平娟，趙娜，王保全，申智慧，陰明星，龐曉斌，陳傳波

1.河南大學(xué)淮河臨床學(xué)院，河南 開封475001；

2.鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院血液科，河南 鄭州 450009；

3.河南大學(xué)藥學(xué)院化學(xué)生物學(xué)實驗室，河南 開封 475004

人慢性粒細胞白血病bcr-abl基因反義寡核苷酸對K562細胞株的凋亡誘導(dǎo)作用研究

平娟1，趙娜2，王保全1，申智慧2，陰明星2，龐曉斌3，陳傳波1

1.河南大學(xué)淮河臨床學(xué)院，河南 開封475001；

2.鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院血液科，河南 鄭州 450009；

3.河南大學(xué)藥學(xué)院化學(xué)生物學(xué)實驗室，河南 開封 475004

背景與目的：隨著人類基因組計劃的完成，人們的研究重點已轉(zhuǎn)向基因功能的研究，反義核酸技術(shù)無疑為這項宏偉工程提供了一個新的發(fā)展方向。目前，國內(nèi)關(guān)于反義寡核苷酸誘導(dǎo)K562細胞凋亡的實驗研究很少。本實驗在體外構(gòu)建針對人慢性粒細胞白血病(chronic myelogenou leukemia，CML)bcr-abl融合基因mRNA的反義寡核苷酸，探討bcr-abl反義寡核苷酸對K562細胞凋亡的誘導(dǎo)作用。方法：以bcr-abl融合基因mRNA翻譯起始點融合前區(qū)19個寡核苷酸為作用靶點，設(shè)計反義寡核苷酸，以其反義寡核苷酸序列轉(zhuǎn)染人慢性粒細胞K562細胞，采用Hoechst染色法觀察不同濃度寡核苷酸對K562細胞株的凋亡情況，采用蛋白[質(zhì)]印跡法(Western blot)檢測自噬凋亡蛋白LC3-Ⅱ的表達情況，采用流式細胞術(shù)(flow cytometry，F(xiàn)CM)檢測細胞周期變化，采用JEM-4000EX電鏡術(shù)檢測細胞凋亡形態(tài)變化，通過DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測K562細胞凋亡情況。結(jié)果：Hoechst染色結(jié)果顯示，bcr-abl反義寡核苷酸能顯著促進K562細胞的凋亡，且呈現(xiàn)一定的濃度依賴性。Western blot檢測結(jié)果顯示，bcr-abl反義寡核苷酸各濃度組凋亡自噬蛋白LC3-Ⅱ表達水平明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。FCM檢測結(jié)果顯示，bcr-abl反義寡核苷酸作用于K562細胞后，細胞周期阻滯于G0/G1期。各組G0/G1期、S期細胞數(shù)量與對照組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。在JEM-4000EX電鏡下可見明顯的新月型凋亡小體。DNA瓊脂糖凝膠電泳顯示，10、30 μmol/mL bcr-abl反義寡核苷酸組可以明顯觀察到以180～200 bp堿基對整倍數(shù)出現(xiàn)明暗間隔的DNA梯狀條帶。結(jié)論：Bcr-abl反義寡核苷酸可顯著誘導(dǎo)K562細胞凋亡，為臨床上基因治療人CML提供一定的參考。

人慢性粒細胞白血病；Bcr-abl基因；反義寡核苷酸；K562細胞；凋亡誘導(dǎo)

慢性粒細胞白血病(chronic myelogenou leukemia，CML)是特征性bcr-abl融合基因分子生物學(xué)遺傳異常行為，其編碼的bcr-abl融合蛋白可持續(xù)誘導(dǎo)多條細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的異常激活，最終導(dǎo)致CML的發(fā)生［1-2］，由于CML特定的分子遺傳學(xué)特征，是理想的分子靶向治療模型。目前臨床上有很多治療CML的藥物及方法，如酪氨酸激酶抑制劑可誘導(dǎo)90%以上患者血液學(xué)完全緩解，但部分患者會出現(xiàn)耐藥，第二代酪氨酸激酶抑制劑(如達沙替尼和尼洛替尼等)雖然能抑制大部分激酶活性，但對個別激酶突變體無效，造血干細胞移植雖然是目前唯一徹底治愈CML的主要手段，但大多數(shù)患者并不適用，主要原因是缺乏合適的供體［3-4］。因此，尋找治療CML的新方法成為醫(yī)學(xué)工作者面臨的新課題。

反義核酸技術(shù)是近年發(fā)展起來的一項新技術(shù)。反義寡核苷酸是一段與靶基因的某段序列互補的天然存在或人工合成的核苷酸序列，可以通過堿基配對與細胞內(nèi)核苷酸特異性結(jié)合形成雜交分子，從而在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上調(diào)節(jié)靶基因的表達，具有合成方便、序列設(shè)計簡單、容易修飾、選擇性高和親和力強等優(yōu)點，絕大多數(shù)DNA由2條堿基序列互補的單鏈組成，生物信息以核苷酸不同順序編碼在DNA鏈上，基因組形成單順反子結(jié)構(gòu)，在DNA雙鏈上被轉(zhuǎn)錄為RNA的稱為正義鏈，其對應(yīng)的是反義鏈，精心設(shè)計一段與正義鏈互補，一般由7～40個核苷酸組成的反義鏈，將會阻斷基因轉(zhuǎn)錄，將含有反義序列的載體導(dǎo)入細胞內(nèi)，可干擾特定基因的表達［5-6］。本實驗利用這一原理，在基因位點、前體mRNA、mRNA和蛋白水平上，通過干擾特定基因功能來限制細胞增殖、分化和凋亡，取得了很好的實驗效果。因此，反義核酸技術(shù)未來可能會成為一個新的治療CML的新方向。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

K562細胞系購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院細胞庫，DMEM培養(yǎng)基購自美國Gibco公司，胎牛血清購自美國Invitrogen公司，RPMI-1640培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司，DNA-Ladder試劑盒和瓊脂糖購自生工生物工程(上海)股份有限公司，PCR儀購自美國BioRad公司，JEM-4000EX透射電子顯微鏡和紫外光分光光度計購自日本島津公司，流式細胞儀購自北京卓川電子科技有限公司，兔抗人LC3-Ⅱ抗體購自美國GeneTex公司，辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗購自美國Pierce公司，陽離子脂質(zhì)體購自美國Gibco公司。bcrabl反義寡核苷酸包括：5’-AAGCGAGUUCAA AAGCCCUUCAGCGGCCAGUA-3’［采用針對bcr-abl融合基因mRNA翻譯起始點的反義寡核苷酸，選擇bcr-abl融合基因mRNA融合區(qū)域前19個寡核苷酸為作用靶點，委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成］，5’-AATTAAAAAATTCGT CTCAAGTTTTCGGGTCTCTTGAATTCCCGAAAA CTTGAGACGGGC-3’[無義寡核苷酸序列，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成]，上述寡聚物均為全硫代修飾。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)

將K562細胞株用含10%的胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 U/mL鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基，置于37 ℃、CO2體積分數(shù)為5%、飽和濕度的條件下培養(yǎng)，1～2 d換液1次，每隔2～3 d按1∶4傳代1次，收集對數(shù)期生長的細胞。

1.2.2 陽離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染K562細胞

分別將濃度為1 0、1 5、2 0、2 5和30 μmol/mL的有義和無義寡核苷酸與5～30 μL脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑混合于2 mL的無血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中，各接種2×107個細胞，培養(yǎng)過夜，充分轉(zhuǎn)染后加入胎牛血清，調(diào)整終濃度至10%，繼續(xù)培養(yǎng)24～48 h后進行相關(guān)指標(biāo)檢測。

1.2.3 采用Hoechst33342染色法觀察K562細胞凋亡形態(tài)

取對數(shù)生長期細胞，以1×106個細胞/孔，每孔體積3 mL，接種于6孔板，分別用10、15、20、25和30 μmol/mL的bcr-abl反義寡核苷酸培養(yǎng)，并設(shè)空白對照組，48 h后加入Hoechst33342，使其終濃度為10 mg/mL，培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)溫育30 min后收集細胞，避光，PBS洗滌后以4%甲醛固定，調(diào)整細胞濃度為2× 108個/L，將細胞懸液滴于載玻片，加蓋蓋玻片，稍干后在紫外熒光顯微鏡下觀察，正?；罴毎w積較大、形態(tài)完整、染色均一、藍色熒光相對較弱，凋亡細胞體積變小、核固縮、核裂解、形狀不規(guī)則、熒光強度增強，每個樣品計數(shù)200個細胞，計算凋亡細胞百分比。

1.2.4 采用蛋白[質(zhì)]印跡法(Western blot)檢測自噬相關(guān)蛋白的表達

取對數(shù)生長期細胞，培養(yǎng)2 4 h后，448×g離心收集細胞，加入細胞裂解液，冰水浴1 h，離心后收集上清液，考馬斯亮藍法測定各組細胞質(zhì)總蛋白，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳處理后，濕轉(zhuǎn)至醋酸纖維素薄膜，以BSA封閉2～3 h，然后加入1∶200稀釋的兔抗人LC3-Ⅱ，4 ℃溫育過夜，以pH為7.6的PBS緩沖液洗滌4～6次，每次5 min，然后加入1∶200稀釋的HRP標(biāo)記二抗于37 ℃放置2 h，DAB顯色試劑盒顯色，拍照記錄，以β-actin為內(nèi)參，采用凝膠成像系統(tǒng)測定各條帶積分光密度值。

1.2.5 采用流式細胞術(shù)(flow cytometry，F(xiàn)CM)檢測細胞周期

取對數(shù)生長期的細胞，以1×106個/mL接種于6孔板，實驗組加入濃度為20、25和30 μmol/mL的寡核苷酸復(fù)合物，對照組加入等體積的0.9%的NaCl溶液，24 h后終止培養(yǎng)，收集細胞，用75%的冷乙醇(用PBS配制)4 ℃固定過夜，PBS洗滌4～5次后，112×g離心10 min，加入400 μL Annexin-FITC(5 μg/mL)，于4 ℃避光染色30 min，然后再加500 μL的PI (4 μg/mL)工作液，混勻，室溫放置10 min，采用FCM分析DNA及細胞周期的變化。

1.2.6 通過DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測K562細胞凋亡

收集藥物處理24 h后的各濃度組細胞，加細胞裂解液(10 mmol/L Tris-HCl，10 mmo/L EDTA，10 mmol/L NaCl，0.5% SDS，0.5 mg/mL的蛋白酶K)消化細胞，用飽和酚抽提后，加2.5倍體積的無水乙醇沉淀DNA，TE緩沖液溶解DNA，行1.5%瓊脂糖凝膠電泳。

1.2.7 使用JEM-4000EX透射電子顯微鏡觀察K562細胞形態(tài)

以bcr-abl反義寡核苷酸3個不同濃度(10、20和30 μmol/mL)作用于K562細胞48 h后，分別制備成超薄切片，在JEM-4000EX透射電子顯微鏡下觀察細胞超細微結(jié)構(gòu)及凋亡小體。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 15.0統(tǒng)計軟件進行分析，統(tǒng)計學(xué)推斷采用單因素方差分析，實驗數(shù)據(jù)經(jīng)方差齊性分析及正態(tài)性檢驗結(jié)果顯示，實驗數(shù)據(jù)方差齊且符合正態(tài)性檢驗，所有數(shù)據(jù)均用方差分析統(tǒng)計，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 K562細胞凋亡的形態(tài)學(xué)變化情況

不同濃度的bcr-abl反義寡核苷酸作用K562細胞后在紫外熒光顯微鏡下觀察其形態(tài)學(xué)改變，對照組細胞形態(tài)大小基本一致，細胞呈圓形、光亮，而經(jīng)30 μmol/mL的bcr-abl反義寡核苷酸干預(yù)48 h后細胞總數(shù)明顯減少，細胞大小形態(tài)不一，體積皺縮縮小，細胞質(zhì)濃縮致密，隨著反義寡核苷酸濃度的增加，凝集染色熒光強度增強(圖1、2)。

2.2 自噬相關(guān)蛋白的表達情況

LC3-Ⅱ蛋白是目前發(fā)現(xiàn)的唯一定位在自噬體和自噬體溶酶體膜上的蛋白質(zhì)，被認為是比較特異的自噬診斷指標(biāo)。當(dāng)細胞發(fā)生自噬時，LC3-Ⅰ經(jīng)泛素加工修飾過程，形成LC3-Ⅱ，其含量和自噬泡的數(shù)量成正比。Western blot檢測結(jié)果顯示，作用48 h后，bcr-abl反義寡核苷酸各濃度組的K562細胞LC3-Ⅱ蛋白均出現(xiàn)不同程度的表達，出現(xiàn)了LC3-Ⅱ蛋白陽性表達，并且隨著藥物濃度的增高，蛋白條帶逐漸增加和增粗(圖3)。

2.3 K562細胞周期動力學(xué)檢測結(jié)果

FCM檢測結(jié)果顯示，不同濃度的bcr-abl反義寡核苷酸作用于K562細胞后，K562細胞周期分布發(fā)生了明顯變化，隨著藥物濃度的增加，G0/G1期細胞比例逐漸增加，S期細胞明顯減少，G2/M期細胞增多，并且各藥物組G0/G1期和S期細胞與對照組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05，表1)。提示bcr-abl反義寡核苷酸通過阻滯K562細胞G0/G1期，從而抑制細胞的生長增殖。

圖1 不同濃度bcr-abl反義寡核苷酸復(fù)合物對K562細胞生長的影響Fig. 1 The effect of different concentrations of bcr-abl antisense oligonucleotides on K562 cells

圖2 不同濃度bcr-abl反義寡核苷酸復(fù)合物對K562細胞凋亡促進作用Fig. 2 The effect of different concentrations of bcr-abl antisense oligonucleotides on the apoptosis of K562 cells

2.4 DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測的K562細胞凋亡情況

DNA瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，不同濃度的bcr-abl反義寡核苷酸作用于K562細胞48 h后，10和30 μmol/mL濃度組可以明顯的看到以180～200 bp堿基對整倍數(shù)出現(xiàn)明暗間隔的DNA梯狀條帶，而對照組無此現(xiàn)象，呈單一條帶，說明K562細胞形態(tài)完整，提示在實驗濃度范圍內(nèi)，CML的K562細胞發(fā)生細胞凋亡(圖4)。

表1 流式細胞術(shù)檢測不同濃度的bcr-abl反義寡核苷酸對K562細胞周期的影響Tab. 1 The influence of different concentrations of bcr-abl antisense oligonucleotides on the cell cycle of K562 cells by FCM

圖3 Western blot檢測自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ蛋白表達Fig. 3 The analysis of LC3-Ⅱ protein expression by Western blot method

2.5 K562細胞形態(tài)學(xué)觀察

正常細胞在JEM-4000EX透射電子顯微鏡下呈圓形或橢圓形，常染色質(zhì)豐富，分布均勻，細胞核較大，呈圓形或長桿型，細胞膜完整，細胞質(zhì)內(nèi)細胞器結(jié)構(gòu)清楚，而bcr-abl反義寡核苷酸低濃度組(10 μmol/mL)的細胞體積縮小，細胞膜完整，但細胞質(zhì)變少，細胞器結(jié)構(gòu)不清楚，細胞核內(nèi)染色質(zhì)開始分散并凝聚成簇，有些染色質(zhì)已經(jīng)出現(xiàn)邊聚等早期凋亡現(xiàn)象，隨著藥物濃度的增加(20和30 μmol/mL)和作用時間的延長，細胞膜出現(xiàn)破裂，細胞器結(jié)構(gòu)不清楚或邊界不完整，染色質(zhì)凝聚、邊集現(xiàn)象更突出，凋亡細胞增多，凋亡特征更明顯，并可見典型的新月型凋亡小體(圖5)。

圖4 各組K562細胞的DNA瓊脂糖凝膠電泳圖Fig. 4 The DNA agarose gel electrophoresis of K562 cells

圖5 K562細胞JEM-4000EX透射電子顯微鏡圖Fig. 5 The JEM-4000EX electron microscopy of K562 cells

3 討 論

目前關(guān)于CML的治療臨床上大多采用傳統(tǒng)的姑息治療和近年來發(fā)展起來的分子靶向治療、干細胞移植及放化療措施［7-8］。傳統(tǒng)的姑息治療主要以馬利蘭和羥基脲等為基礎(chǔ)的治療藥物，可誘導(dǎo)血液學(xué)緩解，但是其控制細胞遺傳學(xué)的作用極其有限。近年來，隨著腫瘤分子生物學(xué)的研究進展，腫瘤藥物的治療逐漸向開發(fā)新的、特定的針對腫瘤細胞分子生物學(xué)等方面傾斜，伊馬替尼、尼洛替尼等藥物是新開發(fā)的抗腫瘤藥物，臨床上治療效果十分顯著，但長期應(yīng)用會有不少患者出現(xiàn)耐受性。CML是一種發(fā)生在造血干細胞上以粒細胞慢性增殖為主要特征的惡性克隆性疾病，其特點是產(chǎn)生大量不成熟的白細胞，這些細胞在骨髓內(nèi)聚集，抑制骨髓的造血功能，并且能通過血液在全身擴散，導(dǎo)致患者出現(xiàn)貧血、容易出血、感染及器官浸潤等癥狀。長期以來，該病一直成為困擾醫(yī)學(xué)工作者的一個難題［9-10］。因此，探討有效預(yù)防和治療CML的新策略，是目前CML研究的關(guān)鍵課題。

當(dāng)前國內(nèi)、外大量研究證實［11-12］，從95%的CML患者骨髓和外周血細胞中都可以找到ph染色體，即特征性的染色體異位t(9;22)、(q34;q11)及融合基因bcr-abl，融合基因表達bcr-abl融合蛋白，該蛋白能激活酪氨酸激酶的活性，和CML的發(fā)病密切相關(guān)，本研究以脂質(zhì)體為載體，用bcr-abl反義寡核苷酸體外轉(zhuǎn)染人CML的K562細胞，取得了很好的實驗效果，Hoechst33342染色結(jié)果顯示，30 μmol/mL反義核酸作用48 h后，可明顯促進CML的K562細胞凋亡，Western blot檢測結(jié)果顯示，LC3-Ⅱ蛋白表達呈現(xiàn)陽性，并且隨著反義核酸濃度的增加，蛋白條帶逐漸增加，其蛋白含量差異和對照組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。FCM檢測結(jié)果顯示，bcr-abl反義寡核苷酸組能使K562細胞阻滯在G0/G1期。DNA瓊脂糖凝膠電泳顯示，在實驗濃度范圍內(nèi)，CML的K562細胞發(fā)生細胞凋亡。但反義核酸技術(shù)作為一項新技術(shù)仍有很多不足之處，主要表現(xiàn)在基因?qū)胂到y(tǒng)技術(shù)、基因表達的可控性和更多的好的治療基因3個方面。另外，大量反義寡核苷酸的制備、體內(nèi)代謝和不良反應(yīng)等也需要臨床醫(yī)學(xué)工作者的進一步研究［13］。

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The apoptosis induction on K562 cells by the CML bcr-abl gene antisense oligonucleotides

PING Juan1, ZHAO Na1, WANG Baoquan1, SHEN Zhihui2, YIN Mingxing2, PANG Xiaobin3, CHEN Chuanbo1(1.The Huaihe Clinical College of Henan University, Kaifeng Henan 475001, China; 2.Department of Hamatology, the Cancer Hospital Affliated to Zhengzhou University, Zhengzhou Henan 450009, China; 3.The Chemical Biology Laboratory, College of Pharmacy, Henan University, Kaifeng Henan 475004, China)

CHEN Chuanbo E-mail: chenchuanbo@henan.edu.cn

Background and purpose:As the development of the completion of the human genome project (HGP), the research focus is turning to the gene function research. At present, the domestic experimental research on the apoptosis of K562 cells induced by antisense olignonucleotides is rare. This study was aimed to investigate the effect of human chronic myelogenou leukemia (CML) bcr-abl fusion gene antisense oligonucletides on autophagy and apoptosis of CMLK562 cells in vitro.Methods:By liposome as the carrier, K562 cells were transfected with the bcr-abl gene antisense olignonucleotides. Hoechst staining method was used to observe the apoptosis inducing effect of differentconcentrations of oligonucleotides, the expressions of LC3-Ⅱ, autophagy-related protein, were determined by the Western blot method, the cell cycles were determined by fow cytometry (FCM), and JEM-4000EX electron microscope technology was used to detect the apoptosis morphological changes. The apoptosis was detected by DNA agarose gel electrophoresis.Results:Hoechst staining results showed that the bcr-abl gene antisense oligonucletides signifcantly promoted the apoptosis of K562 cells in a certain concentration dependent manner. Western blot showed that the expression level of LC3-Ⅱ was obviously higher in bcr-abl gene antisense oligonucletides transfected group than the control group, showing a promoting effect on cell autophagy. FCM test results showed that bcr-abl gene antisense oligonucleotides transfected K562 cells showed obvious cell cycle arrest, visible obvious apoptosis morphology under the electron microscope, and DNA Ladder showed obvious apoptosis fragments.Conclusion:The bcr-abl gene antisense olignonucleotides can signifcantly induce the cell apoptosis of K562. This study provides a new method for CML therapy.

Chronic myelogenou leukemia; Bcr-abl gene; Antisense oligonucleotides; K562 cells; Apoptosis induction

10.3969/j.issn.1007-3969.2015.03.002

R733.7

A

1007-3639(2015)03-0167-06

2014-09-10

2014-11-17）

河南開封市科技局項目(1403018)；國家自然科學(xué)基金項目(81273652)。

陳傳波 E-mail:chenchuanbo@henan.edu.cn