復旦大學附屬腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所，復旦大學上海醫(yī)學院腫瘤學系，上海 200032

低表達miR-33a誘導胰腺癌細胞對吉西他濱的耐藥

梁晨，王瑧，李影奕

復旦大學附屬腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所，復旦大學上海醫(yī)學院腫瘤學系，上海 200032

背景與目的：胰腺癌是一種惡性程度很高的腫瘤。由于其對一線化療藥物吉西他濱的耐受，往往導致預后較差。MicroRNA(miRNA，miR)是一類非編碼小RNA，參與腫瘤的多種生物學功能。miR-33a作為代謝相關(guān)的miRNA被廣泛研究，而與耐藥之間關(guān)系的報道較少。該研究通過探討miR-33a參與胰腺癌吉西他濱耐藥及其作用解析，為胰腺癌化療提供新的理論依據(jù)。方法：采用原位雜交方法檢測胰腺癌組織中miR-33a的表達情況；采用實時熒光定量PCR(Real-time PCR)檢測各胰腺癌細胞系中miR-33a的表達情況。利用SW1990和Miapaca-2胰腺癌親本細胞株，構(gòu)建吉西他濱耐藥細胞株(SW1990res，Miapaca-2res)及miR-33a穩(wěn)定表達細胞株(SW1990-miR-33a，Miapaca-2-miR-33a、SW1990res-miR-33a和Miapaca-2res-miR-33a)；采用細胞毒性實驗檢測miR-33a的表達對胰腺癌細胞對吉西他濱敏感性的影響。結(jié)果：miR-33a在胰腺癌組織樣本中普遍低表達。與HEK293T正常人胚腎細胞相比，其在各胰腺癌細胞系中均呈低表達。miR-33a過表達可以增加胰腺癌細胞對吉西他濱的藥物敏感性，能有效逆轉(zhuǎn)胰腺癌細胞對吉西他濱的耐藥。結(jié)論：miR-33a在胰腺癌組織中低表達，導致胰腺癌患者對吉西他濱獲得性耐藥。增加miR-33a表達，從而增強了胰腺癌細胞對吉西他濱的藥物敏感性，為開發(fā)新型胰腺癌分子靶向治療藥物，聯(lián)合化療提供新的理論依據(jù)。

miR-33a；胰腺癌；吉西他濱耐藥

胰腺癌是一類惡性程度很高的腫瘤，病死率居惡性腫瘤的第4位［1］。目前，胰腺癌的5年總生存率＜5%，并且中位生存期＜1年［2］。吉西他濱作為胰腺癌化療的一線藥物用于臨床已經(jīng)有十幾年，但是大部分胰腺癌患者會出現(xiàn)對吉西他濱的耐藥，最終導致化療失敗［2-3］。近期有研究［4-5］發(fā)現(xiàn)通過調(diào)控吉西他濱在細胞內(nèi)的代謝，誘導耐藥的發(fā)生，但其耐藥的分子機制還不完全清楚。因此，探討胰腺癌對吉西他濱耐藥的分子生物學機制，對于胰腺癌的個體化治療及預后評估具有重要的價值。

MicroRNA(miRNA，miR)是一類長約22個堿基的非編碼小RNA。它們可以在轉(zhuǎn)錄后對其靶基因進行沉默調(diào)控，從而發(fā)揮癌基因或抑癌基因的作用［6-8］，并且miRNA的表達失調(diào)也參與了胰腺癌細胞的增殖、轉(zhuǎn)移、化療耐藥和腫瘤的預后評估［6-9］。miR-33a作為脂質(zhì)代謝重要的調(diào)節(jié)分子被廣泛報道［10-11］，其與腫瘤之間的關(guān)系也越來越受到研究者的關(guān)注，但是目前其與吉西他濱耐藥的關(guān)系研究較少。本研究通過探討miR-33a參與胰腺癌吉西他濱耐藥及其作用解析，為胰腺癌化療提供新的理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 細胞系

人類胰腺癌細胞株P(guān)CI55是由日本金澤大學腫瘤研究所惠贈，其余胰腺癌細胞株均購自于美國模式培養(yǎng)物保藏所(American Type Culture Collection，ATCC)。其中，人胰腺癌細胞株P(guān)CI55、Miapaca-2和PANC-1培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，置于37 ℃、CO2體積分數(shù)為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。Capan-1、SW1990和人胚腎HEK293T細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，置于37 ℃、CO2體積分數(shù)為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(培養(yǎng)基和血清均購自Biosera公司)。

1.2 鎖核酸原位雜交(locked nucleic acidin situhybridization，LNA-ISH)檢測

人胰腺癌組織來自復旦大學附屬腫瘤醫(yī)院，并且經(jīng)過患者知情同意。組織經(jīng)過脫蠟，于37 ℃用蛋白酶K消化15 min，隨后通過梯度酒精脫水。250 nmol/L的5’-和3’-端用地高辛雙標記的miR-33a探針(序列為：5’-Dig_ N-TGCAATGCAACTACAATGCAC-Dig_N-3’；購自丹麥Exiqon公司)50 ℃雜交過夜。隨后依次用5×SSC、1×SSC和0.2×SSC緩沖液徹底清洗切片。再用封閉液封閉30 min，然后用堿性磷酸酶標記的抗地高辛抗體在37 ℃溫育30 min，再通過NBT/BCIP作為堿性磷酸酶的底物，37 ℃反應120 min，產(chǎn)物顯示為深藍色，最后用核固紅染核，封片，顯微鏡下觀察。本研究采用5S rRNA探針或滅菌蒸餾水代替miR-33a探針，分別作為陽性對照和陰性對照。原位雜交結(jié)果判斷：miR-33a的表達由陽性細胞的數(shù)量和陽性強度來評分，陽性細胞數(shù)量(＜5%為0分；5%～50%為1分；＞50%為2分)，陽性強度(無色為0分；淡藍色為1分；藍紫色為2分)，2者評分相乘，0分定為陰性，1～2分定為低表達，3～4分定為高表達。

1.3 實時熒光定量PCR(Real-time PCR)檢測

利用TRIzol(購自美國Invitrogen公司)提取細胞中總的RNA，用PrimeScript RT Reagent Kit［購自寶生物工程(大連)有限公司］將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。再用SYBR?Premix Ex Taq?Ⅱ，ROX Reference Dye［購自寶生物工程［(大連)有限公司］，按照產(chǎn)品說明書進行Real-time PCR檢測。U6 snRNA引物序列上游為5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’；下游為5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。miR-33a的引物購自廣州銳博生物科技有限公司。通過ΔΔCt方法計算目的基因的相對表達量，結(jié)果以±s 表示。

1.4 胰腺癌吉西他濱耐藥細胞系建立

采用間歇濃度梯度倍增法誘導建立胰腺癌耐藥細胞株SW1990res和Miapaca-2res。具體過程：在6孔板中分別接種4×104個的SW1990和Miapaca-2細胞，至對數(shù)生長期，加入吉西他濱，使其在SW1990的培養(yǎng)基中終濃度為0.25 μmol/L，而對Miapaca-2的終濃度為0.5 μmol/L。在培養(yǎng)箱內(nèi)共同培養(yǎng)48 h后，棄含藥培養(yǎng)液。待存活細胞長至80%傳代2次，再重復同一劑量的藥物培養(yǎng)；至較穩(wěn)定后，依次遞增每次使用藥物濃度，直至其對高濃度的吉西他濱產(chǎn)生穩(wěn)定耐藥性(SW1990res和Miapaca-2res兩細胞株對吉西他濱穩(wěn)定耐受的最高濃度分別是32和64 μmol/L)，并且在無藥培養(yǎng)液中以及反復凍存后耐藥性依然保持穩(wěn)定。

1.5 利用慢病毒構(gòu)建miR-33a的穩(wěn)定表達細胞株

將人類miR-33a序列(GUGCAUUGUA GUUGCAUUGCA)插入到慢病毒表達載體pCDH-CMV-copGFP中，構(gòu)建成miR-33a過表達質(zhì)粒。使用LipofectamineTM2000(購自美國Life Technologies公司)將pCDH-CMV-copGFP-miR-33a表達質(zhì)粒與病毒包裝質(zhì)粒ps-PAX2和pMD2.G共轉(zhuǎn)染至HEK293T細胞中，轉(zhuǎn)染后48 h收集病毒液。將收集得到的病毒液分別感染SW1990、SW1990res、Miapaca-2和Miapaca-2res胰腺癌細胞，并在培養(yǎng)基中加入8 μg/mL polybrene(購自美國Sigma公司)。感染48 h后收集細胞，通過流式細胞儀分選最終獲得miR-33a穩(wěn)定表達細胞株SW1990-miR-33a、SW1990resmiR-33a、Miapaca-2-miR-33a和Miapaca-2res-miR-33a。

1.6 吉西他濱半數(shù)抑制濃度(IC50)檢測

取對數(shù)生長期的胰腺癌細胞，按1×104個/孔接種于96孔板中，每孔100 μL，貼壁培養(yǎng)24 h后吸出培養(yǎng)基。以培養(yǎng)基稀釋吉西他濱貯液配制不同濃度的吉西他濱，然后每孔分別加入相應培養(yǎng)基100 μL，每個濃度設置6個復孔；同時設置無藥物的細胞對照組和無細胞的空白對照組。處理48 h后，每孔加入10 μL CCK-8［東仁化學科技(上海)有限公司］溶液，37 ℃溫育2 h，在酶標儀450 nm波長下測定吸光度(A)值。計算并繪制藥物劑量—存活率曲線，利用GraphPad PRISM 5.0軟件計算IC50。實驗重復3次。

1.7 統(tǒng)計學處理

2 結(jié) 果

2.1 miR-33a在胰腺癌組織中低表達

本研究收集了40例胰腺癌患者的腫瘤組織標本，通過原位雜交技術(shù)檢測miR-33a的表達情況。與陽性對照和陰性對照相比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-33a在胰腺癌的癌旁組織和癌組織中均表達，并且，miR-33a在胰腺癌的癌旁組織中高表達，在胰腺癌組織中普遍為低表達(47.5%)或陰性(30%)，表明miR-33a在胰腺癌組織中的表達被抑制，提示miR-33a可能是一種抑制癌癥的miRNA(圖D)。

2.2 miR-33a在胰腺癌細胞系中低表達

本研究進一步檢測了胰腺癌細胞系中miR-33a的表達水平。本研究分別提取了Capan-1、Miapaca-2、PANC-1、PCI55和SW1990各胰腺癌細胞株的總RNA，通過Real-time PCR檢測發(fā)現(xiàn)，miR-33a在Capan-1細胞中表達量相對較低，在SW1990中表達量相對較高，但是各胰腺癌細胞系miR-33a的表達量均明顯低于正常人胚腎HEK293T細胞(圖2)。

2.3 miR-33a可以增強胰腺癌細胞對吉西他濱的敏感性

利用Miapaca-2和SW1990胰腺癌細胞構(gòu)建了2株miR-33a的穩(wěn)定過表達細胞株，分別是Miapaca-2-miR-33a和SW1990-miR-33a，并通過Real-time PCR證實了miR-33a在2株細胞株中過表達，提示穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株構(gòu)建成功(圖3A、B)。采用細胞毒性實驗檢測了miR-33a對胰腺癌細胞吉西他濱敏感性的影響，結(jié)果顯示，SW1990和SW1990-miR-33a的IC50分別為500和200 nmol/L，可見miR-33a過表達細胞株，經(jīng)吉西他濱處理后，細胞活力顯著受到抑制，提示細胞過表達miR-33a可以增強其對吉西他濱的敏感性(圖3C)。此外，親本細胞株Miapaca-2的IC50為1 000 nmol/L，而Miapaca-2-miR-33a細胞的IC50為331 nmol/L，IC50也明顯降低，說明經(jīng)吉西他濱處理后，miR-33a過表達細胞株的細胞活力更容易受到抑制(圖3D、E)。

圖1 原位雜交檢測miR-33a在胰腺癌組織中的表達情況Fig. 1 Aberrant expression of miR-33a in human pancreatic cancer tissue detected by in situ hybridization

圖2 miR-33a在各胰腺癌細胞系和HEK293T細胞中的表達情況Fig. 2 Expression profiling of miR-33a in human pancreatic cancer cell lines and HEK293T

圖3 miR-33a過表達可以增強胰腺癌細胞的吉西他濱的敏感性Fig. 3 Over expression of miR-33a could increase the chemosensitivity to gemcitabine in pancreatic cancer cells

2.4 miR-33a可以逆轉(zhuǎn)胰腺癌細胞對吉西他濱耐藥

為了考察miR-33a對吉西他濱耐藥的影響，本研究構(gòu)建了2株吉西他濱耐受的胰腺癌細胞系，分別是SW1990res和Miapaca-2res。SW1990res和Miapaca-2res耐藥細胞的IC50分別是100和168 μmol/L，結(jié)合親本細胞株SW1990和Miapaca-2對吉西他濱的IC50分別為0.5和1 μmol/L，由此計算得出耐藥指數(shù)分別是200和168，提示成功建立胰腺癌吉西他濱耐藥細胞株。Real-time PCR檢測結(jié)果提示，在吉西他濱耐藥的胰腺癌細胞株SW1990res和Miapaca-2res中，miR-33a的表達被進一步抑制(圖4A)。由于前期研究結(jié)果顯示，miR-33a可以增強胰腺癌細胞對吉西他濱的敏感性，所以我們進一步探討miR-33a過表達能否逆轉(zhuǎn)耐藥細胞株對吉西他濱的耐藥性。首先，構(gòu)建穩(wěn)定過表達miR-33a的SW1990res-miR-33a和Miapaca-2res-miR-33a細胞株。Real-time PCR檢測結(jié)果顯示，miR-33a穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的耐藥細胞株構(gòu)建成功(圖4B)。細胞毒性實驗結(jié)果表明，miR-33a過表達耐藥細胞株SW1990res-miR-33a和Miapaca-2res-miR-33a的IC50分別28和60 μmol/L，經(jīng)吉西他濱處理后，IC50明顯降低，細胞活力顯著受到抑制，從而有效地逆轉(zhuǎn)耐藥細胞株對吉西他濱的耐受(圖4C～E)。

圖4 miR-33a過表達可以逆轉(zhuǎn)胰腺癌耐藥細胞對吉西他濱的耐藥Fig. 4 Over expression of miR-33a could reverse the gemcitabine resistance in resistant pancreatic cancer cells

3 討 論

化療耐受普遍發(fā)生在腫瘤治療過程中，也是一些腫瘤患者治療失敗的重要原因。目前研究表明，胰腺癌耐藥是由多種機制調(diào)控產(chǎn)生，參與獲得性耐藥的共同機制主要有以下幾個方面：①Survival通路的激活是誘導耐藥的重要機制之一［12］；②藥物排泄增加，如多藥耐藥基因1(MDR-1)所表達的p-gp是ATP依賴性轉(zhuǎn)運體，可以將大部分藥物在起效前排出細胞［13］；③藥物作用的下游分子發(fā)生過表達或突變，進而發(fā)生耐藥［14］。吉西他濱作為細胞周期特異性藥物，可以被代謝為具有活性的三磷酸核苷，與dCTP競爭摻入DNA鏈中，抑制DNA的復制，進而引起細胞凋亡［4］。吉西他濱目前仍被視為治療胰腺癌最為有效的化療藥物之一，然而其化療耐受是胰腺癌治療過程中的一個重要障礙，并且其耐受的具體機制尚不清楚。因此，吉西他濱耐藥機制作為胰腺癌研究的熱點，有助于開發(fā)和完善胰腺癌的治療方法。人類平衡型核苷轉(zhuǎn)運體1(human equilibrative nucleoside transporter-1，hENT-1)的表達下降，限制了吉西他濱的細胞內(nèi)攝取，是公認的體外耐藥機制之一［15］。當吉西他濱被攝取進入細胞后，若脫氧胞苷激酶的活性喪失，將阻礙其轉(zhuǎn)變?yōu)閱瘟姿猁}，進而影響其合成活性形式，最終導致耐藥的發(fā)生。核苷還原酶的過表達，同樣通過抑制DNA的合成和修復參與吉西他濱的耐藥過程［16］。此外，AKT依賴途徑對于吉西他濱耐藥也起到了重要作用［17］。

近年來，隨著研究不斷深入，發(fā)現(xiàn)miRNA與腫瘤的增殖、凋亡以及耐藥有著密切的關(guān)系［9］。因此，在腫瘤的分子生物學研究中，miRNA作為一種非編碼RNA得到了廣泛關(guān)注，并且有望作為部分腫瘤的診斷和預后指標［18-19］。有報道［10］顯示，miR-33a對膽固醇的合成和脂質(zhì)代謝有著重要的調(diào)節(jié)作用，并且可以通過激活AKT的磷酸化，促進合成細胞外基質(zhì)，導致肝硬化的形成［20］。但是它與腫瘤的關(guān)系目前研究較少，具體的作用機制也不完全清楚。Thomas等［21］發(fā)現(xiàn)，miR-33a在淋巴瘤、肝癌和結(jié)腸癌等多種腫瘤細胞中普遍低表達，并且發(fā)揮了抑癌基因的作用。在本研究中，同樣發(fā)現(xiàn)miR-33a在各胰腺癌細胞中表達受到抑制，因此推測其在胰腺癌中也起到了一定抑癌作用。

有報道［11］顯示，miR-33a可以通過下調(diào)TWIST的表達，促進骨肉瘤細胞發(fā)生順鉑耐藥。然而，本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-33a在胰腺癌細胞中對吉西他濱有著一定的增敏作用。由于miRNA在不同的細胞中可以通過降解不同的靶基因發(fā)揮不同的生物學功能［22］，所以miR-33a可能在胰腺癌中有特殊的靶基因，并且在胰腺癌細胞中對吉西他濱的增敏作用也具有一定的細胞特異性及組織特異性。有報道［23］顯示，miR-33a有多個腫瘤相關(guān)靶基因，其中細胞周期蛋白依賴性激酶6(cyclindependent kinase 6，CDK6)就是一個重要靶基因，其通過下調(diào)CDK6影響細胞周期，抑制細胞增殖。Fang等［24］發(fā)現(xiàn)，miR-33a可以下調(diào)β-catenin的表達，進而負向調(diào)控Wnt信號通路。此外，miR-33a還可以下調(diào)Pim-1(一種腫瘤相關(guān)激酶)的表達，從而影響細胞增殖能力［21］。由于這些靶基因同樣可以參與到腫瘤化療的耐藥過程中［14］，所以，本研究推測，miR-33a可能在胰腺癌細胞中通過下調(diào)這些靶基因抑制細胞的增殖，進而增加細胞對吉西他濱的敏感性，但是具體機制還有待進一步的研究。

此外，miRNA的表達往往受到某些刺激調(diào)控，如乏氧等［25-26］。本研究發(fā)現(xiàn)，在胰腺癌耐藥細胞中，miR-33a的表達水平明顯低于親本細胞，可能吉西他濱激活了細胞中的相關(guān)通路，進而對miR-33a的表達起到抑制作用，最終誘導細胞發(fā)生獲得性吉西他濱耐藥。但是經(jīng)吉西他濱處理后誘導miR-33a表達抑制的具體機制尚需進一步研究，以闡明miR-33a與耐藥的關(guān)系。

綜上所述，miR-33a是胰腺癌中一種新型的吉西他濱增敏分子，可以有效逆轉(zhuǎn)吉西他濱的耐藥。利用其進行基因靶向治療，可能為臨床治療難治性胰腺癌提供新的思路。

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Down regulation of miR-33a is involved in gemcitabine chemoresistance in human pancreatic cancer

LIANG Chen, WANG Zhen, LI Yingyi (Cancer Research Institute, Fudan University Shanghai Cancer Center; Department of Oncology, Shanghai Medical College, Fudan University, Shanghai 200032, China)

LI Yingyi E-mail: liyingyi@fudan.edu.cn

Background and purpose:Pancreatic cancer is one of the most deadly human malignant neoplasms. Resistance to chemotherapeutic drugs is a major reason responsible for poor prognosis in the treatment of pancreatic cancer patients. MicroRNA (miRNA, miR) is a family of small non-coding RNA molecules, dysregulated miRNA is associated with various tumor biological function. miR-33a has been widely reported as a metabolismrelated miRNA, while its relationship with drug resistance has little understand. This study was focused on the effect of miR-33a on gemcitabine chemoresistance in pancreatic cancer to bring the novel theoretical basis to chemotherapy for pancreatic cancer.Methods:In situ hybridization and Real-time PCR were used to analyze the miR-33a expressions in pancreatic cancer tissue sample and cell lines, respectively. Cell counting kit 8 (CCK-8) assay was used to calculate the IC50value of different pancreatic cancer cells.Results:miR-33a was down-regulated in pancreatic cancer tissue and cell lines compared with para-cancerous tissues and normal HEK293T cells. Moreover, miR-33a over expression not only could enhance the chemosensitivity to gemcitabine in pancreatic cancer cells, but also rescue the gemcitabine resistance in pancreatic cancer cells.Conclusion:Down regulation of miR-33a in pancreatic cancer decreases the chemosensitivity to gemcitabine, resulting in development of acquired gemcitabine chemoresistance. It provides the theoretical basis to develop a new molecular targeted drug to combine with chemotherapy for pancreatic cancer.

miR-33a; Pancreatic cancer; Gemcitabine chemoresistance

10.3969/j.issn.1007-3969.2015.02.002

R735.9

A

1007-3639(2015)02-0087-08

2014-11-26

2015-01-20）

國家自然科學基金面上項目(30973476、81272727、81472223)；上海市浦江人才計劃(10PJ1402100)。

李影奕 E-mail:liyingyi@fudan.edu.cn