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        SU11274逆轉(zhuǎn)肝細(xì)胞生長因子誘導(dǎo)不同EGFR基因型非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株對吉非替尼耐藥

        2015-01-04 06:56:56嚴(yán)春花玄香蘭張佳安昌善
        中國癌癥雜志 2015年2期
        關(guān)鍵詞:耐藥肺癌

        嚴(yán)春花,玄香蘭,張佳,安昌善

        1.延邊大學(xué)附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科,吉林 延吉133000;

        2.延邊第二人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科,吉林 延吉133000

        SU11274逆轉(zhuǎn)肝細(xì)胞生長因子誘導(dǎo)不同EGFR基因型非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株對吉非替尼耐藥

        嚴(yán)春花1,玄香蘭2,張佳1,安昌善1

        1.延邊大學(xué)附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科,吉林 延吉133000;

        2.延邊第二人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科,吉林 延吉133000

        背景與目的:肝細(xì)胞生長因子(hepatocyte growth factor,HGF)誘導(dǎo)敏感非小細(xì)胞肺癌(nonsmall cell lung cancer,NSCLC)細(xì)胞對表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑(epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitor,EGFR-TKI)耐藥,其機(jī)制與c-Met激活有關(guān)。本研究探討c-Met抑制劑SU11274逆轉(zhuǎn)HGF誘導(dǎo)的不同EGFR基因型NSCLC細(xì)胞株對吉非替尼耐藥及逆轉(zhuǎn)耐藥機(jī)制。方法:選擇人NSCLC細(xì)胞株P(guān)C9(EGFR突變型)、H292(EGFR野生型)和A549(EGFR野生型),應(yīng)用吉非替尼和SU11274單獨(dú)或聯(lián)合作用于HGF誘導(dǎo)的細(xì)胞株。實(shí)驗(yàn)分為6組:C組(不加藥對照組)、H組(HGF處理組)、G組(吉非替尼處理組)、S組(SU11274處理組)、HG組(HGF+吉非替尼處理組)和HGS組(HGF+吉非替尼+SU11274處理組)。MTT法檢測對細(xì)胞增殖的影響,流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡的影響;應(yīng)用蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)檢測細(xì)胞中c-Met及其下游通道Stat3、Akt和Erk1/2蛋白表達(dá)水平。結(jié)果:吉非替尼對3種細(xì)胞的生長抑制作用均呈濃度依賴性,HGF處理能夠緩解吉非替尼的增殖抑制作用(P<0.05);不同濃度吉非替尼聯(lián)合SU11274作用于HGF誘導(dǎo)細(xì)胞時,3種細(xì)胞株存活率比吉非替尼單獨(dú)作用于HGF誘導(dǎo)細(xì)胞時明顯降低(P<0.05);HGS組的細(xì)胞凋亡比HG組明顯增加(P<0.05);HGS組的c-Met、Stat3、Akt和Erk1/2活化蛋白量比HG組明顯減少。結(jié)論:c-Met抑制劑SU11274可逆轉(zhuǎn)HGF誘導(dǎo)的不同EGFR基因型NSCLC細(xì)胞株對吉非替尼耐藥,其機(jī)制可能與抑制HGF活化的c-Met及其下游通道蛋白表達(dá)有關(guān)。

        肝細(xì)胞生長因子;吉非替尼;耐藥:SU11274;非小細(xì)胞肺癌

        目前,分子靶向藥物表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑(epidermal growth facter receptortyrosine kinase inhibitor,EGFR-TKI)逐漸成為治療非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)的重要手段。EGFR-TKI有效率與EGFR基因型有很大的相關(guān)性[1-2],存在原發(fā)或獲得性耐藥,開始對EGFR-TKI療效明顯的患者一段時間后逐漸出現(xiàn)獲得性耐藥[3]。HGF誘導(dǎo)NSCLC細(xì)胞對吉非替尼耐藥,且與c-Met激活有關(guān)[4-6]。有研究報道,c-Met抑制劑(E7050、PF-2341066)可逆轉(zhuǎn)HGF誘導(dǎo)的EGFR突變型NSCLC細(xì)胞株對吉非替尼耐藥[7-8]。SU11274是選擇性的c-Met抑制劑。本研究選擇EGFR不同基因型人NSCLC細(xì)胞(EGFR突變型和野生型),用SU11274作用于HGF誘導(dǎo)對吉非替尼耐藥的NSCLC細(xì)胞,檢測其對細(xì)胞增殖、凋亡以及c-Met信號通道蛋白的影響,探討SU11274是否逆轉(zhuǎn)HGF誘導(dǎo)的不同EGFR基因型NSCLC細(xì)胞對吉非替尼耐藥及逆轉(zhuǎn)耐藥機(jī)制,為臨床提供聯(lián)合用藥的理論依據(jù)。

        1 材料和方法

        1.1 實(shí)驗(yàn)材料

        選擇人NSCLC細(xì)胞株P(guān)C9(EGFR突變型,敏感株)、H292(EGFR野生型,敏感株)和A 5 4 9(E G F R野生型,原發(fā)性耐藥株),均由上海市肺科醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室提供;DMEM培養(yǎng)液及新生牛血清購自美國Hyclone公司;吉非替尼原料購自濟(jì)南匯豐達(dá)化工有限公司;HGF購自美國Humanzyme公司;SU11274購自美國Sigma公司;MTT粉購自美國Amresco公司;Annexin Ⅴ-FITC凋亡檢測試劑盒購自美國BD PharMingen公司。兔抗人p-Met(Tyr1349)、c-Met、p-Akt(Ser473)、Akt、Erk1、p-Stat3(Ser727)、Stat3和GAPDH抗體均購自美國Epitomics公司,p-Erk1/2(Tyr202/Y204)購自美國Cell Signaling Technology公司,辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔購自美國Jection公司;NC膜購自美國Whatman公司;ECL化學(xué)發(fā)光試劑購自美國Thermo公司。其它試劑均為國產(chǎn)分析純。

        1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及藥物配制

        分別將PC9、H292和A549細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于含10%新生牛血清的DMEM培養(yǎng)液中,置于CO2體積分?jǐn)?shù)為5%、37 ℃恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中溫育,每3~4 d換液傳代1次。HGF用含0.1%BSA的蒸餾水稀釋成500 μg/mL的母液。吉非替尼原料用DMSO溶解稀釋成濃度為100 mmol/L的母液,用藥時DMSO終濃度<0.1%。SU11274用DMSO溶解稀釋成濃度為100 mmol/L的母液,用藥時DMSO終濃度<0.1%。

        1.3 MTT法檢測細(xì)胞增殖

        取100 μL含細(xì)胞數(shù)為1×103個的細(xì)胞懸浮液接種于96孔板,每組設(shè)5個復(fù)孔。細(xì)胞貼壁后,每孔內(nèi)加入40 ng/mL HGF和(或)濃度為0、0.01、0.04、0.1、0.4、1、4和10 μmol/L的吉非替尼和(或)最小SU11274濃度。72 h后,每孔加入20 μL MTT(5 mg/mL),放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中溫育。4 h后,離心、棄上清液,每孔加入200 μL DMSO,搖床上混勻約30 min至結(jié)晶完全溶解,用酶標(biāo)儀測量波長530 nm時吸光度(A)值。細(xì)胞存活率(%)=(A實(shí)驗(yàn)組均值-A空白組均值)/(A對照組均值-A空白組均值)×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。用細(xì)胞存活率做出量效曲線,用作圖法分析得出1種藥物對不同細(xì)胞的IC50。

        1.4 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡

        取5×105個對數(shù)生長期細(xì)胞接種于6孔板。貼壁后棄原培養(yǎng)液,加入40 ng/mL HGF和(或)1 μmol/L吉非替尼和(或)最小SU11274濃度。48 h后,胰酶消化并收集全部細(xì)胞到5 mL試管中,離心、棄上清液,0.9%NaCl溶液洗滌1次。加入1×Binding Buffer調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106個/mL,取100 μL(1×105個細(xì)胞)到新的5 mL試管中。各管內(nèi)加入5 μL FITC和5 μL PI,室溫、避光15 min。上機(jī)前加入400 μL 1×Binding Buffer,在1 h內(nèi)進(jìn)行檢測。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

        1.5 蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)檢測蛋白表達(dá)水平

        取5×105個對數(shù)生長期的細(xì)胞接種于6 mm2細(xì)胞培養(yǎng)皿,細(xì)胞貼壁后加入40 ng/mL HGF和濃度分別為0、0.5、1、2.5、5和10 μmol/L的SU11274。24 h后,冰上裂解細(xì)胞提取總蛋白,用BCA法定量,取30~40 μg蛋白經(jīng)8%~10% SDSPAGE電泳分離后轉(zhuǎn)印至NC膜上,用5%脫脂奶粉封閉1 h,加入一抗溫育4 ℃過夜,TBST洗膜10 min、3次后二抗室溫?fù)u床溫育1 h,TBST洗膜5 min、5次后ECL化學(xué)發(fā)光試劑顯色、曝光成像。ImageJ2x軟件測定各條帶灰度值。選擇其中SU11274最小有效抑制濃度后,每種細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分6組:C組(對照組)、H組(HGF處理組)、 S組(SU11274處理組)、G組(吉非替尼處理組)、HG組(HGF+吉非替尼處理組)和HGS組(HGF+吉非替尼+SU11274處理組)。加入40 ng/mL HGF和(或)1 μmol/L吉非替尼和(或)最小SU11274濃度,檢測各組細(xì)胞內(nèi)c-Met、p-Met、Stat3、p-Stat3、Akt、p-Akt、Erk1/2和p-Erk1/2蛋白的表達(dá)水平。

        圖1 不同濃度SU11274作用后c-Met下游通道蛋白磷酸化情況Fig. 1 The phosphorylation of c-Met downstreams signaling pathway proteins after treating with different concentrations of SU11274

        1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

        采用SPSS 17.0統(tǒng)計學(xué)軟件對結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量資料用±s 表示,2組間比較采用t檢驗(yàn),P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

        2 結(jié) 果

        2.1 SU11274單獨(dú)作用對HGF誘導(dǎo)的細(xì)胞中c-Met及其下游信號蛋白表達(dá)的影響

        不同濃度SU11274作用于HGF誘導(dǎo)的細(xì)胞后,Western blot檢測結(jié)果顯示,p-Met、p-Stat3和p-Akt蛋白表達(dá)有不同程度受到抑制。SU11274濃度為1 μmol/L時HGF刺激3種細(xì)胞被激活的c-Met、p-Stat3和p-Akt蛋白表達(dá)均開始受到抑制(圖1)。而1 μmol/L SU11274對PC9、H292和A549細(xì)胞生長幾乎沒有抑制作用,其細(xì)胞存活率分別為(96.8±3.2)%、(95.9±2.5)%和(102.1±1.3)%,故選擇1 μmol/L進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

        2.2 吉非替尼單獨(dú)作用和聯(lián)合SU11274對HGF誘導(dǎo)的細(xì)胞生長抑制的影響

        吉非替尼以不同濃度單獨(dú)作用于PC9、H292和A549細(xì)胞72 h后,MTT法檢測結(jié)果顯示,均產(chǎn)生細(xì)胞生長抑制作用,且呈濃度依賴性。吉非替尼作用于HGF誘導(dǎo)的細(xì)胞后,其IC50值比非HGF誘導(dǎo)組明顯增高,與SU11274聯(lián)合作用于HGF誘導(dǎo)的細(xì)胞后IC50值明顯降低(P<0.05,圖2)。在吉非替尼相同濃度的條件下,HGF誘導(dǎo)組細(xì)胞存活率比非誘導(dǎo)組明顯提高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,圖2)。

        圖2 吉非替尼作用于HGF單用或聯(lián)合SU11274處理的PC9、H292、A549細(xì)胞株藥物濃度-存活率曲線Fig. 2 The concentration-survival curve of gefitinib and HGF treated PC9, H292, A549 cells with or without SU11274

        1 μmol/L SU11274聯(lián)合不同濃度吉非替尼(0.01、0.04、0.1、0.4、1、4和10 μmol/L)作用于HGF誘導(dǎo)的細(xì)胞72 h后,在相同藥物濃度下細(xì)胞存活率比單獨(dú)不同濃度吉非替尼(0.01、0.04、0.1、0.4、1、4和10 μmol/L)作用于HGF誘導(dǎo)的細(xì)胞存活率明顯降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,圖2)。

        2.3 吉非替尼單獨(dú)作用和聯(lián)合SU11274對HGF誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的影響

        用1μmol/L吉非替尼作用于PC9、H292和A549細(xì)胞72 h后,細(xì)胞凋亡率分別為(4.7±2.0)%、(31.8±10.4)%和(10.8±3.6)%。用1 μmol/L吉非替尼單獨(dú)作用于HGF誘導(dǎo)的細(xì)胞72 h后,細(xì)胞凋亡率分別為(4.4±1.7)%、(21.5±8.2)%和(3.1±1.4)%。除了PC9細(xì)胞外,HGF誘導(dǎo)組的凋亡率比非HGF誘導(dǎo)組顯著減少(P<0.05)。SU11274(1 μmol/L)聯(lián)合吉非替尼(1 μmol/L)作用于HGF誘導(dǎo)的細(xì)胞72 h后,細(xì)胞凋亡率比單用吉非替尼作用于HGF誘導(dǎo)細(xì)胞后的凋亡率顯著升高(P<0.05,表1)。

        2.4 吉非替尼單獨(dú)或聯(lián)合SU11274對HGF誘導(dǎo)的細(xì)胞中c-Met及其下游通道蛋白的影響

        Western blot檢測結(jié)果顯示,吉非替尼單獨(dú)作用于誘導(dǎo)前細(xì)胞時,細(xì)胞中p-Stat3、p-Akt和p-Erk1/2蛋白表達(dá)水平均明顯下降。吉非替尼單獨(dú)作用于HGF誘導(dǎo)的細(xì)胞時,細(xì)胞中p-Met、p-Stat3、p-Akt和p-Erk1/2蛋白表達(dá)水平均明顯升高。當(dāng)SU11274和吉非替尼聯(lián)合作用于HGF誘導(dǎo)的細(xì)胞時,細(xì)胞中p-Met、p-Stat3、p-Akt和p-Erk1/2蛋白表達(dá)水平均明顯下降(圖3)。

        表1 吉非替尼單用或聯(lián)合SU11274對HGF誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡率Tab. 1 The effects of gefitinib with or without SU11274 on the apoptosis induced by HGF

        圖3 吉非替尼單用或聯(lián)合SU11274作用對HGF誘導(dǎo)的c-Met及其下游通道蛋白表達(dá)的影響Fig. 3 The expressions of HGF-induced c-Met and downstream signaling pathway proteins affected by gefitinib alone or accompanied with SU11274

        3 討 論

        EGFR是一種跨膜酪氨酸激酶受體,是人類表皮生長因子受體家族中的一員。EGFR基因與配體結(jié)合后,EGFR基因在細(xì)胞內(nèi)區(qū)的酪氨酸發(fā)生自身磷酸化,活化下游信號通道,調(diào)控上皮來源細(xì)胞的增殖、侵襲及遷移。吉非替尼是小分子EGFR-TKI,阻止EGFR自身磷酸化,阻斷EGFR介導(dǎo)的下游通道活性,表現(xiàn)為抑制腫瘤細(xì)胞生長、遷移、侵襲和腫瘤血管生成等。EGFR突變與EGFR-TKI有效率有很大的相關(guān)性,存在原發(fā)性或獲得性耐藥。EGFR基因2次突變(T790M)[9]和MET基因擴(kuò)增[10]是EGFR-TKI耐藥的兩大主要分子機(jī)制,其它可能的機(jī)制有胰島素樣生長因子1受體(IGF-1R)過表達(dá)[11]、蛋白酪氨酸磷酸酶基因(PTEN)缺失[12]、HGF高表達(dá)[13-14]等。HGF/c-Met信號通路參與EGFRTKI獲得性耐藥[4-5]。

        HGF屬于成纖維細(xì)胞的衍生因子,與特異性c-Met受體結(jié)合,使其發(fā)生自身磷酸化,激活細(xì)胞內(nèi)信號途徑,促進(jìn)多種組織細(xì)胞增生分裂、細(xì)胞運(yùn)動和血管生成。在各種惡性腫瘤中發(fā)現(xiàn)異常的HGF/c-Met信號通道,且與不良預(yù)后相關(guān)。Senguta等[15]測定高侵襲狀態(tài)肺癌患者血清中HGF含量明顯升高,血清HGF含量升高可能與EGFR-TKI耐藥有關(guān)。目前,c-Met抑制劑主要有PF02341066、GW2974和SU11274等。SU11274可減少T790M-EGFR型NSCLC細(xì)胞對EGFR-TKI耐藥[16-17]。本研究選擇的PC9細(xì)胞具有EGFR基因突變型敏感株,H292細(xì)胞為EGFR基因野生型敏感株,A549細(xì)胞為EGFR基因野生型耐藥株,從IC50值可以看出其耐藥性。吉非替尼抑制PC9、H292、A549細(xì)胞增殖作用均呈濃度依賴性,HGF誘導(dǎo)后IC50顯著升高,說明HGF明顯提高吉非替尼抑制細(xì)胞增殖的IC50,使3種肺癌細(xì)胞存活率升高,增加了耐藥性。吉非替尼促進(jìn)細(xì)胞凋亡,HGF誘導(dǎo)后則明顯降低其促進(jìn)細(xì)胞凋亡作用。

        細(xì)胞除了表達(dá)EGFR外同時還表達(dá)其它含酪氨酸激酶活性的跨膜受體,稱之為EGFR旁路酪氨酸激酶信號。c-Met屬于受體酪氨酸激酶家族的一員。c-Met與其配體HGF結(jié)合,激活細(xì)胞內(nèi)MAPKs、PI3K/Akt和c-Src/FAK、STAT信號通路。本研究中,吉非替尼對PC9、H292、A549的生長抑制作用呈濃度依賴性,HGF誘導(dǎo)后吉非替尼抑制細(xì)胞的生長曲線往右移。HGF誘導(dǎo)后吉非替尼對PC9、H292、A549細(xì)胞的IC50值明顯升高,使不同基因型肺癌細(xì)胞存活率升高。40 ng/mL HGF和不同濃度吉非替尼及SU11274 (1 μmol/L)作用后,PC9、H292和A549細(xì)胞的存活率恢復(fù)到原來的水平。在EGFR野生型細(xì)胞中,HGF能明顯減少吉非替尼對肺癌細(xì)胞的凋亡,而在EGFR突變型細(xì)胞中,HGF不能明顯減少吉非替尼對肺癌細(xì)胞的凋亡。在SU11274聯(lián)合作用下,吉非替尼對HGF誘導(dǎo)3種肺癌細(xì)胞的凋亡率顯著提高。

        HGF與c-Met結(jié)合后c-Met發(fā)生自身磷酸化,激活Met下游通道(MAPK、PI3K/Akt、c-Src/ FAK和STAT等)。c-Met抑制劑和EGFR-TKI聯(lián)合用藥逆轉(zhuǎn)HGF誘導(dǎo)的EGFR突變型NSCLC細(xì)胞株對EGFR-TKI耐藥,其機(jī)制與抑制c-Met下游通道激活有關(guān)[3-4]。本研究結(jié)果顯示,吉非替尼在無HGF刺激下明顯抑制PC9、H292和A549細(xì)胞內(nèi)Akt、Stat3及Erk1/2的活化,但在HGF誘導(dǎo)下不能抑制PC9、H292和A549細(xì)胞內(nèi)c-Met、Akt、Stat3和Erk1/2活化,同時檢測的非磷酸化的c-Met、Akt、Stat3和Erk1/2總量無明顯變化。說明c-Met及其下游通道蛋白磷酸化參與了HGF誘導(dǎo)不同EGFR基因型NSCLC對吉非替尼耐藥機(jī)制。

        本研究中,在HGF誘導(dǎo)的PC9、H292和A549細(xì)胞凋亡,吉非替尼聯(lián)合SU11274組比單用吉非替尼組HGF激活的c-Met及其下游通道蛋白c-Met、Akt、Stat3和Erk1/2的磷酸化表達(dá)減少。在吉非替尼作用下,PC9、H292和A549細(xì)胞中HGF誘導(dǎo)激活的c-Met及其下游通道蛋白c-Met、Akt、Stat3和Erk1/2被SU11274抑制。提示c-Met抑制劑可逆轉(zhuǎn)HGF誘導(dǎo)不同EGFR基因型NSCLC細(xì)胞株對吉非替尼耐藥,其機(jī)制與逆轉(zhuǎn)c-Met及下游通道c-Met、Akt、Stat3和Erk1/2的激活有關(guān)。聯(lián)合應(yīng)用EGFR-TKI與HGF拮抗劑或c-Met抑制劑對分泌HGF或表達(dá)c-Met及EGFR-TKI耐藥的NSCLC患者可能更加有效,其臨床療效令人期待。

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        SU11274 reverse gefitinib resistance induced by hepatocyte growth factor in different EGFR gene type of non-small cell lung cancer cells

        YAN Chunhua1, XUAN Xianglan2, ZHANG Jia1, AN Changshan1(1.Department of Respiratory Disease, Yanbian University Hospital, Yanji Jilin 133000, China; 2. Department of Respiratory Disease, Yanbian Second People’s Hospital, Yanji Jilin 133000, China)

        AN Changshan E-mail: cs_an2003@aliyun.com

        Background and purpose:Hepatocyte growth factor (HGF) induce epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitor (EGFR-TKI) resistance in non-small cell lung cancer (NSCLC) cells, the mechanism might be related with activation of c-Met. The present study aimed to explore whether c-Met inhibitor SU11274 reverse gefitinib resistance induced by HGF in different EGFR gene types of NSCLC.Methods:PC9 (EGFR-activating mutant), H292 (EGFR-wild type) and A549 (EGFR-wiled) were chosen. The experiments were divided into 6 groups: C group (control), H group (HGF), G group (geftinib), S group (SU11274), GH group (geftinib+HGF), GSH group (geftinib+SU11274+HGF). The cell survival was measured by MTT assay; the cell apoptosis was measured by fow cytometry (FCM); the expressions of c-Met, Stat3, Akt and Erk1/2 protein were examined by Western blot.Results:Gefitinib inhibited cell growth of 3 cells lines in a dose-dependent manner, and treating with HGF could relieveinhibition of cell growth caused by geftinib. The cell survival when treating the HGF-induced cell lines with defferent concentration of geftinib combined with SU11274 was signifcantly decreased than that when treating HGF-induced cell lines with geftinib alone. In 3 cell lines, the apoptosis rate in HGS group was higher than that in HG group (P<0.05). In three cells lines, the p-Met, p-Stat3, p-Akt and p-Erk1/2 expressions in HGS group were lower than that in HG group (P<0.05).Conclusion:SU11274 reversed geftinib resistance induced by HGF in different EGFR gene types of NSCLC cells, the mechanism might be related with inhibiting the HGF-induced activation of c-Met and its downstream signaling pathway.

        Hepatocyte growth factor; Geftinib; Resistance; SU11274; Non-small cell lung cancer

        10.3969/j.issn.1007-3969.2015.02.004

        R735.7

        A

        1007-3639(2015)02-0099-06

        國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81160291)。

        安昌善 E-mail:cs_an2003@aliyun.com

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