張亞楠，唐建武

1.大連醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)與法醫(yī)學(xué)教研室，遼寧 大連 116044；

2.山東中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室，山東 濟(jì)南 250355

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子蛋白在小鼠腹水型肝癌高、低淋巴道轉(zhuǎn)移株中的表達(dá)及意義

張亞楠1，2，唐建武1

1.大連醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)與法醫(yī)學(xué)教研室，遼寧 大連 116044；

2.山東中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室，山東 濟(jì)南 250355

背景與目的：內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶29(endoplasmic reticulum molecular chaperons 29，ERp29)是一種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激蛋白，其高表達(dá)與腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)。本研究旨在探討ERp29在小鼠腹水型肝癌高、低淋巴道轉(zhuǎn)移株中的表達(dá)及與肝癌淋巴道轉(zhuǎn)移的關(guān)系。方法：構(gòu)建小鼠腹水型肝癌細(xì)胞株(高轉(zhuǎn)移株Hca-F、低轉(zhuǎn)移株Hca-P)淋巴道轉(zhuǎn)移動物模型，通過免疫組織化學(xué)、蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)和流式細(xì)胞儀等方法檢測ERp29在Hca-F、Hca-P細(xì)胞株中的表達(dá)情況。結(jié)果：免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果顯示，ERp29在Hca-F、Hca-P中均呈陽性表達(dá)，定位于細(xì)胞質(zhì)，部分細(xì)胞核也有表達(dá)。Western blot檢測結(jié)果顯示，ERp29在Hca-F、Hca-P中的表達(dá)吸光度值分別為0.97±0.03和1.17±0.03，ERp29在Hca-F細(xì)胞株中的表達(dá)(吸光度值)明顯低于Hca-P，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示，ERp29在Hca-F細(xì)胞株中的相對熒光強(qiáng)度值(375.27±47.33)顯著低于Hca-P(623.91±46.80)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。結(jié)論：ERp29在小鼠腹水型肝癌細(xì)胞株Hca-F和Hca-P均有表達(dá)，且在Hca-F中表達(dá)較低，而在Hca-P中表達(dá)較高。ERp29可能與肝癌淋巴道轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶29；肝癌；淋巴道轉(zhuǎn)移

肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma)具有較高的發(fā)病率與死亡率，是世界范圍內(nèi)最為常見的惡性腫瘤之一［1］。研究證明，轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)是導(dǎo)致肝癌患者預(yù)后不良的主要原因［2］。對于許多原發(fā)性腫瘤而言，腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移至局部淋巴結(jié)被認(rèn)為是腫瘤轉(zhuǎn)移的早期信號，淋巴道轉(zhuǎn)移是大多數(shù)惡性腫瘤早期轉(zhuǎn)移的共同階段，但其分子基礎(chǔ)和機(jī)制尚不清楚。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶29(endoplasmic reticulum molecular chaperons 29，ERp29)是一種相對分子質(zhì)量為29×103的蛋白質(zhì)，廣泛表達(dá)于各種組織。近年來，ERp29在腫瘤發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移中的作用得到研究者廣泛重視，可能成為許多腫瘤新的治療靶點。

本研究采用免疫組織化學(xué)、蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)和流式細(xì)胞儀檢測ERp29在小鼠腹水型肝癌高淋巴道轉(zhuǎn)移株(Hca-F)和低淋巴道轉(zhuǎn)移株(Hca-P)中的表達(dá)，探討ERp29在肝癌淋巴道轉(zhuǎn)移過程中的作用，為深入了解腫瘤淋巴道轉(zhuǎn)移的機(jī)制提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 細(xì)胞株和實驗動物

小鼠肝癌高、低淋巴道轉(zhuǎn)移細(xì)胞株Hca-F、Hca-P由大連醫(yī)科大學(xué)病理教研室建立并保存。實驗動物為近交系615小鼠，雄性，4～6周齡，體質(zhì)量18～22 g，由大連醫(yī)科大學(xué)病理教研室繁育并提供［遼實動質(zhì)字(2000)028號］。

1.1.2 試劑和器材

RPMI-1640培養(yǎng)液、胎牛血清購自美國Gibco公司，ERp29多克隆抗體購自英國Abcam公司，β-actin多克隆抗體購自中國北京博奧森生物技術(shù)有限公司，F(xiàn)ITC標(biāo)記山羊抗兔IgG、辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG、免疫組化通用型SP試劑盒購自中國北京中杉金橋生物有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

將凍存的Hca-F和Hca-P細(xì)胞株復(fù)蘇，用PBS洗滌，離心(8 000×g)，棄上清液，重懸細(xì)胞，按每只2×106個細(xì)胞(0.2 mL)分別接種到2只615小鼠腹腔內(nèi)，7 d后無菌條件下抽取腹水0.2 mL，再次分別接種于2只615小鼠腹腔，5 d后無菌條件下抽取非血性腹水。以磷酸鹽緩沖液(PBS，pH為7.4)洗滌1次，將細(xì)胞置于含10%新生牛血清、80 U/mL慶大霉素、pH為7.2的RPMI-1640培養(yǎng)液中，于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%、飽和濕度的條件下培養(yǎng)，以增加細(xì)胞數(shù)量并去除小鼠腹腔巨噬細(xì)胞。

1.2.2 免疫組織化學(xué)檢測

將培養(yǎng)的Hca-F和Hca-P細(xì)胞用PBS洗滌，離心后重懸為1×106個/mL的細(xì)胞懸液，涂片，丙酮固定，3%H2O2室溫溫育15 min，用正常非免疫山羊血清下室溫封閉后，加入ERp29多克隆抗體(1∶500)，4 ℃溫育18 h，滴加生物素標(biāo)記的山羊抗兔二抗，37 ℃下溫育30 min，滴加辣根酶標(biāo)記的鏈霉卵白素工作液，在37 ℃下溫育30 min，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，自來水沖洗返藍(lán)，經(jīng)梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，鏡下觀察ERp29在Hca-F和Hca-P細(xì)胞中的表達(dá)情況。

1.2.3 Western blot法檢測ERp29的表達(dá)情況

超聲破碎法裂解細(xì)胞，4 ℃離心30 min取上清液。Bradford比色法測定蛋白質(zhì)濃度。以12%SDS-PAGE電泳分離后，蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)移至PVDF膜，用5%TBS/BSA于室溫封閉3 h，ERp29多克隆抗體(1∶2 500)、β-actin多克隆抗體(1∶500)與PVDF膜雜交溫育，常規(guī)免疫染色，DAB顯色。實驗重復(fù)3次。用目的條帶與內(nèi)參(β-actin)條帶吸光度值(A)的比值進(jìn)行比較。

1.2.4 流式細(xì)胞儀檢測ERp29的表達(dá)情況

用1 mL含0.2%Triton X-100和5%血清的PBS重懸Hca-F和Hca-P細(xì)胞，PBS洗滌，離心(8 000×g)并重懸為1×106個/mL的細(xì)胞懸液，加入ERp29多克隆抗體(1∶500)1 μL，37 ℃作用1 h。PBS洗滌，加入FITC標(biāo)記的二抗各1 μL，同時以PBS代替一抗作為陰性對照。流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測，每管計數(shù)10 000個細(xì)胞。ERp29蛋白在各細(xì)胞中的表達(dá)以相對熒光強(qiáng)度(relative fuorescence intensity，RFI)表示，RFI=該樣品的幾何均數(shù)×均值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 12.0軟件統(tǒng)計包對各組數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)以x±s表示。組間均數(shù)比較采用t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果

將切片在顯微鏡下觀察，結(jié)果ERp29在Hca-F和Hca-P中均有表達(dá)，主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)，部分細(xì)胞核也有表達(dá)(圖1)。

圖1 ERp29蛋白在Hca-F和Hca-P細(xì)胞中的表達(dá)Fig. 1 Expression of ERp29 protein in Hca-F and Hca-P cells

2.2 Western blot檢測結(jié)果

β-actin條帶作為上樣量的參照，在相對分子質(zhì)量為29×103處Hca-F和Hca-P細(xì)胞中均出現(xiàn)單一蛋白質(zhì)條帶。ERp29蛋白與β-actin在Hca-F和Hca-P細(xì)胞中的A值之比分別為0.97±0.03和1.17±0.03，ERp29蛋白在Hca-F細(xì)胞中的表達(dá)明顯低于Hca-P，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01，圖2，表1)。

表1 ERp29蛋白在Hca-F和Hca-P細(xì)胞中表達(dá)的比較Tab. 1 Expression of ERp29 in Hca-F and Hca-P cells

2.3 流式細(xì)胞儀結(jié)果

ERp29在Hca-F和Hca-P中的RFI均值分別為375.27±47.33和623.91±46.80，ERp29蛋白在Hca-F細(xì)胞中的表達(dá)明顯低于其在Hca-P細(xì)胞中的表達(dá)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01，表1，圖3)。

圖3 流式細(xì)胞儀分析ERp29蛋白在Hca-F和Hca-P細(xì)胞中表達(dá)Fig. 3 Expression of ERp29 protein in Hca-F and Hca-P cells by flow cytometry

3 討 論

Hca-F和Hca-P是從小鼠腹水型肝癌細(xì)胞H22中篩選出的特異性向淋巴道轉(zhuǎn)移的細(xì)胞系，2者具有高度的同源性，但淋巴道轉(zhuǎn)移明顯不同。HCa-F細(xì)胞接種于615小鼠腋中線皮下淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率高于70%，HCa-P細(xì)胞的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率則低于30%，具體的機(jī)制不詳［3-4］。

課題組前期采用熒光差異雙向凝膠電泳和質(zhì)譜技術(shù)篩選出小鼠腹水型肝癌淋巴道轉(zhuǎn)移相關(guān)的蛋白，發(fā)現(xiàn)ERp29蛋白在Hca-P中表達(dá)顯著升高，是Hca-F表達(dá)量的2.63倍［5］。本實驗采用免疫組織化學(xué)、Western blot及流式細(xì)胞儀檢測ERp29蛋白在Hca-F和Hca-P中的表達(dá)，結(jié)果顯示，ERp29蛋白在Hca-P中表達(dá)高于Hca-F，這與課題組前期的研究結(jié)果一致，提示ERp29蛋白可能與小鼠腹水型肝癌淋巴道轉(zhuǎn)移相關(guān)。

大量實驗表明，ERp29基因在腫瘤中具有抑癌基因的作用。Shnyder等［6］的研究發(fā)現(xiàn)，與低轉(zhuǎn)移癌細(xì)胞MCF-7相比，ERp29在人乳腺高轉(zhuǎn)移癌細(xì)胞MDA-MB-43中表達(dá)下降；Bambang等［7］的研究結(jié)果顯示，與非癌組織相比，乳腺癌組織的ERp29表達(dá)下降，并與乳腺癌侵襲性特征相關(guān)。桑旭等［8］通過免疫組織化學(xué)的方法檢測ERp29在胃癌及癌旁組織中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)胃癌組織中ERp29表達(dá)下降，并且ERp29的表達(dá)與腫瘤分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈負(fù)相關(guān)。唐衛(wèi)文等［9］研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，食管癌旁組織ERp29呈高表達(dá)，食管癌組織ERp29的表達(dá)明顯下降，而食管癌組織ERp29的表達(dá)亦與腫瘤分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈負(fù)相關(guān)。

然而，ERp29在腫瘤發(fā)生、發(fā)展與轉(zhuǎn)移中的作用及機(jī)制還不明確。ERp29是一種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激蛋白，其功能研究主要定位于參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)折疊和分泌蛋白的輸出的分子伴侶［10］。結(jié)合本實驗結(jié)果我們推測：腫瘤組織內(nèi)由于血管供應(yīng)不良等原因，存在低糖、低氧及酸中毒等應(yīng)激的內(nèi)環(huán)境，造成蛋白質(zhì)折疊錯誤增加，引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)，代償性地導(dǎo)致BiP/GRP78、ERp29表達(dá)升高，ERp29與BiP/GRP78形成復(fù)合物相互作用激活膜蛋白，用以糾正錯誤的蛋白質(zhì)折疊，抑制小鼠腹水型肝癌的淋巴道轉(zhuǎn)移。誘導(dǎo)ERp29的表達(dá)可能是腫瘤細(xì)胞在不利條件下生存的一種防御機(jī)制。但是，目前對ERp29的表達(dá)調(diào)控未深入研究，ERp29究竟是如何參與肝癌發(fā)生、發(fā)展及淋巴道轉(zhuǎn)移，以及其在其它腫瘤中的作用等問題，尚需進(jìn)一步探討。

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The expression and significance of ERp29 in 2 mice hepatocellular carcinoma ascites syngeneic celllines with high and low lymph node metastasis rates

ZHANG Yanan1,2, TANG Jianwu1(1.Department of Pathology and Forensic Medicine, Dalian Medical University, Dalian Liaoning 116044, China; 2.Department of Pathology, Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan Shandong 250355, China)

TANG Jianwu E-mail: jianwutang@163.com

Background and purpose:ERp29 belongs to endoplasmic reticulum stress proteins and might play roles in neoplasm metastasis. This study aimed to investigate the expression of ERp29 in Hca-F and Hca-P cells and to elucidate its role in lymphatic metastasis.Methods:Immunohistochemistry, Western blot and fow cytometry analysis were used to detect the expression of ERp29 in Hca-F and Hca-P.Results:The results of immunohistochemistry suggested that ERp29 protein was located at cytoplasm of hepatic cells and some were also detected in the nucleus. The results of western blot suggested that ERp29 had positive expression in Hca-F and Hca-P cells. Its expression in Hca-F cells was apparently lower than that in Hca-P cells. And there was statically different between Hca-F and Hca-P cells (P＜0.01). The relative fuorescence intensity of ERp29 protein was signifcantly lower in Hca-F cells (375.27±47.33) than that in Hca-F cells (623.91±46.80) by fow cytometry (P＜0.01).Conclusion:The different expression of ERp29 may be related to the potential ability of tumor lymphatic metastasis in Hca-F and Hca-P cells.

Endoplasmic reticulum molecular chaperons 29; Hepatocellular carcinoma; Lymphatic metastasis

10.3969/j.issn.1007-3969.2015.02.003

R735.7

A

1007-3639(2015)02-0095-04

2014-07-05

2014-09-23）

國家自然科學(xué)基金面上項目(30572098)。

唐建武 E-mail:jianwutang@163.com