NF-κB活性(圖3B)。這一結(jié)果說明HMGB1上調(diào)A549細(xì)胞NF-κB的表達(dá)，進(jìn)一步提示增強(qiáng)NF-κB的表達(dá)和活性是HMGB1發(fā)揮效應(yīng)的前提條件。

2.4 HMGB1及NF-κB抑制劑對A549細(xì)胞整合素αvβ3表達(dá)的影響

整合素αvβ3是一種重要細(xì)胞黏附分子，介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的侵襲遷移，我們進(jìn)一步研究了HMGB1是否影響A549細(xì)胞整合素αvβ3的表達(dá)。結(jié)果顯示，經(jīng)HMGB1處理后A549細(xì)胞整合素αvβ3表達(dá)升高，QNZ或Bort處理組整合素αvβ3表達(dá)較對照組降低，HMGB1+QNZ組與HMGB1+Bort組細(xì)胞與HMGB1組比較，整合素αvβ3表達(dá)下降(圖4)。這些結(jié)果表明HMGB1上調(diào)A549細(xì)胞整合素αvβ3表達(dá)，NF-κB抑制劑QNZ或Bort抑制HMGB1促進(jìn)A549細(xì)胞整合素αvβ3表達(dá)的作用。

圖3 HMGB1激活A(yù)549細(xì)胞NF-κBFig. 3 HMGB1 activated A549 cells NF-κB

圖4 HMGB1激活NF-κB上調(diào)A549細(xì)胞整合素αvβ3的表達(dá)Fig. 4 HMGB1 up-regulated integrin αvβ3 expression in A549 cells

3 討 論

腫瘤轉(zhuǎn)移是肺癌致死的重要因素，腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移是一個多步驟演進(jìn)的復(fù)雜過程，需要多基因參與，關(guān)于肺癌侵襲轉(zhuǎn)移的具體機(jī)制還不清楚，相關(guān)蛋白及其作用機(jī)制的發(fā)現(xiàn)對腫瘤轉(zhuǎn)移的預(yù)防與治療具有重要意義。本研究探討了HMGB1對肺癌A549細(xì)胞遷移侵襲的影響及其相關(guān)分子機(jī)制，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HMGB1激活肺癌A549細(xì)胞NF-κB上調(diào)整合素αvβ3表達(dá)，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲。

HMGB1是一種廣泛存在于細(xì)胞核內(nèi)的DNA結(jié)合蛋白，在多種腫瘤細(xì)胞和組織中高表達(dá)，促進(jìn)腫瘤的發(fā)展及其轉(zhuǎn)移［4-5］，HMGB1通過多種機(jī)制影響腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移，研究發(fā)現(xiàn)HMGB1與其受體結(jié)合激活PI3K/Akt信號通路促進(jìn)血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的分泌維持血管生成［6］；腫瘤微環(huán)境中組織缺氧情況下釋放的HMGB1激活TLR4/RAGE信號通路產(chǎn)生IL-1β和IL-18等炎性遞質(zhì)，誘導(dǎo)炎性反應(yīng)促進(jìn)肝癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移［5］。劃痕實驗和侵襲試驗的結(jié)果顯示，HMGB1增強(qiáng)A549細(xì)胞侵襲遷移能力，我們進(jìn)一步探討HMGB1促進(jìn)A549細(xì)胞侵襲遷移的分子機(jī)制，熒光素酶報告基因試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)HMGB1激活A(yù)549細(xì)胞NF-κB。有研究［7］發(fā)現(xiàn)NF-κB信號途徑在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中起重要作用，調(diào)控腫瘤血管生成和侵襲遷移。有研究［8］表明NF-κB通過誘導(dǎo)趨化因子受體CXCR4的表達(dá)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞遷移和轉(zhuǎn)移。

為了確定HMGB1是否通過激活NF-κB而促進(jìn)A549細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移，我們選用了2種不同的NF-κB抑制劑。QNZ是常用的NF-κB抑制劑，Bort是一種有效的選擇性抑制20S蛋白酶體抑制劑，但它主要的生物學(xué)效應(yīng)是抑制NF-κB的激活，組成性下調(diào)NF-κB依賴性基因的表達(dá)。研究結(jié)果顯示HMGB1促進(jìn)A549細(xì)胞表達(dá)NF-κB，NF-κB抑制劑基本消除了HMGB1促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移效應(yīng)，單獨用NF-κB抑制劑QNZ或Bort處理A549細(xì)胞后其侵襲轉(zhuǎn)移能力也明顯下降，說明NF-κB抑制劑可以抑制A549細(xì)胞基線侵襲能力。值得注意的是，單獨QNZ或Bort對A549細(xì)胞的遷移能力幾乎沒有影響，可能NF-κB調(diào)控影響腫瘤細(xì)胞侵襲能力蛋白的表達(dá)，而不影響腫瘤細(xì)胞遷移能力的蛋白表達(dá)。NF-κB熒光素酶報告基因?qū)嶒灪蚖estern blot結(jié)果證明HMGB1通過上調(diào)并激活A(yù)549細(xì)胞NF-κB而發(fā)揮作用。整合素是一類重要的細(xì)胞黏附分子，研究報道αvβ3整合素參與腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移［9-10］。αvβ3通過與細(xì)胞外基質(zhì)fibrinogen、fibronectin和laminin介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的黏附侵襲，本研究結(jié)果顯示在HMGB1刺激A594細(xì)胞表達(dá)αvβ3，而NF-κB抑制劑消除HMGB1的促表達(dá)作用。

綜上所述，研究結(jié)果顯示，在HMGB1促進(jìn)肺癌A549細(xì)胞侵襲遷移的基礎(chǔ)上，證明HMGB1通過激活549細(xì)胞NF-κB上調(diào)αvβ3表達(dá)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移，但是HMGB1通過哪條信號途徑激活A(yù)549細(xì)胞NF-κB而促進(jìn)αvβ3表達(dá)有待進(jìn)一步研究。

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HMGB1 activates NF-κB/αvβ3 to promote A549 cells migration and invasion

ZHU Jianhua, HU Na,ZHAO Lan, HUANG Yan (Laboratory of Clinical Immunology, Wuhan No.1 Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology (HUST), Wuhan Hubei 430022, China)

ZHU Jianhua E-mail: zhujh621@163.com

Background and purpose:High mobility group 1 (HMGB1), frequently found to be overexpressed in many human tumors, plays an important role in tumor progress and metastasis. This study aimed to investigate the mechanism of HMGB1 promoting A549 cell metastasis.Methods:A549 cells were untreated or treated with HMGB1 (200 ng/mL) in absence or presence of NF-κB inhibitors 6-amino-4-quinazoline (QNZ, 40 nmol/L) or Bortezomib (Bort, 20 nmol/L). Scratch assay and Transwell assay were performed to evaluate A549 cells migration and invasion ability. The activity of NF-κB was examined by luciferase reporter assay. NF-κBp65 and αvβ3 expressions were detected by Real-time RT-PCR or Western blot.Results:HMGB1 increased A549 cells migration and invasion ability. HMGB1 enhanced NF-κB protein level and NF-κB activity in A549 cells. Real-time RT-PCR and Western blot showed that HMGB1 up-regulated αvβ3 expression in A549 cells. NF-κB inhibitors QNZ or Bort reserved the promoting effects of HMGB1 on A549 cells migration and invasion, NF-κB expression and activity as well as αvβ3 expression.Conclusion:HMGB1 promotes A549 cell migration and invasion through activating NF-κB and up-regulating αvβ3.

High mobility group box 1; A549; Invation; NF-κB; αvβ3

10.3969/j.issn.1007-3969.2015.02.005

R73-37

A

1007-3639(2015)02-0105-07

2014-09-26

2014-12-09）

湖北省自然科學(xué)基金青年項目(2013CFB370)。

朱建華 E-mail:zhujh621@163.com