沙洋縣人民醫(yī)院外三科，湖北 荊門 448200

長(zhǎng)鏈非編碼RNA-H19促小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株A549 上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化及侵襲

黃時(shí)軍，楊 軍，孫 輝

沙洋縣人民醫(yī)院外三科，湖北 荊門 448200

背景與目的：近年來研究發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)可能在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著重要作用，其中H19在膀胱癌、胃癌、肝細(xì)胞癌等多種腫瘤中呈現(xiàn)異常過表達(dá)，并且能夠促進(jìn)腫瘤增殖，增加腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲能力等。但H19在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)及功能尚不十分清楚。本研究擬觀察H19對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株A549增殖、上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)及侵襲能力的影響。方法：在A549中通過轉(zhuǎn)染質(zhì)粒使H19過表達(dá)，通過細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(cell counting kit-8，CCK-8)檢測(cè)H19過表達(dá)對(duì)A549細(xì)胞增殖能力的影響，通過Transwell檢測(cè)其對(duì)A549細(xì)胞侵襲能力的影響，通過光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化，通過蛋白［質(zhì)］印跡法(Western blot)檢測(cè)EMT相關(guān)蛋白的變化，通過熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)CDH1基因啟動(dòng)子活性的變化。結(jié)果：在A549中H19過表達(dá)后，細(xì)胞增殖能力有所增強(qiáng)(空白對(duì)照組D值為1.64±0.02，陰性對(duì)照組為1.59±0.04，過表達(dá)H19組為1.89±0.02，P<0.05)，細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)［陰性對(duì)照組(30±6)個(gè)/視野，過表達(dá)H19組(110±7)個(gè)/視野，P<0.05)］，細(xì)胞發(fā)生偽足變長(zhǎng)增多、細(xì)胞間隙增大等EMT特征的形態(tài)學(xué)變化，同時(shí)蛋白水平CDH1表達(dá)降低，而VIM及SNAI2的表達(dá)升高，伴有CDH1基因啟動(dòng)子活性下降60%以上(P<0.05)。結(jié)論：在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株A549中H19過表達(dá)可誘使其發(fā)生EMT，并促進(jìn)其增殖及侵襲能力。

長(zhǎng)鏈非編碼RNA；H19；非小細(xì)胞肺癌；侵襲；上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化

長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是一類轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)度超過200 nt的RNA，其本身并不轉(zhuǎn)錄編碼成為蛋白質(zhì)，但可以多種形式參與調(diào)控基因的表達(dá)。H19是一個(gè)編碼2.3 kb的lncRNA，在哺乳動(dòng)物中序列高度保守，也是最早被人們所認(rèn)識(shí)的lncRNA之一。既往研究證實(shí)H19在胚胎發(fā)育中發(fā)揮重要作用，并在膀胱癌、胃癌、肝細(xì)胞癌等多種腫瘤中表達(dá)異常，參與腫瘤的增殖及侵襲轉(zhuǎn)移等。但H19在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)及功能尚不清楚。本文旨在研究H19對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株A549 增殖、發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)及侵襲能力的影響。

1 材料和方法

1.1細(xì)胞及培養(yǎng)

人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株A549由本實(shí)驗(yàn)室既往保存，培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基(武漢博士德生物工程有限公司)中，置于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的溫箱內(nèi)培養(yǎng)。

1.2 主要試劑

抗CDH1、N-cadherin、VIM、SNAI1、SNAI2、ZEB1及GAPDH抗體均購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司，預(yù)鋪好Matrigel基質(zhì)膠的Transwell(8 μm孔徑)等其他耗材均購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司。

1.3 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction，RTFQ-PCR)檢測(cè)H19過表達(dá)質(zhì)粒的效應(yīng)

P C R引物由深圳華大基因科技服務(wù)有限公司設(shè)計(jì)并合成。H19引物順義鏈為5’-GCCTTGACGTGCTGGATCT-3’，反義鏈為5’-TCCGATGCTTTACTCAAGAAGTT-3’；U6引物順義鏈為5’-GACGGACACCCTCACTA CTG-3’，反義鏈為5’-GACGTTCATGATTCAAG CATGC-3’。

利用LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑常規(guī)轉(zhuǎn)染H19過表達(dá)質(zhì)粒后，收集A549細(xì)胞。通過TRIzol一步法提取總RNA，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Fermentas，No.K1633，武漢博士德生物工程有限公司)操作說明合成cDNA，之后應(yīng)用上述引物按RTFQ-PCR試劑盒(Fermentas)說明書進(jìn)行PCR擴(kuò)增，采用ABI7300檢測(cè)并分析。

1.4 CCK-8增殖實(shí)驗(yàn)

收集轉(zhuǎn)染后的各組A549細(xì)胞，以每孔1×103個(gè)的細(xì)胞密度接種于96孔板中，在培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)24、48及72 h。按上述時(shí)間點(diǎn)加入終濃度為10%的CCK-8試劑(武漢啟動(dòng)子生物有限公司)，避光放置1 h后用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm波長(zhǎng)下的吸光度(D)值。

1.5 侵襲能力實(shí)驗(yàn)

收集轉(zhuǎn)染后的各組A549細(xì)胞，用無血清RPMI-1640培養(yǎng)基重懸，以每孔5×104個(gè)的細(xì)胞密度加入到預(yù)鋪好Matrigel基質(zhì)膠的Transwell小室的上室內(nèi)，下室加入600 mL完全培養(yǎng)液，培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)24 h取出上室，用4%多聚甲醛處理后用0.01%結(jié)晶紫染色，于200倍光學(xué)顯微鏡下計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)，隨即取5個(gè)視野，取平均值。每組實(shí)驗(yàn)設(shè)3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

采用普通光學(xué)顯微鏡觀察H19過表達(dá)的A549細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化。

1.7 蛋白［質(zhì)］印跡法(Western blot)檢測(cè)

收集細(xì)胞，加入適量RIPA裂解獲取細(xì)胞總蛋白液，加入適量SDS上樣緩沖液于100 ℃水浴解交聯(lián)。蛋白樣品行聚丙烯酰胺凝膠電泳，PVDF膜轉(zhuǎn)膜并用脫脂奶粉封閉非特異性結(jié)合，然后依次溫育一抗及二抗后，用化學(xué)發(fā)光法顯影，檢測(cè)過表達(dá)H19后A549細(xì)胞中CDH1、N-cadherin、VIM、SNAI1、SNAI2及ZEB1等EMT相關(guān)蛋白水平的變化。

1.8 熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)

將A549細(xì)胞以每孔1×105個(gè)細(xì)胞的密度接種于24孔板中，第2天當(dāng)約70%的細(xì)胞融合時(shí)，利用LipofectamineTM2000共轉(zhuǎn)染(含有CDH1啟動(dòng)子的熒光素酶質(zhì)粒和H19表達(dá)質(zhì)粒)細(xì)胞，常規(guī)培養(yǎng)48 h后，按照雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒(Promega)在多功能光度計(jì)上測(cè)定并分析過表達(dá)H19后A549細(xì)胞中CDH1啟動(dòng)子活性的變化。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 12.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以χ±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 轉(zhuǎn)染H19質(zhì)粒在A549細(xì)胞中成功過表達(dá)

轉(zhuǎn)染H19質(zhì)粒后，通過RTFQ-PCR檢測(cè)A549細(xì)胞中H19的表達(dá)。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染質(zhì)粒后H19的表達(dá)較對(duì)照組升高20倍，驗(yàn)證了H19質(zhì)?？沙晒^表達(dá)H19(P<0.05，圖1)。

圖1 H19過表達(dá)質(zhì)粒在A549細(xì)胞中成功表達(dá)Fig. 1 H19 was successfully overexpressed in A549 cells

2.2 H19可促進(jìn)A549的增殖能力

轉(zhuǎn)染H19及對(duì)照空質(zhì)粒(Vector)后，將細(xì)胞接種于按照上述方法檢測(cè)A549細(xì)胞的增殖能力。結(jié)果顯示，接種72 h后，過表達(dá)H19的細(xì)胞增殖能力有所增強(qiáng)：空白對(duì)照組D值為1.64±0.02，陰性對(duì)照組為1.59±0.04，H19過表達(dá)組為1.89±0.02。差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖2)。

圖2 過表達(dá)H19促進(jìn)A549細(xì)胞增殖Fig. 2 H19 enhanced the proliferation of A549 cells

2.3 H19可促進(jìn)A549的侵襲能力

轉(zhuǎn)染H19及對(duì)照空質(zhì)粒(Vector)后按照上述方法檢測(cè)A549細(xì)胞的侵襲能力。結(jié)果提示，過表達(dá)H19后穿膜細(xì)胞數(shù)為(110±7)個(gè)/視野，較陰性對(duì)照組的(30±6)個(gè)/視野顯著增加。差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖2)。

2.4 H19誘導(dǎo)A549細(xì)胞發(fā)生形態(tài)學(xué)變化

采用普通光學(xué)顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染H19質(zhì)粒24 h后細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照質(zhì)粒組及空白對(duì)照組相比，A549細(xì)胞H19過表達(dá)組發(fā)生明顯的EMT變化，如細(xì)胞變長(zhǎng)呈梭形，偽足變長(zhǎng)增多，細(xì)胞間隙增大等(圖3)。

圖3 H19促進(jìn)A549侵襲能力Fig. 3 H19 enhanced the invasion of A549 cells

2.5 H19影響EMT相關(guān)蛋白的表達(dá)

將細(xì)胞裂解提取總蛋白后行Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)H19后上皮性標(biāo)志CDH1蛋白表達(dá)明顯減少，相對(duì)應(yīng)的是間質(zhì)性標(biāo)志N-cadherin及VIM的表達(dá)明顯增加。本研究同時(shí)檢測(cè)了與EMT相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，其中SNAI2的表達(dá)明顯增加，而SNAI1及ZEB1的表達(dá)無明顯變化(圖4)。

2.6 H19對(duì)CDH1基因啟動(dòng)子活性的影響

轉(zhuǎn)染H19過表達(dá)質(zhì)粒及CDH1基因啟動(dòng)子質(zhì)粒后檢測(cè)其熒光素酶活性。結(jié)果如圖5所示，H19對(duì)CDH1基因啟動(dòng)子活性具有明顯的抑制作用，熒光素酶活性下降60%以上。差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖4 H19誘導(dǎo)A549發(fā)生形態(tài)學(xué)改變Fig. 4 H19 induced the cell morphology changes of A549 cells

圖5 H19促進(jìn)EMT相關(guān)蛋白變化Fig. 5 H19 induced the EMT process of A549 cells

圖6 H19抑制CDH1啟動(dòng)子活性Fig. 6 H19 depressed the promoter activity of CDH1

3 討 論

隨著人類基因組計(jì)劃的完成，人們發(fā)現(xiàn)基因組中除了約20 000個(gè)蛋白編碼基因(只占全基因組的2%左右)，同時(shí)還含有大量的非編碼RNAs(non-coding RNAs，ncRNAs)［1］。ncRNAs可以通過表觀遺傳學(xué)修飾、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、蛋白質(zhì)翻譯、蛋白質(zhì)降解等多種機(jī)制參與、影響細(xì)胞的生物學(xué)進(jìn)程，其中針對(duì)microRNA(微RNA)功能的研究已經(jīng)取得了很多成果，但對(duì)lncRNA的研究尚在起步階段［1-3］。

H19作為一個(gè)具有反式轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能的lncRNA，最初在胚胎發(fā)育相關(guān)研究中被發(fā)現(xiàn)，引起了人們的興趣［4］。近年來，一系列的研究發(fā)現(xiàn)，H19在膀胱癌、胃癌、肝細(xì)胞癌等多種腫瘤中呈現(xiàn)異常的過表達(dá)，而且在多個(gè)體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，H19過表達(dá)促進(jìn)腫瘤的增殖，增加腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力，減低對(duì)化療藥物的敏感性，提示H19在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中扮演重要的角色。但H19在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)及功能尚不十分清楚［5-7］。

本研究在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株A549中，通過轉(zhuǎn)染質(zhì)粒使H19過表達(dá)，觀察并驗(yàn)證了H19的功能。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，H19過表達(dá)的細(xì)胞增殖能力有所增強(qiáng)。進(jìn)而我們通過預(yù)鋪好Matrigel基質(zhì)膠的Transwell小室模擬腫瘤轉(zhuǎn)移時(shí)需要穿透的組織細(xì)胞基底膜，結(jié)果顯示，H19過表達(dá)可增加A549細(xì)胞的穿膜個(gè)數(shù)，即H19過表達(dá)促進(jìn)了A549細(xì)胞的侵襲能力。本研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，A549過表達(dá)H19后細(xì)胞從橢圓形變成長(zhǎng)梭形，偽足增多變長(zhǎng)，細(xì)胞間隙也相應(yīng)變大，而這些形態(tài)學(xué)改變是EMT的特征表現(xiàn)。EMT作為一種復(fù)雜而且重要的生物學(xué)效應(yīng)，廣泛參與到多種病理生理進(jìn)程，包括惡性腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移［1,4］。腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT后，細(xì)胞的極性消失，運(yùn)動(dòng)及侵襲能力增加，從側(cè)面解釋H19過表達(dá)對(duì)A549細(xì)胞侵襲能力的促進(jìn)作用。為了證實(shí)H19通過使細(xì)胞發(fā)生EMT從而促進(jìn)細(xì)胞的侵襲能力，本研究采用Western blot檢測(cè)H19對(duì)細(xì)胞中EMT相關(guān)蛋白如CDH1、N-cadherin及VIM等水平的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，上皮標(biāo)志CDH1表達(dá)降低，間質(zhì)標(biāo)志N-cadherin及VIM表達(dá)增高，而作為調(diào)控EMT的重要轉(zhuǎn)錄因子之一的SNAI2的表達(dá)也明顯增加，提示H19可能通過調(diào)控SNAI2進(jìn)而促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞EMT及侵襲。

綜上所述，在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株A549中H19過表達(dá)可誘使其發(fā)生EMT，并促進(jìn)其侵襲能力的升高，在H19過表達(dá)后EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子SNAI2的表達(dá)明顯升高，提示SNAI2可能參與H19介導(dǎo)的EMT變化。但H19調(diào)控SNAI2的具體分子機(jī)制尚待闡明。本文提示H19可能參與非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生、發(fā)展，為非小細(xì)胞肺癌的臨床治療提供了新的藥物靶點(diǎn)及監(jiān)測(cè)指標(biāo)。

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lncRNA-H19 induces epithelial-mesenchymal transition and enhances the invasion of non-small cell lung cancer cells

HUANG Shijun, YANG Jun, SUN Hui (Third Department of Surgery, People’s Hospital of Shayang County, Jinmen 448200, Hubei Province, China)

SUN Hui E-mail: 859338010@qq.com

Background and purpose:In recent years, the studies have indicated that long non-coding RNAs (lncRNAs) may play important roles in the initial stage and development of tumors. H19 is one of those lncRNAs, which is already proved to overexpress in a variety of tumors such as bladder cancer, stomach cancer and hepatocellular carcinoma (HCC). And H19 also could promote tumor proliferation and increase tumor cell migration and invasion ability, but neither the expression nor the function of H19 in non-small cell lung cancer(NSCLC) are clarified. This study aimed to observe the effects of H19 on the proliferation, epithelial-mesenchymal transition (EMT) and invasion ability of NSCLC cell line A549.Methods:H19 was overexpressed by plasmids transfection, then the effect of H19 on the proliferation of A549 was measured by cell counting kit-8(CCK-8), the invasion of A549 cells was detected by Transwell assay, and the changes of cell morphology were observed with an optical microscope, and the expression of EMT-related proteins was detected by Western blot, and the promoter activity of CDH1 was measured by luciferase assay.Results:The proliferation of A549 cells was increased under the overexpression of H19(D value in blank group was 1.64±0.02, in negative control group was 1.59±0.04, in overexpression of H19 group 1.89±0.02, P<0.05), the invasion ability of A549 cells was dramatically enhanced [negative control group (30±6)/vision, overexpression of H19 group (110±7)/vision, P<0.05], and the A549 cells developed longer pseudopodia and had wider intercellular spaces. All these morphology changes indicated that the cells were undergoing the process of EMT, and meantime, the expres-sion of CDH1 was decreased, along with the expression of VIM and SNAI2 elevated, which were also related to the progression of EMT, and H19 also could depress the promoter activity of CDH1 by 60% (P<0.05).Conclusion:The overexpression of H19 induces the EMT, and enhances the proliferation and invasion ability of A549 cells.

Long non-coding RNA; H19; Non-small cell lung cancer; Invasion; Epithelial-mesenchymal transition

10.3969/j.issn.1007-3969.2015.12.004

R734.2

A

1007-3639(2015)12-0940-05

2014-07-08

2015-02-08）

孫 輝 E-mail:859338010@qq.com