李媛媛，王紅艷，吳曉燕，宋瑞卉，李敬

1.濰坊醫(yī)學(xué)院形態(tài)學(xué)實驗室，山東 濰坊261053；

2.濰坊醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)教研室，山東 濰坊261053；

3.山東省高校免疫學(xué)重點實驗室，山東 濰坊261053；

4.濰坊醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，山東 濰坊261053

顆粒蛋白前體調(diào)控胃癌細胞增殖與衰老的效應(yīng)研究

李媛媛1，王紅艷2,3，吳曉燕2，宋瑞卉1，李敬4

1.濰坊醫(yī)學(xué)院形態(tài)學(xué)實驗室，山東 濰坊261053；

2.濰坊醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)教研室，山東 濰坊261053；

3.山東省高校免疫學(xué)重點實驗室，山東 濰坊261053；

4.濰坊醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，山東 濰坊261053

背景與目的：顆粒蛋白前體(progranulin，PGRN)是一種新型生長因子，在細胞遷移、細胞周期進展及腫瘤形成過程中發(fā)揮著重要作用。PGRN在多種惡性腫瘤細胞中高表達，不僅參與腫瘤的生長過程，還與腫瘤的發(fā)生、演變過程關(guān)系密切。本研究旨在探討PGRN在胃癌組織中的表達，及其對胃癌BGC823細胞增殖與衰老的影響。方法：利用免疫組化方法檢測胃癌組織及癌旁組織中PGRN的表達；利用實時定量聚合酶鏈反應(yīng)(quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR)干擾胃癌細胞株BGC823中PGRN的表達；通過四甲基偶氮唑鹽(MTT)法、細胞克隆形成和細胞衰老檢測實驗，探討PGRN對BGC823細胞增殖與衰老的影響。結(jié)果：PGRN在胃癌組織中高表達。PGRN表達降低后，胃癌細胞的增殖與克隆形成能力均顯著降低。PGRN-siRNA細胞的克隆形成率為(25.3±3.1)%，對照組細胞的克隆形成率為(72.1±5.7)%，正常組細胞的克隆形成率為(80.3±4.0)%。兩兩比較，對照組與正常組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，實驗組與其他兩組間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均＜0.05)。干擾PGRN表達能夠明顯促進BGC823細胞衰老。PGRN-siRNA細胞衰老陽性率為(27.6±2.1)%，對照組細胞衰老陽性率為(3.2±1.3)%，正常組細胞衰老陽性率為(1.9±1.2)%。兩兩比較，對照組與正常組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，實驗組與其他兩組間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均＜0.05)。結(jié)論：PGRN可作為新的胃癌標(biāo)志物，為臨床胃癌的靶向治療提供新的思路。

胃腫瘤；顆粒蛋白前體；siRNA；細胞衰老

胃癌是嚴(yán)重危害人類健康的常見惡性腫瘤，發(fā)病率高且預(yù)后差。近年來隨著人們對惡性腫瘤病因及發(fā)病機制等方面的研究，胃癌和其他惡性腫瘤一樣被認(rèn)為是一種基因性疾病，胃癌的發(fā)生、演變與多種癌基因的異常表達有關(guān)［1-2］。因此，研究胃癌相關(guān)基因?qū)τ诮沂疚赴┑陌l(fā)病機制與探討有效的防治方法具有重要意義。

顆粒蛋白前體(progranulin，PGRN)是一種獨立的、新型生長因子，在體內(nèi)大部分組織和器官中表達，對調(diào)節(jié)機體的生長發(fā)育及修復(fù)損傷等過程起著重要作用。目前，多項研究表明，PGRN在多種惡性腫瘤中高表達，如宮頸癌、乳腺癌和膠質(zhì)母細胞瘤等［3-5］。在動物實驗中，通過降低PGRN mRNA的表達可以明顯降低腫瘤形成的風(fēng)險［6］，然而關(guān)于PGRN在胃癌中的表達及生物學(xué)意義鮮有報道。

細胞衰老是指細胞處于不可逆的周期停滯狀態(tài)，但在相當(dāng)長一段時間內(nèi)依然保持代謝活性，典型特征是β-半乳糖苷酶染色呈陽性。本研究通過檢測PGRN在胃癌組織中的表達及對胃癌細胞增殖與衰老的影響，為胃癌的臨床靶向治療提供新的實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 臨床資料

臨床標(biāo)本取自濰坊醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院經(jīng)外科手術(shù)切除的胃癌及癌旁組織各50例，標(biāo)本均經(jīng)病理確診。

1.2 材料和試劑

山羊抗人PGRN單克隆抗體購自美國Santa Cruz公司；細胞轉(zhuǎn)染試劑LipofectimineTM2000購自美國Invitrogen公司；實時定量聚合酶鏈反應(yīng)(quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR)檢測試劑盒購自立陶宛Fermentas公司，PCR試劑購自寶生物工程(大連)有限公司，衰老檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清等細胞培養(yǎng)產(chǎn)品購自美國Gibco公司。PGRN siRNA序列5’-r(GGCCACUCCUGCAUCUUUA)dTdT-3’及對照組siRNA序列由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成。PGRN引物順義鏈：5’-GGACAGTACTGAAGACTCTG-3’；反義鏈：5’-GGATGGCAGCTTGTAATGTG-3’。內(nèi)參β-actin引物順義鏈：5’-AGTTGCGTTACACCCTTTCTTG-3’；反義鏈：5’-CACCTTCACCGTTCCAGTTTT-3’。所有引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.3 方法

1.3.1 免疫組化

胃癌及癌旁組織標(biāo)本經(jīng)固定、脫水、透明、包埋處理后切片，按照PGRN檢測試劑盒說明書，采用山羊超敏二步法進行免疫組化染色，PBS替代一抗作為陰性對照，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，脫水，透明，封片。結(jié)果判斷：以細胞質(zhì)中出現(xiàn)棕黃色顆粒為PGRN陽性表達，高倍鏡下每張切片隨機選取10個視野，計數(shù)PGRN陽性細胞數(shù)，根據(jù)其平均數(shù)求PGRN陽性表達率。

1.3.2 細胞培養(yǎng)

人胃癌細胞株BGC823置于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的恒溫培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)；培養(yǎng)基為含10%胎牛血清的改良型RPMI-1640。

1.3.3 siRNA轉(zhuǎn)染［7］及轉(zhuǎn)染細胞株的建立

選取對數(shù)生長期細胞，經(jīng)胰酶消化，接種于6孔細胞培養(yǎng)板中，每孔細胞數(shù)為1×105個，當(dāng)細胞融合度達50%時開始轉(zhuǎn)染。步驟如下：每孔取5 μL siRNA溶于250 μL OPTI-MEM中，混勻常溫放置5 min；取5 μL LipofectamineTM2000溶于250 μL OPTI-MEM中，混勻常溫放置5 min；然后將兩種混合液混勻，常溫放置15 min，加入培養(yǎng)板，轉(zhuǎn)染后置于培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)72 h。轉(zhuǎn)染細胞株分別為對照組細胞和實驗組PGRN-siRNA細胞。

1.3.4 利用qRT-PCR檢測RNA干擾效果

收集正常細胞、對照組細胞和實驗組PGRN-siRNA細胞，利用TRIzol試劑提取總RNA，具體步驟按說明書進行操作，提取完測定濃度，置于-80 ℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆茫焕锰崛〉腞NA合成cDNA；用qRT-PCR儀進行擴增，反應(yīng)條件為：94 ℃ 5 min，94 ℃ 40 s，55 ℃ 40 s，72 ℃ 60 s，共30個循環(huán)；72 ℃6 min終止反應(yīng)。擴增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色，紫外透射儀觀察。

1.3.5 BGC823細胞增殖活性檢測

將正常細胞組、對照組細胞和實驗組PGRN-siRNA細胞接種于96孔板中，分別培養(yǎng)72 h；加入四甲基偶氮唑鹽(MTT)繼續(xù)培養(yǎng)4 h，加入DMSO室溫?fù)u床震蕩10 min，檢測570 nm吸光度(D)值，實驗重復(fù)3次。

1.3.6 BGC823細胞克隆形成能力的檢測［8］

將正常組、對照組和實驗組PGRN-siRNA細胞常規(guī)培養(yǎng)72 h；無菌PBS沖洗，胰酶消化，將細胞懸液做梯度倍數(shù)稀釋，計數(shù)；取300個細胞接種于6孔板中，分散均勻，各做3復(fù)孔；放置于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2周；當(dāng)6孔板中出現(xiàn)肉眼可見的克隆時，終止培養(yǎng)；吸出培養(yǎng)基，PBS洗滌1次，每孔加入500 μL甲醇固定5 min；吸出固定液，PBS洗滌，加適量吉姆薩染液染色10 min；PBS洗滌、干燥，低倍鏡下計數(shù)＞50個細胞的克隆數(shù)，計算克隆形成率。克隆形成率=克隆數(shù)/接種細胞數(shù)×100%。

1.3.7 BGC823細胞衰老檢測［9］

應(yīng)用β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)染色法，步驟如下：將正常、對照組和實驗組PGRN-siRNA細胞常規(guī)培養(yǎng)72 h；吸出6孔板中的培養(yǎng)基，PBS洗滌1次；每孔加入固定液1 mL，室溫固定15 min；再吸出固定液，PBS洗滌3次；吸出PBS，每孔加入1 mL現(xiàn)配置的染色工作液；保鮮膜封住培養(yǎng)板，在37 ℃普通溫箱中溫育過夜；光學(xué)顯微鏡隨機選取1 000個細胞，計數(shù)衰老細胞所占細胞百分比。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進行結(jié)果分析，實驗組與對照組間差異采用χ2或t檢驗，多樣本間比較采用SNK法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 PGRN在胃癌組織中的表達明顯高于癌旁組織

通過免疫組化染色方法檢測PGRN在胃癌及癌旁胃黏膜組織標(biāo)本中的表達。免疫組化染色結(jié)果顯示，在50例癌旁胃黏膜標(biāo)本中，PGRN陽性表達率為16.7%，在50例胃癌標(biāo)本中，PGRN陽性表達率為87.4%。兩者比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01，圖1)。

2.2 抑制PGRN表達導(dǎo)致BGC823細胞增殖能力與克隆形成能力均降低

通過干擾BGC823細胞PGRN后，利用MTT法和克隆形成實驗測定PGRN對細胞增殖的影響。結(jié)果顯示，實驗組PGRN-siRNA細胞與對照組細胞和正常細胞組比較，實驗組細胞中PGRN mRNA明顯低于其他兩組，細胞形態(tài)發(fā)生改變，PGRN受到抑制的BGC823細胞增殖能力和克隆形成能力均顯著降低，克隆形成數(shù)目減少，體積減小。PGRN-siRNA細胞的克隆形成率為(25.3±3.1)%，對照組細胞的克隆形成率為(72.1±5.7)%，正常組細胞的克隆形成率為(80.3±4.0)%。兩兩比較，對照組與正常組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。實驗組細胞與其他兩組間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均＜0.05，圖2、3)。

2.3 抑制PGRN表達導(dǎo)致BGC823細胞衰老程度增加

SA-β-gal是一種細胞衰老標(biāo)志物，細胞老化時，細胞內(nèi)會產(chǎn)生綠色沉淀。應(yīng)用SA-β-gal染色，實驗組細胞衰老程度和數(shù)量明顯增加，衰老陽性率為(27.6±2.1)%，對照組細胞衰老陽性率為(3.2±1.3)%，正常組細胞衰老陽性率為(1.9±1.2)%。兩兩比較，對照組與正常組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，實驗組與其他兩組間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均＜0.05，圖4)。 (DAB, ×100)

圖1 PGRN在胃癌及癌旁組織中的表達Fig. 1 Expression of PGRN in adjacent normal and cancerous gastric tissues

圖2 干擾PGRN表達對BGC823細胞形態(tài)的影響Fig. 2 Morphology changes with siRNA and control in BGC823 cells

圖3 干擾PGRN表達致BGC823細胞增殖和克隆形成減少Fig. 3 Inhibition of PGRN in BGC823 cells decreased the proliferation and clonogenic capacity

圖4 干擾PGRN表達致BGC823細胞衰老程度增加Fig. 4 Inhibition of PGRN in BGC823 cells promoted senescence

3 討 論

胃癌是當(dāng)今世界最常見的惡性腫瘤之一，病死率高，目前胃癌的發(fā)生機制仍不明確，尚無有效針對胃癌的治療手段。因此，探索新型的治療途徑，找到有效的治療方法勢在必行。

近年來，隨著分子生物學(xué)領(lǐng)域的快速發(fā)展，控制細胞生長和分化的許多標(biāo)志物被逐漸認(rèn)識。PGRN就是一種新型、分泌性生長因子，除在機體中調(diào)節(jié)各種上皮細胞的增殖外，還和惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲及預(yù)后息息相關(guān)。Pizarro等［10］研究發(fā)現(xiàn)，PGRN能夠促進腫瘤血管的生成與腫瘤細胞的侵襲。Han等［11］認(rèn)為，PGRN可作為一個獨立的晚期卵巢上皮細胞癌預(yù)后標(biāo)志物，這與Carlson等［12］的研究結(jié)果一致。Carlson等［12］曾報道在卵巢上皮細胞癌患者中，越高的PGRN導(dǎo)致患者的生存率越低。目前，對于PGRN作用機制的研究還非常少。Frampton等［13］認(rèn)為，PGRN是通過介導(dǎo)去乙?；?(sirtuin1，SIRT1)導(dǎo)致膽管增生和膽管癌細胞過度增殖。Swamydas等［14］則認(rèn)為是溶血磷脂酸(lysophosphatidic acid，LPA)激活PGRN引起ERK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的變化，促進乳腺癌細胞的侵襲。然而關(guān)于PGRN在胃癌中的表達及生物學(xué)意義卻極少報道。

本研究發(fā)現(xiàn)，PGRN在胃癌組織和胃癌細胞BGC823中亦存在高表達，通過siRNA干擾技術(shù)降低細胞中PGRN的表達，PGRN-siRNA細胞與正常細胞和對照組細胞比較，PGRN-siRNA細胞形態(tài)發(fā)生改變，細胞變的大而平，細胞內(nèi)顆粒明顯增多，對照組細胞未見明顯改變，細胞輪廓清晰、生長良好。通過檢測細胞的增殖與克隆形成能力，發(fā)現(xiàn)干擾PGRN表達后的BGC823細胞的增殖能力與克隆形成能力明顯降低，說明PGRN與胃癌細胞的增殖密切相關(guān)。為探討PGRN對BGC823細胞增殖影響的原因，本研究采用SA-β-gal染色法進一步檢測。SA-β-gal是一種細胞衰老標(biāo)志物，細胞衰老被認(rèn)為是一種程序性的細胞反應(yīng)，使細胞不可逆的分裂停滯。近年來的研究顯示，細胞衰老是一種抑制腫瘤發(fā)生、發(fā)展的重要方式［15］。細胞衰老可抑制腫瘤惡變，還可以增強化療藥物及腫瘤治療的療效［16-17］。在本研究中，實驗組與對照組和正常組細胞比較，衰老細胞程度和數(shù)量顯著增加，表明PGRN是BGC823細胞衰老過程中的重要調(diào)控因子，在BGC823細胞衰老發(fā)生過程中發(fā)揮著重要作用，通過衰老途徑可以影響胃癌細胞的增殖。當(dāng)前人們對細胞的衰老機制，以及細胞衰老在惡性腫瘤發(fā)生過程中的作用了解還很少，仍需進一步探索。

綜上所述，惡性腫瘤高表達PGRN與腫瘤發(fā)生、轉(zhuǎn)移和低生存率密切相關(guān)。PGRN可能是一個新的生物標(biāo)志物，是臨床胃癌治療的新的靶向目標(biāo)，對今后胃癌的診斷和臨床治療具有廣闊的應(yīng)用前景。

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Effects of progranulin on proliferation and senescence in gastric cancer cells

LI Yuanyuan1, WANG Hongyan2,3, WU Xiaoyan2, SONG Ruihui1, LI Jing4 (1.Department of Morphology, Weifang Medical University, Weifang Shandong 261053, China; 2.Department of Microbiology, Weifang Medical University, Weifang Shandong 261053, China; 3.Key Lab for Immunology in Universities of Shandong Province, Weifang Shandong 261053, China; 4.Basic Medical College, Weifang Medical University, Weifang Shandong 261053, China)

WANG Hongyan E-mail: sdwfwhy@163.com

Background and purpose:Progranulin (PGRN) is a novel growth factor that plays an important role in the tumorigenicity, tumor cell migration and cell cycle. Its expression in many malignant tumor cells is high. It is not only involved in tumor cell growth, but also closely related with the occurrence and evolution of tumor. This study was to investigate the expression of PGRN in gastric cancer and the effects on proliferation and senescence in gastric cancer cell line BGC823.Methods:Immunohistochemical method was used to detect the expression of PGRN in gastric cancer tissues and adjacent normal tissues; Quantitative real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR) was used to detect the expression of PGRN in PGRN-siRNA BGC823 cells; MTT method, cell colony formation and cell senescence experiments were used to explore the effects of PGRN on proliferation and senescence in BGC823cell.Results:PGRN protein levels were high in gastric cancer tissues; Knocking down the PGRN gene in BGC823 decreased the proliferation and clonogenic capacity, cloning effciency in PGRN-siRNA group was (25.3±3.1)%, in the control group was (72.1±5.7)%, and in the normal cells was (80.3±4.0)%, there was no signifcant difference between normal group and control group, but there were signifcant differences among PGRN-siRNA group and the other two groups (P＜0.05); Knocking down the PGRN gene in BGC823 cells could promote cell senescence. The positive rate of aging in PGRN-siRNA group was (27.6±2.1)%, in the control group was (3.2±1.3)%, and in the normal group was (1.9±1.2)%, there was no signifcant difference between normal group and control group. But there were signifcant differences among PGRN-siRNA group and the other two groups (P＜0.05).Conclusion:PGRN can be used as a new marker for gastric cancer, and provide new ideas to the treatment of gastric cancer.

Gastric neoplasms; Progranulin; siRNA; Cell senescence

10.3969/j.issn.1007-3969.2015.03.003

R735.2

A

1007-3639(2015)03-0173-06

2014-08-07

2014-11-10）

國家自然科學(xué)基金資助項目(81201262)；山東省醫(yī)藥衛(wèi)生科技發(fā)展計劃項目(2011HZ114)。

王紅艷 E-mail:sdwfwhy@163.com