復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院胰腺肝膽外科，胰腺腫瘤研究所，復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院腫瘤學(xué)系，上海 200032

E-cadherin/β-catenin影響胰腺癌PANC-1細胞糖酵解效應(yīng)的實驗研究

秦毅，梁丁孔，施思，吉順榮，張波，許文彥，劉江，徐近，倪泉興，虞先濬

復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院胰腺肝膽外科，胰腺腫瘤研究所，復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院腫瘤學(xué)系，上海 200032

背景與目的：鈣黏附蛋白E(E-cadherin)低表達與癌細胞的高侵襲轉(zhuǎn)移潛能密切相關(guān)，但其與癌細胞葡萄糖代謝的關(guān)系鮮見報道。該研究旨在探討E-cadherin與胰腺癌PANC-1細胞糖酵解效應(yīng)的關(guān)系。方法：通過轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor β，TGF-β)引起E-cadherin低表達、敲減與E-cadherin相互作用的β-連環(huán)蛋白(β-catenin)的基因以及過表達E-cadherin等方法，檢測PANC-1細胞通過糖酵解效應(yīng)吸收葡萄糖和生成乳酸能力的變化以及糖酵解通路中關(guān)鍵基因的表達。結(jié)果：E-cadherin可以負向調(diào)控PANC-1細胞的糖酵解效應(yīng)，抑制腫瘤細胞吸收葡萄糖和分泌乳酸的能力(P＜0.05)。而與其相互作用的β-catenin可以正向調(diào)控PANC-1細胞的糖酵解效應(yīng)，促進葡萄糖的吸收和乳酸的生成，結(jié)果差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。同時糖酵解效應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)控分子去乙?；?(sirtuin 3，SIRT3)也可以引起PANC-1細胞中E-cadherin表達的改變。結(jié)論：PANC-1細胞中E-cadherin低表達可以引起葡萄糖代謝模式的轉(zhuǎn)化，促進PANC-1細胞的糖酵解效應(yīng)，同時通過導(dǎo)入糖酵解效應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)控分子SIRT3也可以引起E-cadherin表達的改變。這些結(jié)果為研究胰腺癌侵襲轉(zhuǎn)移過程中糖代謝模式的轉(zhuǎn)化提供了重要線索，為通過改變糖酵解效應(yīng)進而影響胰腺癌的侵襲轉(zhuǎn)移潛能提供了干預(yù)模式。

鈣黏附蛋白E；β-連環(huán)蛋白；去乙酰化酶3；糖酵解

腫瘤細胞的高侵襲轉(zhuǎn)移潛能是腫瘤難以被根治和患者死亡的重要原因。腫瘤細胞的侵襲轉(zhuǎn)移是個復(fù)雜的生理過程，涉及到細胞與細胞之間以及細胞與細胞外基質(zhì)的相互作用［1-2］。在腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移過程中，鈣黏附蛋白E(E-cadherin)發(fā)揮了重要的作用，其轉(zhuǎn)錄和蛋白表達水平的下調(diào)是腫瘤發(fā)生侵襲及轉(zhuǎn)移的重要原因［3］。腫瘤的代謝過程對于維系細胞的基本生理活動起著至關(guān)重要的作用［4］，但是腫瘤代謝與細胞形態(tài)變化和侵襲轉(zhuǎn)移潛能之間的關(guān)系報道甚少。

最近的研究表明，在腫瘤細胞發(fā)生侵襲及轉(zhuǎn)移的過程中，細胞的代謝模式會發(fā)生從線粒體的氧化磷酸化到糖酵解效應(yīng)的轉(zhuǎn)化［5］。因此，深入了解腫瘤代謝與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移之間的關(guān)系，會為了解腫瘤的發(fā)生、發(fā)展以及干預(yù)腫瘤的惡性生物學(xué)行為提供重要的線索。本研究通過觀察PANC-1細胞中腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的重要標志性分子E-cadherin與腫瘤葡萄糖代謝之間的關(guān)系，從一個全新的角度了解腫瘤代謝與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移間的關(guān)系，為通過干預(yù)代謝進而影響腫瘤的惡性生物學(xué)行為提供了重要的線索。

1 材料和方法

1.1 細胞

胰腺癌PANC-1細胞購自美國模式培養(yǎng)物集存庫(American Type Culture Collection，ATCC)，在含有10%的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并置于37 ℃、CO2體積分數(shù)為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2 抗體

E-cadherin(ab40772)、β-連環(huán)蛋白(β-catenin)(ab32572)、c-myc(ab32072)和乏氧誘導(dǎo)因子1α(hypoxia inducible factor 1 α，HIF1α)(ab51608)抗體購自英國Abcam公司，HA標簽抗體購自天根生化科技(北京)有限公司，β-actin內(nèi)參抗體購自美國Proteintech公司，組蛋白H4抗體購自Cell Signaling Technology公司。

1.3 試劑盒

細胞核抽提試劑盒購自美國Pierce公司，葡萄糖吸收和乳酸生成分析試劑盒購自美國Biovision公司。

1.4 實時定量PCR檢測

細胞內(nèi)總RNA抽提、反轉(zhuǎn)錄以及實時定量PCR試劑盒購自天根生化科技(北京)公司。引物序列如下：GLUT1基因順義鏈：5’-AACTCTTCAGCCAGGGTCCA-3’，反義鏈：5’-CACAGTGAAGATGATGAAGAC-3’；HK2基因順義鏈：5’-GATTGTCCGTAACATTCTCATCGA-3’，反義鏈：5’-TGTCTTGAGCCGCTCTGAGAT-3’；Pdk1基因順義鏈：5’-CGGATCAGAAACCGACACA-3’，反義鏈：5’-ACTGAACATTCTGGCTGGTGA-3’；LDHA基因順義鏈：5’-GGAGATTCCAGTGTGCCTGT-3’，反義鏈：5’-GTCCAATAGCCCAGGATGTG-3’；β-actin基因順義鏈：5’-AGAGCTA C G A G C T G C C T G A C-3’，反義鏈：5’-AGCACTGTGTTGGCGTACAG-3’。

1.5 克隆載體構(gòu)建以及慢病毒顆粒制備

E-cadherin和去乙?；?(sirtuin 3，SIRT3)慢病毒過表達載體構(gòu)建采用pCDH-CMV-EF1-Puro載體，敲減β-catenin基因的慢病毒載體采用pLKO.1 TRC cloning vector，針對β-catenin的靶序列為TTGTTATCAGAGGACTAAATA(21 bp)。慢病毒的生產(chǎn)采用HEK-293T細胞，轉(zhuǎn)染慢病毒載體以及包裝質(zhì)粒psPAX2和pMD2.G至HEK-293T細胞中，比例為4∶3∶1。轉(zhuǎn)染后48 h收集慢病毒顆粒用于感染目的細胞。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，組間比較采用t檢驗分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factorβ，TGF-β)引起E-cadherin表達下調(diào)，促進PANC-1細胞的糖酵解效應(yīng)

PANC-1細胞用TGF-β(10 ng/mL)處理72 h，觀察細胞形態(tài)變化，發(fā)現(xiàn)細胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)形態(tài)的改變(圖1A、B)。用免疫印跡雜交的方法檢測與EMT相關(guān)的幾個關(guān)鍵指標，E-cadherin水平下調(diào)，鈣黏附蛋白N(N-cadherin)和波形蛋白水平上升(圖1C)。為了初步驗證E-cadherin下調(diào)是否與腫瘤糖代謝轉(zhuǎn)化相關(guān)，首先在蛋白水平上檢測了影響代謝的關(guān)鍵分子c-myc和HIF1α的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TGF-β可以引起c-myc和HIF1α的明顯上調(diào)，提示PANC-1細胞在發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移的過程中，會有糖代謝模式的轉(zhuǎn)化(圖1D)。HIF1α作為重要轉(zhuǎn)錄因子通過調(diào)控糖酵解途徑中的代謝酶參與腫瘤細胞乏氧適應(yīng)，因此，本研究檢測了糖酵解途徑中的4個HIF1α的靶基因，結(jié)果顯示，葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白1(glucose transporter 1，GLUT1)、己糖激酶2(hexokinase 2，HK2)、乳酸脫氫酶A(lactate dehydrogenase A，LDHA)和丙酮酸脫氫酶激酶同工酶1(pyruvate dehydrogenase kinase isozyme 1， PDK1)在TGF-β處理后均有明顯上升(圖1E)。最后，通過檢測PANC-1細胞吸收葡萄糖和分泌乳酸的水平發(fā)現(xiàn)，TGF-β處理引起的E-cadherin下調(diào)確實促進了PANC-1細胞吸收葡萄糖和分泌乳酸的能力(圖1F)。實驗結(jié)果顯示，TGF-β引起E-cadherin表達下調(diào)可以促進腫瘤細胞以糖酵解方式代謝葡萄糖。

圖1 TGF-β處理細胞引起E-cadherin下調(diào)，促進PANC-1細胞的糖酵解效應(yīng)Fig. 1 TGF-β treatment induced E-cadherin down regulation and promoted glycolysis in PANC-1 cells

2.2 敲減β-catenin蛋白的基因抑制PANC-1細胞代謝葡萄糖的能力

β-catenin是與E-cadherin密切相關(guān)的分子，參與了腫瘤細胞發(fā)生、發(fā)展和侵襲轉(zhuǎn)移等多個生理過程。既往的研究提示，E-cadherin的減少同時伴隨有β-catenin的核內(nèi)移位而行使轉(zhuǎn)錄因子的功能［6］。因此，本研究通過慢病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染shRNA的方法，干擾細胞內(nèi)β-catenin的表達(圖2A)，進而檢測β-catenin與PANC-1細胞糖酵解的關(guān)系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，干擾β-catenin的表達，可以顯著下調(diào)代謝關(guān)鍵調(diào)控分子c-myc和HIF1α的表達(圖2B)，同時抑制PANC-1細胞吸收葡萄糖和生成乳酸的能力(圖2C)，提示β-catenin可以促進PANC-1細胞的糖酵解效應(yīng)。

2.3 過表達E-cadherin可以抑制PANC-1細胞糖酵解代謝葡萄糖的能力

通過慢病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染方式，在PANC-1細胞內(nèi)過表達E-cadherin，進而觀測E-cadherin上調(diào)與PANC-1細胞糖酵解的關(guān)系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，細胞內(nèi)過表達E-cadherin后，可以顯著下調(diào)關(guān)鍵代謝調(diào)控因子c-myc和HIF1α的表達(圖3A)，同時明顯抑制了PANC-1細胞吸收葡萄糖和分泌乳酸的能力(圖3B)。通過實時定量PCR的方法發(fā)現(xiàn)，糖酵解效應(yīng)中4個關(guān)鍵基因的表達也受到E-cadherin上調(diào)的影響而明顯下調(diào)(圖3C)。實驗結(jié)果顯示，E-cadherin是一種影響代謝的負向調(diào)控因子。

2.4 代謝關(guān)鍵調(diào)控分子SIRT3影響E-cadherin的表達

SIRT3被認為是一種腫瘤抑制因子，且可以通過抑制糖酵解效應(yīng)而抑制腫瘤的惡性生物學(xué)行為［7］。因此，本研究在細胞內(nèi)使SIRT3過表達進而觀察E-cadherin表達的變化。結(jié)果顯示，通過慢病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染過表達SIRT3后，可以顯著上調(diào)E-cadherin水平，以及抑制β-catenin在細胞核內(nèi)的聚集(圖4A～C)。進一步的研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β刺激和β-catenin表達顯著減少也可以負向調(diào)控SIRT3的表達(圖4D、E)。

綜上，TGF-β、E-cadherin、β-catenin和SIRT3形成一個反饋回路，介導(dǎo)了胰腺腫瘤細胞侵襲轉(zhuǎn)移和糖代謝模式轉(zhuǎn)化之間的調(diào)控(圖4F)。

圖2 敲減β-catenin的基因抑制PANC-1細胞代謝葡萄糖的能力Fig. 2 Knock-down the gene of β-catenin inhibited glucose utilization in PANC-1 cells

圖3 過表達E-cadherin可以抑制PANC-1細胞糖酵解代謝葡萄糖的能力Fig. 3 Over-expression of E-cadherin inhibited glycolysis in PANC-1 cells

圖4 代謝關(guān)鍵調(diào)控分子SIRT3影響E-cadherin的表達Fig. 4 Key metabolism regulator SIRT3 influences E-cadherin expression

3 討 論

腫瘤細胞通過不斷地消耗營養(yǎng)物質(zhì)來維持惡性增殖和侵襲轉(zhuǎn)移所需要的能量和物質(zhì)［8］。腫瘤細胞所處的乏氧、乏血供的環(huán)境限制了其獲得能量和物質(zhì)的來源，因此，腫瘤細胞采用了代謝模式轉(zhuǎn)化的方式來適應(yīng)這種不利環(huán)境，其中尤為重要的是腫瘤細胞對葡萄糖代謝模式的轉(zhuǎn)化。在乏氧環(huán)境下，腫瘤細胞通過糖酵解的模式代謝葡萄糖，為其惡性生物學(xué)行為提供ATP，以及提供用于合成其它生物大分子的物質(zhì)。同時，以糖酵解為主的葡萄糖代謝模式會伴隨有乳酸的生成，造成腫瘤細胞周圍的酸性環(huán)境，進而導(dǎo)致細胞基質(zhì)的不穩(wěn)定性和降解，為腫瘤細胞的惡性侵襲轉(zhuǎn)移提供條件［9］。因此可以推斷，腫瘤細胞代謝與其惡性侵襲轉(zhuǎn)移的能力之間存在著一定的聯(lián)系，研究腫瘤代謝模式轉(zhuǎn)化與其惡性侵襲轉(zhuǎn)移行為之間的關(guān)系有助于通過干預(yù)代謝的手段來影響腫瘤的惡性潛能。

在乳腺癌發(fā)生EMT轉(zhuǎn)化而引起侵襲轉(zhuǎn)移的過程中，其代謝模式發(fā)生了明顯的改變，下調(diào)糖異生途徑的限速酶果糖-1,6-二磷酸酶(FBP1)促進高度侵襲轉(zhuǎn)移的乳腺癌細胞獲得代謝優(yōu)勢而更容易維持其惡性潛能［5,10］。同樣，在腎透明細胞癌中，F(xiàn)BP1作為腫瘤抑制因子，通過抑制腫瘤細胞的代謝而影響了腎透明細胞癌的惡性潛能。

本研究發(fā)現(xiàn)，在胰腺癌細胞PANC-1中，通過TGF-β誘導(dǎo)EMT引起E-cadherin下調(diào)，可以明顯促進PANC-1細胞糖酵解的能力，同時在PANC-1細胞中過表達E-cadherin后，可以抑制腫瘤細胞代謝葡萄糖的能力。HIF1α和c-myc是腫瘤細胞代謝的關(guān)鍵性調(diào)控分子，通過調(diào)控代謝途徑中的關(guān)鍵酶而影響腫瘤細胞代謝模式的轉(zhuǎn)化［11］。本研究結(jié)果提示，TGF-β刺激以及細胞內(nèi)過表達E-cadherin均可以引起HIF1α和c-myc的改變。本研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β以及E-cadherin的過表達可以改變SIRT3的蛋白水平，而SIRT3又可以反饋性地引起E-cadherin以及其共軛分子β-catenin的改變。

綜上所述，本研究結(jié)果報道了胰腺癌細胞中E-cadherin與腫瘤細胞代謝模式轉(zhuǎn)化之間的關(guān)系，β-catenin以及SIRT3作為關(guān)鍵性的調(diào)控分子參與了該生理過程。這些結(jié)果為后續(xù)研究腫瘤細胞侵襲轉(zhuǎn)移與糖代謝之間的關(guān)系提供了重要的理論線索，同時為通過改變腫瘤細胞的代謝模式而調(diào)控侵襲轉(zhuǎn)移潛能提供了依據(jù)。

［1］ TSAI J H, YANG J. Epithelial-mesenchymal plasticity in carcinoma metastasis ［J］. Genes Dev, 2013, 27(20): 2192-2206.

［2］ KANG Y, MASSAGUE J. Epithelial-mesenchymal transitions: Twist in development and metastasis ［J］. Cell, 2004, 118(3): 277-279.

［3］ THIERY J P, ACLOQUE H, HUANG R Y, et al. Epithelialmesenchymal transitions in development and disease ［J］. Cell, 2009, 139(5): 871-890.

［4］ TEICHER B A, LINEHAN W M, HELMAN L J. Targeting cancer metabolism ［J］. Clin Cancer Res, 2012, 18(20): 5537-5545.

［5］ DONG C, YUAN T, WU Y, et al. Loss of fbp1 by snailmediated repression provides metabolic advantages in basallike breast cancer ［J］. Cancer Cell, 2013, 23(3): 316-331.

［6］ ORSULIC S, HUBER O, ABERLE H, et al. E-cadherin binding prevents beta-catenin nuclear localization and betacatenin/lef-1-mediated transactivation ［J］. J Cell Sci, 1999, 112: 1237-1245.

［7］ FINLEY L W, CARRACEDO A, LEE J, et al. Sirt3 opposes reprogramming of cancer cell metabolism through hif1alpha destabilization ［J］. Cancer Cell, 2011, 19(3): 416-428.

［8］ CAIRNS R A, HARRIS I S, MAK T W. Regulation of cancer cell metabolism ［J］. Nat Rev Cancer, 2011, 11(2): 85-95.

［9］ DANG C V. Links between metabolism and cancer ［J］. Genes Dev, 2012, 26(9): 877-890.

［10］ SCHIEBER M S, CHANDEL N S. Ros links glucose metabolism to breast cancer stem cell and emt phenotype［J］. Cancer Cell, 2013, 23(3): 265-267.

［11］ KEITH B, JOHNSON R S, SIMON M C. Hif1alpha and hif2alpha: Sibling rivalry in hypoxic tumour growth and progression ［J］. Nat Rev Cancer, 2012, 12(1): 9-22.

The influence of E-cadherin/β-catenin on the glycolysis effect in PANC-1 cells

QIN Yi, LIANG Dingkong, SHI Si, JI Shunrong, ZHANG Bo, XU Wenyan, LIU Jiang, XU Jin, NI Quanxing, YU Xianjun (Department of Pancreas and Hepatobiliary Surgery, Pancreas Cancer Institute, Fudan University Shanghai Cancer Center; Department of Oncology, Shanghai Medical College, Fudan University, Shanghai 200032, China)

YU Xianjun E-mail: yuxianjun@fudanpci.org

Background and purpose:Lower expression of E-cadherin is associated with metastasis of cancer cells, however, the correlation between E-cadherin and glucose metabolism has seldom been reported. This article studied the correlation between E-cadherin and glycolysis effect in PANC-1 cells.Methods:Through treatment of transforming growth factor β (TGF-β) in PANC-1 cells to decrease E-cadherin expression, knock-down the gene of E-cadherin interaction protein β-catenin, and overexpressing of E-cadherin, the effects of E-cadherin on the glucose uptake and lactate production ability and on the expression of key glycolytic genes were assessed.Results:E-cadherin negatively regulated the glycolytic effect of PANC-1 cells by inhibiting glucose uptake and lactate production (P＜0.05). Moreover, E-cadherin interacting partner β-catenin signifcantly promoted glucose metabolism transformation in PANC-1 cells (P＜0.05). Moreover, key glycolysis regulator sirtuin 3 (SIRT3) could lower E-cadherin expression.Conclusion:Lower expression of E-cadherin induced the transformation of glucose metabolism transformation in PANC-1 cells and manipulation of E-cadherin expression level could change the glycolysis effect. Moreover, through maneuver glycolysis process could inhibit high metastatic potential of pancreatic cancer cells.

E-cadherin; β-catenin; Sirtuin3; Glycolysis

10.3969/j.issn.1007-3969.2015.02.001

R735.9

A

1007-3639(2015)02-0081-06

2014-11-15

2015-01-10）

國家自然科學(xué)基金(81372651)。

虞先濬 E-mail:yuxianjun@fudanpci.org